Usando tomografia de tórax para visualizar a estrutura tridimensional e Função da Usina Vasculatura

Summary

Alta resolução de raios-X de tomografia computadorizada (PCA), é um não-destrutiva técnica de imagiologia de diagnóstico que pode ser utilizada para estudar a estrutura e função dos vasos de plantas em 3D. Demonstramos como TCAR facilita a exploração de redes de xilema através de uma ampla variedade de tecidos e espécies vegetais.

Abstract

Alta resolução de raios-X a tomografia computadorizada (TCAR) é uma técnica não-destrutiva de diagnóstico por imagem com sub-mícron capacidade de resolução que está sendo usada agora para avaliar a estrutura e função da rede de xilema de plantas em três dimensões (3D) (por exemplo, Brodersen et al . 2010; 2011; 2012a incumbentes, b). TCAR de imagem baseia-se nos mesmos princípios que o médico CT sistemas, mas uma alta intensidade de sincrotrão resultados de raios-x de fonte na maior resolução espacial e diminuição do tempo de aquisição de imagem. Aqui, demonstramos detalhadamente como síncrotron baseado TCAR (realizado na Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, EUA) em combinação com Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, EUA), está a ser utilizada para explorar xilema de plantas em excisadas do tecido e plantas vivas. Esta ferramenta permite que os usuários de imagem nova para ir além tradicional luz estática, 2D ou microscopia eletrônica e amostras de estudo usando virtuais cortes seriados em qualquer plano. Um número infinito de fatias em qualquer orientação cum ser feitas com a mesma amostra, uma característica que é fisicamente impossível utilizar métodos de microscopia tradicionais.

Os resultados demonstram que a TCAR pode ser aplicada a ambos herbáceas e espécies de plantas lenhosas, e uma variedade de órgãos da planta (folhas, ou seja, pecíolos, caules, troncos, raízes). Os números apresentados aqui ajudar a demonstrar tanto uma gama de anatomia representante plantas vasculares e do tipo de detalhe extraído de conjuntos de dados de TCAR, incluindo verificações de costa sequóias (Sequoia sempervirens), nogueira (Juglans spp.), Carvalho (Quercus spp.), E de bordo ( Acer spp.) mudas de árvores para girassóis (Helianthus annuus), videiras (Vitis spp.) e samambaias (Pteridium aquilinum e Woodwardia fimbriata). Amostras excisadas e secas de espécies lenhosas são mais fáceis de digitalizar e normalmente produzem as melhores imagens. No entanto, as melhorias recentes (varreduras ou seja, mais rápidos e de estabilização da amostra), tornou possvel para usar esta técnica de visualização de tecidos verdes (por exemplo, pecíolos) e em plantas vivas. Na ocasião algum encolhimento de tecidos vegetais verdes hidratados fará imagens para borrão e métodos para evitar estes problemas são descritos. Esses avanços recentes com TCAR fornecer promissores novos insights sobre a função vascular da planta.

Introduction

Água é transportada das raízes para as folhas em um tecido vascular chamado xilema - uma rede de condutas interligados, fibras e vivos, células metabolicamente ativas. Função de transporte do xilema da planta deve ser mantida para fornecer nutrientes e água para as folhas para a fotossíntese, o crescimento e, finalmente, de sobrevivência. O transporte da água nas condutas do xilema pode ser interrompida quando a rede do xilema é comprometida por organismos patogénicos. Em resposta a tais plantas infecções muitas vezes produzir geles, gomas, e Tilos como um meio para isolar propagação agente patogénico (por exemplo, McElrone et al 2008; 2010). O estresse hídrico também pode limitar o transporte de água no xilema. Como as plantas perdem água durante a seca prolongada, a tensão na seiva do xilema. Água sob tensão é metastãvel (isto é, a um certo limiar, a tensão torna-se suficientemente grande para cavitar colunas de água contida nas condutas de xilema). Após a cavitação ocorre, uma bolha de gás (embolismo) podem formar e encher as conduit, o movimento da água de forma eficaz de bloqueio (Tyree e Sperry, 1989), um fenômeno análogo a doença de descompressão (ou seja, "as curvas") em mergulhadores de águas profundas.

Apesar da importância do transporte de água no xilema para a função planta ideal, como demonstrado por um vasto corpo de literatura histórica e contemporânea sobre este tema (Tyree & Zimmermann, 2002;. Holbrook et al, 2005), ainda há aspectos de redes do xilema que permanecem indescritível . Vários grupos de pesquisa começaram recentemente a utilização de alta resolução de raios-x computadorizada micro-tomografia (TCAR) para avaliar pequenos detalhes de anatomia da madeira e tecido vascular (por exemplo, Mayo et al; 2010, 2008; Mannes et al 2010;. Brodersen et al 2010. , 2011, 2012a incumbentes, b; Maeda e Miyake, 2009; Estepe et al 2004).. TCAR é uma técnica não destrutiva utilizada para visualizar as características do interior de objectos sólidos e de obter a informação digital sobre os seus 3-D propriedades estruturais. TCARdifere da medicina convencional CAT-scanning na sua capacidade de resolver os detalhes tão pequenos quanto um micron de tamanho, até mesmo para os objectos de alta densidade. Os recentes avanços na tecnologia síncrotron TCAR melhorou a resolução da imagem e relação sinal-ruído suficiente para que as redes de recursos de navios e conexões intervasculares pode ser visualizado, atribuído coordenadas 3D, e exportado para simulações hidráulicas. Brodersen et al. (2011) recentemente avançou esta técnica combinando reconstruções 3D gerados pelo síncrotron TCAR com um modelo de Fortran que extrai automaticamente os dados da rede xilema em resolução muito maior do que jamais foi possível com os tradicionais métodos anatômicos (ou seja, o corte de série com um micrótomo e captura de imagem com microscopia de luz, por exemplo, Zimmermann 1971). Este trabalho também tem sido utilizada para optimizar modelos hidráulicos do sistema de xilema e identificadas características únicas de transporte (isto é, o fluxo reverso em algumas vessels durante os períodos de pico de transpiração) (Lee et al., em revisão).

Síncrotron TCAR pode agora ser usado para visualizar a funcionalidade do xilema, a susceptibilidade a cavitação, e capacidade de plantas para reparar condutas embolização. A falta de restabelecer o fluxo nas condutas embolizados reduz a capacidade hidráulica, a fotossíntese limites, e resulta na morte das plantas, em casos extremos (McDowell et al. 2008). As plantas podem lidar com êmbolos pelo desvio da água em torno de bloqueios através de poços de ligação adjacentes condutas funcionais, e pela crescente xilema novo para substituir perdeu capacidade hidráulica. Algumas plantas possuem a capacidade de reparar quebras nas colunas de água, mas os detalhes deste processo no xilema sob tensão não está claro por décadas. Brodersen et al. (2010) recentemente visualizado e quantificado o processo de recarga em videiras ao vivo usando TCAR. Vaso sucesso reenchimento foi dependente influxo de água a partir de células vivas em torno do xylin condutas, onde gotículas de água individuais expandiram ao longo do tempo, vasos cheios, e forçaram a dissolução do gás aprisionado. A capacidade de plantas diferentes para reparar vasos do xilema comprometidos e os mecanismos que controlam esses reparos estão sendo investigadas.

Descrição da instalação de ALS Beamline 8.3.2

Nosso trabalho até à data tem sido realizados sobre o Hard X-ray Micro-Tomografia Beamline 8.3.2 na fonte avançada Luz no Laboratório Nacional Lawrence Berkeley (Berkeley CA EUA). As amostras de plantas são colocadas em um revestida de chumbo hutch localizado a 20 m da fonte de raios-x, gerado por um ímã curva 6 Tesla supercondutor dipolo dentro da Fonte de Luz Avançado elétron operacional anel de armazenamento com uma energia crítica de 11,5 KeV. Um esquema da estação final é mostrado na Figura 1. As radiografias entrar na gaiola com um tamanho de feixe de 40x ~ 4,6 mm e passar através da amostra que está montado sobre uma fase de rotação motorizada. Otransmitido raios X colidem com um cintilador de cristal (dois materiais vulgarmente utilizados são LuAG CdWO ou ₄₎ que convertem raios X em luz visível que é transmitido através de lentes sobre um CCD de recolha de imagem. A câmara de cintilação, e ópticas estão contidos dentro de uma caixa de luz que é apertado sobre trilhos que permite que a distância de amostra-para-cintilador para ser optimizado para imagens de contraste de fase.

Todas as amostras são montadas na etapa 10 cm de diâmetro de rotação que por sua vez está montada sobre as fases de tradução horizontal e vertical para o posicionamento da amostra. Uma amostra de planta viva, com o sistema de raiz montado em um suporte de panela planta construída personalizado e a folhagem contido em um tubo de acrílico, pode ser visto na Figura 2. Tempos de exposição típica pode variar 0,1-1 seg usando 10-18 keV, e durações de varredura irá variar 5-40 min, dependendo das configurações optimizadas para uma determinada amostra. Para amostras de altura (típica das redes de xilema de plantas), varreduras de dados podem serladrilhado, repetindo a medição com a amostra em alturas diferentes, o que é controlado automaticamente, permitindo seamless secções seriadas ao longo de uma altura de amostragem máxima de ~ 10 cm. Largura máxima da amostra, quando imagiologia em 4,5 uM resolução é ~ 1 cm em relação às amostras que são quase perfeitas na orientação vertical. Geração de dados e processamento é concluído usando o protocolo listados abaixo. Por causa da diferença de atenuação de raios X entre o ar e a água, o contraste da imagem pode ser obtida excelente nas plantas sem a utilização de soluções de contraste típico de sistemas médicos de TC. O lúmen do vaso cheio de ar é facilmente distinguível do tecido circundante cheia de água em plantas hidratadas.

Protocol

Protocolo detalhes descritos abaixo foram escritas especificamente para o trabalho no Fonte de Luz Avançado 8.3.2 linha de luz. Adaptações podem ser necessárias para o trabalho em outras instalações síncrotron. Segurança e formação adequada de radiação é necessário para o uso desses recursos.

1. Preparação de amostras das plantas vivas

1. Crescer plantas em vasos de ~ 10 cm de diâmetro, e de assegurar que a haste principal (ou uma porção da planta a ser digitalizada) é centrado possível e orientado verticalmente no vaso. As dimensões físicas do instrumento TCAR hutch nos limites Fonte de Luz Avançada plantas vivas para ~ 1 m de altura. Como conseqüência, a imagem de plantas vivas é melhor realizado em mudas / mudas cultivadas em vasos pequenos. Dependendo da experiência, diferentes tipos de solo pode ser usado para controlar o teor de humidade do solo (por exemplo, em experiências de seca), e para algumas plantas com rebentos flexíveis (por exemplo, vinha) rebentos mais longos podem ser cuidadosamente tucked no tubo acrílico descrito abaixo (ver Figuras 1 e 2).
2. Monte os vasos de plantas vivas em um pegador de panela feito por encomenda de alumínio rígido. A altura da placa superior pode ser ajustada para acomodar uma gama de alturas de panela. O topo da placa é desenhado para se alinhar com a parte superior da superfície do solo, e as plantas sobressai a partir do centro da placa de duas partes. A finalidade do titular pote é garantir o caule é mantido firmemente no lugar para minimizar a vibração ou movimento da amostra. Minimizando movimento amostra durante uma varredura é essencial.
3. Uma vez montado no suporte, medir o potencial da água ou do caule de transpiração da folha usando uma câmara de pressão Scholander estilo ou um clip-on porómetro de folha, respectivamente, para determinar o estado fisiológico da planta antes da digitalização.
4. Coloque um cilindro de acrílico de paredes finas sobre a planta e em cima do titular da fábrica de alumínio e fixá-lo no lugar com argila putty para estabilizar aamostra (Figura 2). Qualquer vibração ou movimento da folha superior será transmitido para baixo a haste e fazer com que o tecido da planta na zona digitalizada a mover-se, em última análise conduzindo à distorção da imagem. O cilindro é usado para conter folhagem das plantas e evitar que folhas de plantas de raspar outros equipamentos no hutch que resultariam em vibrações durante uma varredura. Plástico adicional, toalhas de papel, e a fita deve ser usada para reduzir ainda mais a vibração e movimento de partes de plantas (ver problemas associados com o movimento da amostra na Figura 4). Para reduzir a absorção de raios-x (que pode diminuir a qualidade da imagem a um dado tempo de exposição), o cilindro contendo deveria ter como paredes finas quanto possível, mantendo ao mesmo tempo uma rigidez suficiente para realizar a sua função.
5. Fixe o suporte de potenciômetro personalizado para o palco rolamento de ar e bloquear (parafuso) no lugar entre a fonte de raios-x e do sensor de imagem e equipamentos de câmera. Positina haste vertical possível e um centro de base de bucha magnética para assegurar que a amostra permanece no campo de visão durante a rotação.

2. Preparação de amostras para Fresh de Tecidos Vegetais, excisadas

1. O material vegetal fresco, geralmente caules ou pecíolos, podem ser verificados após a remoção imediata de uma planta viva. Se a intenção do experimento é visualizar a totalidade da água no xilema de rede, no interior dos vasos deve ser evacuado e substituído por ar. Para fazer isso, montar a amostra, numa câmara de pressão e estilo Scholander empurrar o ar comprimido ou de azoto através da amostra, a baixa pressão (<MPa 0,05) durante cerca de 5 min. Espécies diferem no tempo necessário para evacuar a rede de vasos. Se a intenção é a de avaliar a extensão da formação de embolia no tecido de planta fresco e, em seguida amostras de consumo a partir da planta utilizando uma lâmina de barbear fresco e fazer os cortes debaixo de água.
2. Enrole a amostra em uma camada de Parafilm para prdessecação evento durante a varredura.
3. Montar a amostra num mandril, fixado a uma placa de metal, que é aparafusado na fase rolamento de ar. Centro e orientar a amostra verticalmente como descrito acima, para assegurar que a amostra permanece no campo de visão.

3. Preparação de Amostras para tecidos Woody secos

1. Para a visualização de tecido óptima da amostra e o contraste da imagem, é necessário para desidratar lentamente a amostra de tecido inteiro lenhosa. Cortar amostras para cerca de 6 cm de comprimento. Seleccionar amostras que são tão direito quanto possível na zona de verificação alvo e têm um diâmetro de ≤ 1 cm.
2. Colocar a amostra de tecido lenhoso em um forno de secagem a baixa temperatura para secar a amostra lentamente, sem causar qualquer quebra ou separação do tecido. Este processo é susceptível de variar entre espécies e tecidos. Para caules lenhosos, 12 h em estufa a 40 ° C é geralmente suficiente para proporcionar um contraste excelente sem causar cha significativasnges na estrutura física da haste (ver problemas com secagem rápida demonstrada na Figura 3).
3. Em algumas situações, é desejável dispor de um marcador fiduciária dentro da amostra de tal modo que a dissecção posterior e visualização com microscopia electrónica de varrimento podem ser orientados para pontos específicos no TCAR. Para fazer isso, apor um metal ou esferas de vidro ou um fio para o exterior da haste com Parafilm. Um outro método é a utilização de uma resina de silicone (por exemplo, RTV-141, Bluestar Silicones, East Brunswick, NJ), que pode ser injectado numa conduta de xilema único (ver exemplos no Brodersen et al 2010). Uma vez endurecida, a resina de silicone é claramente visível na amostra e facilmente distinguidos dos outros recipientes cheios de ar. Utilizar este marcador para localizar precisamente as regiões específicas da amostra.
4. Montar a amostra no centro do mandril e tal como descrito acima.

4. Preparação de Amostras para Folha Tissue de duas dimensões (2D) radiogramas

1. Para visualizar o conteúdo dos vasos em folhas, quase em tempo real, as folhas podem ser digitalizados para produzir um radiograma 2D, semelhante a uma radiografia dentária. Monte a folha entre duas folhas de plástico acrílico fino, e fixar as bordas com clipes. Em seguida, coloque a amostra montada para um sistema de titular do cargo e posição da breadboard óptica ao lado do sistema de imagem e raio-x fonte.

5. Digitalização da amostra no Hutch 8.3.2

1. Decida a ampliação que irá funcionar melhor para sua aplicação. ALS Beamline 8.3.2 tem a capacidade de digitalizar com lentes com ampliações de 2x, 5x e 10x. Isto resulta em tamanhos de imagem de pixel de 4,5, 2,25 e 0,9 uM, respectivamente. Dependendo da ampliação, a amostra deve ser de tamanho adequado, tal como o campo de visão diminui com o aumento da ampliação. Veja os detalhes para escolha da câmera e lente e os parâmetros de imagem resultante da Tabela 1.

	PCO.4000 (4008x2672)		PCO.Edge (2560x2160) (Optique Pedro)
Lente	pixel (mm)	campo de visão (mm)	pixel (mm)	campo de visão (mm)
10x	0,9	3,6	0.65 (0.69)	1.7 (1.7)
5x (4x)	1,8	7,2	1.3 (1.72)	3.3 (4.4)
2x	4,5	18	3.25 (3.44)	8.3 (8.8)
1x	9	36	6.5 (-)	16,6 (-)

Tabela 1. Detalhes sobre disponívelcâmeras e lentes em ALS 8.3.2.

2. Definir a energia de raios-x a 15 keV. Isto tem sido mostrado para fornecer o contraste da imagem excelente para a maioria das aplicações de plantas (ver Brodersen et al. 2010, 2011, 2012a incumbentes, b). Os tempos de exposição são geralmente dependentes da espessura e da densidade da amostra (e, portanto, a ampliação usada) variam entre 100 e 1000 mseg. Tempos de exposição mais longos (desde pixels do detector não são saturados) conduzem geralmente a uma maior relação sinal-ruído, mas à custa de tempos de leitura mais elevados.
3. Escolha um incremento angular que é apropriado para sua aplicação. As amostras são rodadas 180 ° durante uma varredura, e o número de imagens captadas durante a rotação pode ter um impacto significativo sobre o tamanho do conjunto de dados de comprimento do intervalo de pesquisa, e a qualidade da imagem final, mas não são geralmente decrescentes em qualidade. As digitalizações são realizados em incrementos de 0,25 °, produzindo 721 imagens por digitalização. Diminuindo os increment para 0,125 resultados ° em melhores imagens para visualizar detalhes, mas os rendimentos 1.440 imagens e, assim, um conjunto de dados muito maior (para uma região típica de interesse, isto significa ~ 10-30 GB de dados contra 5 GB). No entanto, a relação sinal-ruído é frequentemente melhorado e vale tanto o tempo de verificação e aumentou o tamanho dos dados. Talos secos que não são susceptíveis de deformar / encolher durante a digitalização pode ser submetido a intervalos mais longos (incremento angular menor) sem detrimento. Quando as plantas de imagem ao vivo, onde os processos biológicos (por exemplo, reparação embolia) ocorrem em escalas de tempo curtas, optando por intervalos mais curtos de varredura é preferível limitar os potenciais efeitos nocivos da radiação de raios X sobre este tecido, embora isso tem um potencial perda de qualidade da imagem. Intervalos mais curtos de digitalização pode ser conseguida usando a configuração de Tomografia contínua, durante o qual a amostra continuamente gira enquanto as imagens são capturadas.
4. Para cada exame, "campo claro" e "escuro" de campo imagens devem ser corrected. As imagens de campo brilhante são imagens sem a amostra no feixe. Estes são muitas vezes colhidos antes e após a verificação da amostra pela horizontalmente traduzindo a amostra. Campos escuros são recolhidos por fechar o x-ray-obturador esta medida a quantidade de sinal a câmera mostra sem raios-x.

6. Informática

1. Transfira os "brutos" imagens 2D. TIF, que foram exportados a partir do computador de aquisição de um servidor de arquivos para um computador, processamento de dados. Se o computador tem RAM suficiente, os dados podem ser copiados de um assim chamado "Drive RAM" (uma porção da RAM aparece como uma unidade de disco rígido do computador). Deste modo, o software não tem de aceder a uma unidade de fiação rígido, o que é relativamente lenta em comparação com uma unidade de estado sólido ou memória flash. Este passo reduz significativamente a quantidade de tempo necessário para processar conjuntos de dados.
2. As imagens devem ser convertidos para uma escala de percentagem de transmissão. Beamline 8.3.2 tem um ba personalizadockground normalização plug-in que pode ser baixado e usado com o software disponível gratuitamente pacotes ImageJ ou Fiji ( http://fiji.sc/ ). Subtrai as contagens escuras a partir das imagens e normaliza as imagens de amostra pelos campos brilhantes para produzir imagens que mostram a transmissão por cento. Carregar imagens normalizadas para o pacote de software Octopus ( http://www.inct.be/en/software/octopus ) e "reconstruir" o conjunto de dados 3D a partir do 2D-primas. TIF arquivos usando as etapas de processamento designadas (Normalize imagens, remoção Anel , criação Sinogram, reconstrução feixe Paralela). Esse processo gera uma série de. TIF transversal (transversal) imagens compostas de "voxels" (elementos de pixels volumétricos), cada um com valores de x, y, z de coordenadas e intensidade representando o raio-x coeficiente de absorção linear.

7. Visualização

1. Visualize a pilha de imagens em um de uma variedade de pacotes de software. Freeware (eg Drishti, http://anusf.anu.edu.au/Vizlab/drishti/index.shtml ) pode ser usado para visualizar ou volumes individuais ou pilhas de imagens (por exemplo ImageJ ou FIJI). Outros pacotes de software pode ser utilizado para a visualização 3D. Nosso grupo de pesquisa utiliza o pacote de software Avizo ( http://www.vsg3d.com/avizo/overview ), mas outros, como Amira ( http://www.amira.com/ ) e VGStudioMax ( http://www. volumegraphics.com / ) também são comumente usados.
2. Carregar conjuntos de dados na memória do sistema e apresentar a amostra em virtual transversal, longitudinal ou orientações radiais fatia. Por causa dos atributos do conjunto de dados 3D, fatias virtuais através do sample pode ser rodado em qualquer plano para alinhar com as regiões de interesse, uma melhoria significativa sobre microscopia de luz tradicional de série (ver Filmes 1-3 para exemplos detalhados).
3. Para visualizar a amostra, se necessário, em 3D, o "segmento" da amostra, utilizando a variedade de rotinas semi-automáticas e manuais em Avizo para separar lúmens dos vasos ou outras estruturas do tecido circundante. Segmentação refere-se a definição de fronteiras entre os objetos de interesse, separando assim ou segmentá-los em regiões separadas. Volumes de renderização em 3D é feita pelo software de visualização. Um método para fazer isto é o volume de processamento directo, em que cada ponto de um volume é assumido que emitem e absorvem luz, a quantidade e cor de emissão e absorção pode ser definida usando um "mapa de cores", e a projecção resultante numa dada direcção é apresentada no ecrã. Alternativamente, uma estrutura de arame ou superfície de malha 3D que representa os limites segmentados é construído para mostrar um modelo 3D de tele estrutura de interesse. A malha 3D é composto de elementos poligonais, e o número total de elementos que afectam tanto a fidelidade de reprodução estrutura e o tamanho do ficheiro de dados associada (isto é, elementos mais leva a uma maior fidelidade, mas de tamanho maior de arquivo). Uma variedade de módulos de processamento de imagem estão disponíveis dentro do software de visualização para controlar as saídas de volume de processamento, bem como o controle de brilho da imagem, contraste, transparência, redução de ruído, etc

8. Quantificação

1. Uma vez que a segmentação tem sido realizado, é possível quantificar as estruturas alvo de plantas ou de alterações funcionais do volume, o comprimento, a largura, a presença ou ausência de água, ar, etc Por exemplo, Brodersen et al. (2010) utilizado para quantificar software Avizo a variação do volume de gotículas de água no interior dos vasos de videira de recarga. As plantas foram verificados a cada 30 minutos ao longo de quatro a oito horas a criação de um momento-lapse seqüência de navio de reabastecimento. Cada varrimento foi reconstruído e carregado em Avizo, onde gotículas individuais foram medidos ao longo do tempo como o seu volume aumentado.

Representative Results

Scans Synchotron TCAR foram implementados com sucesso numa vasta variedade de tecidos e espécies vegetais utilizando beamline 8.3.2 (Figura 5), e proporcionaram novas perspectivas sobre a estrutura e função do xilema de plantas de resolução sem precedentes em 3D. As capacidades de visualização e exploração fornecidos pelas reconstruções 3D (como ilustrado nas Figuras 6-8, e 1-3) Filmes permitir a determinação precisa da localização e orientação das estruturas com as redes de xilema em ambas as amostras excisadas e em plantas vivas.

Em algumas situações, a movimentação da amostra ou vibrações indesejadas têm causado distorções nas imagens finais, tornando os exames inúteis (por exemplo, Figura 4), ​​mas as melhorias para diminuir o tempo de varredura (com tomografia contínua) ter minimizado os efeitos prejudiciais de tais perdas de dados, pois muitos Mais scans podem agora ser concluída no beamtime limitadaatribuído a cada utilizador. Estes tempos mais curtos de varredura também permitem medidas repetidas de uma repetição, ao longo do tempo para capturar a dinâmica de processos como a propagação de embolia e de reparação.

Figura 1. Esquema de amostra de digitalização e procedimento de instalação dentro da gaiola de ALS beamline 8.3.2 superior esquerdo:. O feixe da fonte de raios-X (1) é projectado através da amostra (2) que está ligado à mesa de ar, com um porta-brocas que gira durante a digitalização. Os raios-X que passam através da amostra de colidir com um cintilador de cristal (4) que fluoresce luz visível que é redireccionado por um espelho (5) através das lentes (6) para uma câmara CCD (7), que capta uma imagem digital. Os "brutos" 2D imagens de raios X (superior direito de imagem-exemplo é uma amostra caule da planta rotação de 180 ° durante uma varredura completa em um incremento de 0,25 °, resultando em 720 imagens 2D) são transformados e resultar em uma pilha de imagens transversais (canto inferior direito) que são utilizados para as reconstruções 3D. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 2. Imagem tirada dentro da gaiola da linha de luz ALS 8.3.2 mostrando uma videira, ao vivo em vasos preparados para a digitalização. A videira está contida em um tubo de acrílico (1). O feixe de raios X entra na gaiola para a esquerda (2), em seguida, passa através da amostra (por exemplo, o caule da videira) (3) e, em seguida, entra em uma caixa de luz que contém a câmara estanque, cintilador e óptica (não mostrada na caixa esta imagem ).

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Figura 3. Exemplo de craqueamento de amostra (denotados com as setas brancas) quando uma raiz lenhosa (visto aqui) foi submetido a secagem durante demasiado tempo e / ou a uma temperatura demasiado elevada. Para evitar estes danos e para manter a integridade estrutural e a fidelidade à estrutura do tecido em desidratação requer alguns testes in vivo antes do tempo. Barra de escala = 1 mm.

Figura 4. Distorções de imagem, como visto aqui para inúmeras pequenas raízes lenhosas, resultado do movimento da amostra durante o período de verificação. Neste exemplo, uma coluna de raízes lenhosas pequenos (cada ponto brilhante branco é uma raiz única) ainda ligados a uma planta viva foram digitalizados e, aparentemente, movidos durante o exame e resultadoed na imagem distorcida. Para superar esta questão amostras precisam ser firmemente estabilizada com estofamento adicional dentro do tubo de acrílico ao redor da planta.

Figura 5. Exemplos de imagens transversais de troncos de madeira digitalizados para (A) Coastal Redwood e (B) Oak Valley. Barras de escala brancos são 1,0 milímetros em ambas as imagens. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 6. Reconstrução 3D de uma haste gerado a partir de uma TCAR de uma vida muda de sequóia costeira mostrado com um longitudinal e trplano ansverse exposta. maioria do xilema visto nesta imagem está cheio de água, enquanto que existem condutas de ar cheios no centro da haste (seta preta), que resultou de cavitação durante uma experiência de seca. Essa verificação também capturou condutas no ato de cavitada-ver os intermediários cinza condutas escala formando um anel de cerca de meio caminho entre o centro e exterior da haste (seta branca).

Figura 7. Imagem de Brodersen et al, 2012 -. Plant Cell, & Environment demonstrando a reconstrução em 3D do arranjo xilema vascular em duas espécies de samambaias digitalizados em dois pontos diferentes sobre a fronde feixes vasculares são visíveis em azul, enquanto o tecido circundante é em verde. Em Pteridium aquilinum, o Pão vascularDLEs são optimizados para elevada condutividade com muitas ligações, tanto na ponta de frondes (a) e uma base (c). Em contraste, Woodwardia fimbriata tem um arranjo muito mais conservadora vascular com poucas ligações entre os feixes em ponta de frondes (b) e base (d). Os arranjos vasculares decorrentes levar a altas taxas fotossintéticas em P. aquilinum, mas à custa de baixa tolerância à seca, enquanto W. fimbriata é otimizado para a longevidade frond com menores taxas fotossintéticas, mas maior tolerância à seca. Frond ponta e as secções de base são de cerca de 4 mm e 9 mm de diâmetro, respectivamente.

Figura 8. Reconstrução 3D gerada a partir de uma TCAR de noz xilema do caule. Esta imagem ajuda a demonstrar a capacidade de explorar o tecido na resolução incrível como estes são dois condutos do xilema adjacentes que compartilham uma parede interligados por muito do seu comprimento. Aqui, o processamento de imagem e suavização de ter removido a parede do vaso fino compartilhada na prestação de volume. Localização exacta e a espessura da parede do vaso é retido nos dados de imagem em bruto, podendo ser utilizado para estudar a conectividade. Cada um dos vasos comunicantes nesta imagem tem ~ 40 um de diâmetro.

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Discussion

Synchotron TCAR fornece biólogos de plantas com uma ferramenta poderosa, não-destrutivo para explorar o funcionamento interno dos vasos de plantas com detalhes incríveis. Esta tecnologia tem sido usada recentemente para identificar previamente não descritas estruturas anatômicas do xilema videira que diferencialmente alteram a conectividade de rede do xilema em espécie de videira diversas (Brodersen et al 2012b, no prelo.) - Essa conectividade pode alterar drasticamente a capacidade de patógenos vasculares e êmbolos para espalhar destrutiva nas redes do xilema. Os exames primeiro sucesso de plantas vivas também revelaram detalhes escala fina de processos dinâmicos como propagação embolia e reparação (Brodersen et al 2010; et al 2012 McElrone New Phytologist 196 (3) :661-665), e ajudou a implicar o papel de um tipo específico de célula viva na reparação embolia-a resolução espacial fornecida pela TCAR em ALS 8.3.2 tornou isso possível. Detalhes sobre esses processos e outros aspects de redes xilema ainda permanece indeterminada-TCAR provavelmente irá desempenhar um papel fundamental na descoberta contínua especialmente quando combinado com outras técnicas de alta resolução (por exemplo, Microdissecção Captura Laser), e pode ser combinado com outros recentemente desenvolvidas técnicas de visualização avançadas para uso em biologia vegetal ( por exemplo, Lee et al, 2006; Truernit et al, 2008; Jahnke et al 2009;. Iyer-Pascuzzi et al 2010).

Materials

See specifics listed above regarding equipment at the Advanced Light Source beamline 8.3.2