Utilizzando ad alta risoluzione Tomografia Computerizzata Per visualizzare la struttura tridimensionale e funzione delle piante Vasculature

Summary

Alta risoluzione x-ray tomografia computerizzata (HRCT) è una tecnica non distruttiva imaging diagnostico che può essere utilizzata per studiare la struttura e la funzione della vascolarizzazione dell'impianto in 3D. Dimostriamo come HRCT facilita l'esplorazione di reti xilematici in una vasta gamma di tessuti e specie vegetali.

Abstract

Ad alta risoluzione x-tomografia computerizzata a raggi (HRCT) è una tecnica non distruttiva di diagnostica per immagini con sub-micron capacità di risoluzione che viene ora utilizzato per valutare la struttura e la funzione della rete di impianti xilema in tre dimensioni (3D) (ad esempio, Brodersen et al . 2010; 2011; 2012A, b). HRCT immagini si basa sugli stessi principi della medicina sistemi CT, ma una ad alta intensità di sincrotrone a raggi X Fonte dei risultati a maggiore risoluzione spaziale ed è diminuito il tempo di acquisizione delle immagini. Qui, abbiamo dimostrato in dettaglio come sincrotrone a base di HRCT (eseguita presso l'Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combinazione con il software Avizo (VSG Inc., Burlington, MA, USA) viene utilizzato per esplorare xilema stabilimento di asportato tessuto e piante viventi. Questo strumento di imaging consente agli utenti di andare al di là tradizionale statica, luce 2D o microscopio elettronico e di campioni di studio virtuali utilizzando sezioni seriali in qualsiasi piano. Un numero infinito di fette in ogni c orientamentoun essere effettuata sullo stesso campione, una caratteristica che è fisicamente impossibile utilizzando metodi di microscopia tradizionali.

I risultati dimostrano che la HRCT può essere applicato sia erbacee e specie di piante legnose, e una serie di organi vegetali (foglie, cioè piccioli, steli, tronchi, radici). Le cifre qui presentate contribuire a dimostrare sia una serie di anatomia vascolare rappresentante dell'impianto e il tipo di dettaglio estratto da set di dati HRCT, comprese le scansioni per Coast Redwood (Sequoia sempervirens), noce (Juglans spp.), Quercia (Quercus spp.), E acero ( Acer spp.) alberelli di girasole (Helianthus annuus), viti (Vitis spp.), e felci (Pteridium aquilinum e Woodwardia fimbriata). Campioni asportati ed essiccati di specie legnose sono più facili da eseguire la scansione e genere permette di ottenere le immagini migliori. Tuttavia, i recenti miglioramenti (ad esempio le scansioni più rapide e la stabilizzazione del campione) hanno reso possbile utilizzare questa tecnica di visualizzazione su tessuti verdi (es piccioli) e in piante viventi. In occasione alcuni restringimento di idrati tessuti vegetali verdi farà sì che le immagini di sfocatura e metodi per evitare questi problemi sono descritti. Questi progressi recenti con HRCT fornire promettenti nuove intuizioni funzione di piante vascolari.

Introduction

L'acqua viene trasportata dalle radici alle foglie delle piante in un tessuto vascolare chiamato xilema - una rete di condotti interconnessi, fibre, e di vita, le cellule metabolicamente attive. Funzione di trasporto delle xilema impianto deve essere mantenuto per la fornitura di acqua e sostanze nutritive alle foglie per la fotosintesi, la crescita, e in ultima analisi, la sopravvivenza. Trasporto dell'acqua in condotti xilematici può essere interrotta quando la rete xilema è compromessa da germi patogeni. In risposta a tali impianti infezioni spesso producono gel, gomme e tyloses come mezzo per isolare diffusione patogeno (ad es McElrone et al 2008, 2010). Stress idrico può anche limitare il trasporto dell'acqua in xilema. Come piante perdono acqua durante la siccità prolungata, tensione cresce nei linfa xilema. L'acqua in tensione è metastabile (cioè ad una certa soglia la tensione diventa grande abbastanza per cavitazione colonne d'acqua contenuti in condotti xilematici). Dopo la cavitazione, una bolla di gas (embolia) può formare e riempire le condUIT, movimento dell'acqua bloccando (Tyree e Sperry 1989), un fenomeno analogo a malattia da decompressione (vale a dire "le curve") in palombari.

Nonostante l'importanza del trasporto xilematico acqua per la funzione ottimale delle piante, come dimostrato da un vasto corpo di letteratura storica e contemporanea su questo argomento (Tyree e Zimmermann, 2002. Holbrook et al, 2005), ci sono ancora aspetti di reti xilema che rimangono sfuggente . Diversi gruppi di ricerca hanno recentemente iniziato a utilizzare ad alta risoluzione x computerizzata a raggi micro-tomografia (HRCT) per valutare i dettagli più fini di anatomia in legno e tessuto vascolare (ad es Mayo et al, 2010, 2008; Mannes et al 2010;. Brodersen et al 2010. , 2011, 2012A, b; Maeda e Miyake, 2009; Steppe et al 2004).. HRCT è una tecnica non distruttiva utilizzata per visualizzare caratteristiche nell'interno di corpi solidi e di ottenere informazioni digitali sulle loro proprietà strutturali 3-D. HRTCdifferisce dal medico convenzionale CAT-scansione nella sua capacità di risolvere dettagli piccoli come un micron, anche per oggetti ad alta densità. I recenti progressi nella tecnologia di sincrotrone HRCT hanno migliorato la risoluzione delle immagini e rapporto segnale-rumore in modo sufficiente che le reti dei vasi di piante e le connessioni intervessel possono essere visualizzati, assegnato coordinate 3D, ed esportati per le simulazioni del modello idraulico. Brodersen et al. (2011) ha recentemente avanzato questa tecnica combinando ricostruzioni 3D generati dal sincrotrone HRCT con un modello Fortran che estrae automaticamente i dati dalla rete xilema con una risoluzione molto più alta di quanto sia mai stato possibile con i tradizionali metodi anatomici (di serie cioè sezionamento con un microtomo e l'acquisizione di immagini al microscopio ottico, ad esempio, Zimmermann 1971). Questo lavoro è stato utilizzato anche per ottimizzare i modelli idraulici del sistema xilema e identificato caratteristiche uniche di trasporto (flusso inverso cioè in qualche vessels durante i periodi di picco di traspirazione) (Lee et al., in revisione).

Sincrotrone HRCT può ora essere utilizzato per visualizzare le funzionalità dello xilema, suscettibilità alla cavitazione, e la capacità di alcune piante di assicurare la riparazione condotti embolizzato. La mancata ristabilire il flusso in condotti embolizzato riduce la capacità idraulica, la fotosintesi limiti, e si traduce in morte della pianta in casi estremi (McDowell et al. 2008). Le piante possono far fronte a emboli, deviando l'acqua intorno a blocchi tramite box di collegamento adiacenti condotti funzionali, e da una crescente xilema nuovo per sostituire perso capacità idraulica. Alcune piante hanno la capacità di riparare le fratture delle colonne d'acqua, ma i dettagli di questo processo in xilema sotto tensione sono rimasti poco chiari per decenni. Brodersen et al. (2010) ha recentemente visualizzato e quantificato il processo di ricarica in viti in diretta tramite HRCT. Nave di successo ricarica era dipendente afflusso acqua da cellule viventi che circonda la xylem condotti, in cui le gocce d'acqua individuali ampliato nel corso del tempo, i vasi pieni, e costretto la dissoluzione del gas intrappolato. La capacità di diverse piante per riparare vasi xilematici compromessi e dei meccanismi di controllo tali riparazioni sono attualmente in fase di studio.

Descrizione del meccanismo SLA beamline 8.3.2

Il nostro lavoro fino ad oggi è stato condotto sul Hard X-ray Micro-Tomografia Beamline 8.3.2 alla Fonte Advanced Light a Lawrence Berkeley National Lab (Berkeley CA USA). Campioni vegetali sono posti in un piombo rivestito hutch situato a 20 metri dalla sorgente di raggi X, generato da un magnete 6 curva Tesla superconduttore dipolo all'interno Advanced Light Source operativo anello di accumulazione di elettroni con una energia critica di 11,5 KeV. Un schematico della stazione finale è mostrato in Figura 1. I raggi X inserire il hutch con un fascio di 40x ~ 4.6 mm e passare attraverso il campione che è montato su un palco rotante motorizzata. Iltrasmesso i raggi X incidono su un cristallo scintillatore (due materiali comunemente usati sono Luag CdWO o ₄₎ che convertono i raggi X in luce visibile che viene trasmesso attraverso le lenti su un ccd per la raccolta di immagini. L', scintillatore telecamera e ottica sono contenuti in una scatola a tenuta di luce che è su rotaie che permettono il campione a distanza scintillatore essere ottimizzato per l'imaging a contrasto di fase.

Tutti i campioni sono montati sul stadio 10 cm di diametro rotante che a sua volta è montato su fasi di traslazione orizzontale e verticale per il posizionamento del campione. Un campione pianta vivente, con l'apparato radicale montato su un supporto personalizzato impianto costruito pentola e il fogliame contenuto in un tubo acrilico, può essere visto in Figura 2. Tempi di esposizione tipiche possono variare dal 0,1-1 sec utilizzando 10-18 KeV, e durate di scansione varierà 5-40 min a seconda delle impostazioni ottimizzate per un particolare campione. Per i campioni alti (tipico delle reti xilematico delle piante), le scansioni di dati possono esserepiastrelle ripetendo la misurazione con il campione a diverse altezze, che è controllata automaticamente, consentendo seamless sezioni seriali lungo un'altezza di campionamento massimo di circa 10 cm. Campione Larghezza massima quando l'imaging a 4.5 micron risoluzione è ~ 1 cm per i campioni che sono quasi perfetti in orientamento verticale. Generazione ed elaborazione dei dati viene completata usando il protocollo di seguito elencati. A causa della differenza di x-ray attenuazione tra aria e acqua, contrasto immagine eccellente può essere ottenuto in piante senza l'uso di soluzioni di contrasto tipici dei sistemi medicali CT. L'aria piena di lume del vaso è facilmente distinguibile dal circostante pieno d'acqua dei tessuti nelle piante idratati.

Protocol

Dettagli del protocollo descritti di seguito sono stati scritti appositamente per il lavoro presso l'Advanced Light Source 8.3.2 linea di luce. , Potranno essere necessarie per il lavoro in altri impianti di sincrotrone. Messa in sicurezza e la formazione radiazione è necessario per l'utilizzo di queste strutture.

1. Preparazione del campione per le piante vive

1. Coltivare piante in vaso ~ cm 10 di diametro, e assicurarsi che il fusto principale (o la parte della pianta da sottoporre a scansione), è il più centrato possibile e orientato verticalmente nel piatto. Le dimensioni fisiche dello strumento HRCT hutch ai limiti avanzate sorgenti luminose piante vive a ~ 1 m di altezza. Come conseguenza, l'imaging di piante vive è meglio eseguita su plantule / alberelli coltivate in piccoli vasi. Seconda dell'esperimento, diversi tipi di terreno può essere utilizzato per controllare il contenuto di umidità del suolo (ad esempio in esperimenti siccità), e per alcune piante con germogli flessibili (ad esempio viti) di scatti può essere accuratamente tucked nel tubo acrilico descritto di seguito (vedi figure 1 e 2).
2. Montare le piante vive in vaso in una misura porta rigida pentola di alluminio. L'altezza piastra superiore può essere regolata per accogliere una gamma di altezze vaso. La parte superiore della piastra è progettata per allinearsi con la parte superiore della superficie del suolo, e le piante sporge dal centro della piastra di due parti. Lo scopo della presina è garantire il fusto della pianta è tenuta saldamente in posizione per minimizzare la vibrazione o movimento del campione. Minimizzare il movimento del campione durante una scansione è essenziale.
3. Una volta montato nel supporto, misurare il potenziale dell'acqua stelo o traspirazione fogliare utilizzando una camera di stile Scholander pressione o una clip-on porometro foglia, rispettivamente, per determinare lo stato fisiologico della pianta prima della scansione.
4. Posizionare un sottile cilindro acrilico murate della pianta e sulla parte superiore del contenitore impianto di alluminio e fissarlo con argilla mastice per stabilizzare lacampione (Figura 2). Qualsiasi vibrazione o movimento del fogliame superiore sarà trasmessa lungo lo stelo e causare il tessuto vegetale all'interno dell'area scansionata per spostare, in ultima analisi, con conseguente distorsione dell'immagine. Il cilindro viene utilizzata per contenere fogliame impianto e prevenire le foglie delle piante da sfregamento contro altri pezzi di attrezzature nel hutch che si tradurrebbe in vibrazioni durante una scansione. Involucro di plastica addizionale, asciugamani di carta, e il nastro dovrebbe essere utilizzato per ridurre ulteriormente le vibrazioni e il movimento di parti di impianto (vedi problemi associati ai trasferimenti di esempio in figura 4). Per ridurre il suo assorbimento di raggi X (che può diminuire la qualità dell'immagine in un determinato tempo di esposizione), il cilindro contenente dovrebbe avere pareti sottili possibile mantenendo rigidità sufficiente a svolgere la sua funzione.
5. Fissare il supporto personalizzato piatto per la fase di cuscinetto d'aria e bloccarlo (vite) in posizione tra la sorgente di raggi X e il sensore di immagine della fotocamera e le attrezzature. Positisullo stelo più verticale possibile e centro sulla base magnetica mandrino per garantire il campione rimane nel campo visivo durante la rotazione.

2. Preparazione del campione per Fresh, tessuti vegetali Tagliato

1. Materiale vegetale fresco, in genere fusti o piccioli, possono essere acquisiti dopo la rimozione immediata da una pianta dal vivo. Se l'intento dell'esperimento è di visualizzare la totalità del xilema rete, dell'acqua nei recipienti deve essere evacuato e sostituito con aria. Per fare questo, montare il campione in una camera di pressione stile Scholander e spingere l'aria compressa o azoto attraverso il campione a bassa pressione (<0,05 MPa) per circa 5 min. Specie si differenziano per il tempo necessario per evacuare la rete di vasi. Se l'intento è quello di valutare il grado di formazione di embolia nel tessuto pianta fresca, quindi i campioni soggetti ad accisa dalla pianta fresca con una lama di rasoio e fare i tagli sotto l'acqua.
2. Avvolgere il campione in uno strato di Parafilm per pressiccazione evento durante la scansione.
3. Montare il campione in un drill-mandrino fissato ad una piastra metallica che viene avvitato nella fase cuscinetto d'aria. Centro e orientare il campione verticalmente come descritto sopra per garantire il campione rimane nel campo visivo.

3. Preparazione del campione per tessuti legnosi secchi

1. Per la visualizzazione ottimale campione e contrasto dell'immagine, è necessario disidratare lentamente l'intero campione di tessuto legnoso. Tagliare i campioni di circa 6 cm di lunghezza. Selezionare i campioni che sono più diritta possibile nella regione di scansione mirata e hanno un diametro di ≤ 1 cm.
2. Posizionare il campione di tessuto legnoso in un forno di essiccazione a bassa temperatura per asciugare lentamente il campione senza causare l'incrinatura o scissione del tessuto. Questo processo è probabilmente diverso da specie a specie e tessuti. Per fusti legnosi, 12 ore in un forno a 40 ° C è in genere sufficiente a fornire un eccellente contrasto senza causare significative chaNGES nella struttura fisica dello stelo (vedi problemi con la rapida essiccazione dimostrato nella Figura 3).
3. In alcune situazioni, è desiderabile avere un marcatore fiduciario all'interno del campione in modo che la dissezione e la successiva visualizzazione con microscopia elettronica a scansione può essere orientato a punti specifici dell'immagine HRCT. Per fare questo, apporre un metallo o di perle di vetro o filo verso l'esterno dello stelo utilizzando Parafilm. Un altro metodo è quello di utilizzare una resina siliconica (ad es RTV-141, Bluestar Silicones, East Brunswick, NJ) che può essere iniettato in un condotto unico xilema (vedi esempi in Brodersen et al 2010). Una volta indurita, la resina siliconica è chiaramente visibile nel campione e facilmente distinti dagli altri vasi pieni d'aria. Utilizzare questo indicatore per localizzare con precisione regioni specifiche del campione.
4. Montare il campione nel mandrino e centro come descritto sopra.

4. Preparazione del campione per la Leaf Tissue per due dimensionali (2D) radiogrammi

1. Per visualizzare il contenuto dei vasi in foglie in near-real-time, le foglie possono essere acquisiti per produrre un radiogramma 2D, simile ad un dentale x-ray. Montare la foglia tra due fogli di plastica acrilica sottile, e fissare i bordi con le clip. Quindi fissare il campione montato su un sistema di post-porta e la posizione della basetta ottico vicino al sistema di imaging e la sorgente di raggi x.

5. La scansione del campione in 8.3.2 Hutch

1. Decidere l'ingrandimento che funziona meglio per la vostra applicazione. SLA beamline 8.3.2 è in grado di eseguire la scansione con obiettivi con ingrandimenti di 2x, 5x e 10x. Questi risultati nei formati immagine pixel di 4.5, 2.25 e 0.9 micron, rispettivamente. Determinati ingrandimenti, il campione deve essere di dimensioni adeguate, come il campo visivo diminuisce con ingrandimento maggiore. Vedi i dettagli per la scelta di fotocamera e l'obiettivo ed i parametri di immagine risultanti in Tabella 1.

	PCO.4000 (4008x2672)		PCO.Edge (2560x2160) (Optique Peter)
Lente	pixel (um)	campo visivo (mm)	pixel (um)	campo visivo (mm)
10x	0,9	3,6	0.65 (0.69)	1.7 (1.7)
5x (4x)	1,8	7,2	1.3 (1.72)	3.3 (4.4)
2x	4,5	18	3.25 (3.44)	8.3 (8.8)
1x	9	36	6,5 (-)	16,6 (-)

Dettagli Tabella 1. Riguardanti disponibilemacchine fotografiche e lenti a SLA 8.3.2.

2. Impostare l'energia dei raggi X a 15 keV. Ciò è stato dimostrato di fornire un eccellente contrasto immagine maggior parte delle applicazioni di piante (vedi Brodersen et al. 2010, 2011, 2012A, b). Tempi di esposizione sono generalmente dipende dallo spessore e densità del campione (e quindi l'ingrandimento utilizzato) comprese tra 100 e 1000 msec. Tempi di esposizione più lunghi (fino a pixel del rivelatore non sono saturi) comportano generalmente elevato rapporto segnale-rumore, ma a costo di maggiori tempi di scansione.
3. Scegliere un incremento angolare che è appropriato per l'applicazione. I campioni vengono ruotate di 180 ° durante una scansione, e il numero di immagini scattate durante la rotazione può avere un impatto significativo sulla dimensione della lunghezza dataset, dell'intervallo di scansione, e la qualità dell'immagine finale, ma ci sono generalmente rendimenti decrescenti in qualità. Le scansioni tipiche sono effettuate a incrementi di 0,25 °, ottenendo 721 immagini per scansione. Diminuendo le incret a 0,125 ° risultati in immagini migliori per la visualizzazione dettagli fini, ma i rendimenti 1440 immagini e quindi una serie di dati molto più grande (per una regione tipica di interesse, questo significa ~ 10-30 GB di dati contro 5 GB). Tuttavia, il rapporto segnale-rumore è spesso migliorata e vale sia aumentato il tempo di scansione e la dimensione dei dati. Steli secchi che probabilmente non deformare / ridursi durante una scansione può essere sottoposto a intervalli più lunghi (incremento angolare più piccolo) senza danno. Quando le piante di imaging dal vivo, in cui i processi biologici (ad esempio embolia riparazione) si svolgono su scale temporali brevi, optando per gli intervalli di scansione più brevi è preferibile limitare i potenziali effetti dannosi dei raggi X su questo tessuto, anche se questo ha un potenziale perdita di qualità delle immagini. Brevi intervalli di scansione può essere realizzato utilizzando l'impostazione continua Tomografia durante il quale il campione ruota continuamente mentre le immagini vengono catturate.
4. Per ogni scansione, "campo chiaro" e "scuro" sul campo le immagini devono essere corrected. Immagini in campo chiaro sono immagini senza il campione nel fascio. Questi sono spesso raccolti prima e dopo la scansione del campione traslare orizzontalmente il campione. Campi scuri sono raccolti chiudendo la x-ray-questo otturatore misurata la quantità di segnale della telecamera mostra senza raggi x.

6. Elaborazione dei dati

1. Trasferire i "grezzi" 2D. Immagini TIF, che sono stati esportati dal computer di acquisizione di un file server, un computer di elaborazione dati. Se il computer dispone di memoria RAM sufficiente, i dati possono essere copiati in una cosiddetta "Drive RAM" (una parte della RAM viene visualizzata come un disco rigido del computer). In questo modo il software non ha bisogno di accedere ad un hard disk spinning, che è relativamente lento rispetto ad un disco a stato solido o memoria flash. Questo passo riduce significativamente la quantità di tempo richiesto per elaborare insiemi di dati.
2. Le immagini devono essere convertiti in una scala percentuale di trasmissione. 8.3.2 linea di luce ha un ba personalizzatonormalizzazione SFONDO plug-in che può essere scaricato e utilizzato con il software liberamente disponibili pacchetti o ImageJ Fiji ( http://fiji.sc/ ). Si sottrae i conteggi scure delle immagini e normalizza le immagini di esempio da parte dei campi luminosi per produrre immagini che mostrano la trasmissione per cento. Caricare le immagini normalizzate nel pacchetto software Octopus ( http://www.inct.be/en/software/octopus ) e "ricostruire" il set di dati 3D da 2D prime. TIF file utilizzando la procedura di trasformazione designati (Normalize immagini, rimozione Anello , la creazione di sinogramma, la ricostruzione del fascio parallela). Questo processo produce poi una serie di. TIF trasversale (sezione trasversale) immagini composte da "voxel" (elementi volumetrici pixel), ciascuno con un valori x, y, z di coordinate e l'intensità che rappresentano la radiografia coefficiente lineare di assorbimento.

7. Visualizzazione

1. Visualizze la pila di immagini in uno di una varietà di pacchetti software. Freeware (ad esempio Drishti, http://anusf.anu.edu.au/Vizlab/drishti/index.shtml ) può essere utilizzato per visualizzare volumi o singoli o pile di immagini (ad esempio ImageJ o FIJI). Altri pacchetti software può essere utilizzato per la visualizzazione 3D. Il nostro gruppo di ricerca utilizza il pacchetto software Avizo ( http://www.vsg3d.com/avizo/overview ), ma altri, come Amira ( http://www.amira.com/ ) e VGStudioMax ( http://www. volumegraphics.com / ) sono comunemente usati.
2. Caricare set di dati nella memoria di sistema e visualizzare il campione virtuale trasversale, longitudinale, o orientamenti fetta radiali. A causa delle caratteristiche 3D delle fette, set di dati virtuali attraverso il campe può essere ruotato in qualsiasi piano per allineare con le regioni di interesse, un miglioramento significativo rispetto alla tradizionale microscopia ottica di serie (vedi Film 1-3 per esempi dettagliati).
3. Per visualizzare il campione in base alle esigenze in 3D, "segmento" l'esempio utilizzando il varietà di routine semi-automatici e manuali in Avizo per separare lumi dei vasi o altre strutture dal tessuto circostante. Segmentazione si riferisce a definire i confini tra gli oggetti di interesse, in modo da separare o segmentazione li in regioni distinte. Volumi di rendering in 3D viene eseguita dal software di visualizzazione. Un metodo per farlo è volume rendering diretto, dove si assume ogni punto in un volume di emettere e assorbire la luce, la quantità e il colore di emissione e di assorbimento può essere definita utilizzando un "colormap", e la proiezione risultante in una data direzione è visualizzato sullo schermo. In alternativa, un wireframe o una superficie mesh 3D che rappresenta i limiti segmentati è costruito per mostrare un modello 3D di tha struttura di interesse. La rete 3D è composto da elementi poligonali, e il numero totale di elementi influenzerà sia la fedeltà di riproduzione struttura e la dimensione del file di dati associato (cioè più elementi conduce ad alta fedeltà, ma file di dimensioni maggiori). Una varietà di moduli di elaborazione delle immagini sono disponibili all'interno del software di visualizzazione per il controllo delle uscite del volume di rendering, così come il controllo di luminosità, il contrasto, la trasparenza, la riduzione del rumore, ecc

8. Quantificazione

1. Dopo la segmentazione è stato realizzato, è possibile quantificare le strutture bersaglio vegetali o modifiche funzionali in volume, lunghezza, larghezza, presenza o assenza di acqua, aria, ecc Per esempio, Brodersen et al (2010). Avizo software utilizzato per quantificare la variazione di volume di gocce d'acqua all'interno dei vasi vite ricarica. Le piante sono state scansione ogni 30 min oltre 4-8 ore a creare un tempo-lapse sequenza della nave rifornimento. Ogni scansione è stato ricostruito e caricati in Avizo, dove sono stati misurati singole goccioline nel corso del tempo come il loro volume è aumentato.

Representative Results

Synchotron HRCT sono state attuate con successo su una vasta gamma di tessuti vegetali e delle specie che utilizzano 8.3.2 linea di luce (Figura 5), e hanno fornito nuove informazioni sulla struttura e la funzione di xilema stabilimento di una risoluzione senza precedenti in 3D. Le funzionalità di visualizzazione e l'esplorazione forniti dalle ricostruzioni 3D (come illustrato nelle figure 6-8, e 1-3) Film consentire determinazione precisa della posizione e l'orientamento delle strutture con le reti xilema su entrambi i campioni escissi e nelle piante viventi.

In alcune situazioni, il movimento del campione o vibrazioni indesiderate hanno causato distorsioni nelle immagini finali, rendendo le scansioni inutilizzabili (ad esempio Figura 4), ​​ma i miglioramenti per ridurre il tempo di scansione con la tomografia (continua) hanno ridotto al minimo gli effetti negativi di tali perdite di dati, perché molti scansioni più può ora essere completata nel tempo macchina limitataassegnato a ciascun utente. I tempi di scansione più brevi anche consentire di adottare misure ripetute di una singola replica nel tempo per catturare le dinamiche dei processi di diffusione, come l'embolia e la riparazione.

Figura 1. Schema di campione scansione procedura e configurazione all'interno della hutch a ALS beamline 8.3.2 In alto a sinistra:. Il fascio di raggi X di origine (1) viene proiettato attraverso il campione (2) che è collegato al tavolo aria con un mandrino che ruota durante la scansione. I raggi X che attraversano il campione incidere su un cristallo scintillatore (4), che reagisce in luce visibile che viene reindirizzata da uno specchio (5) attraverso lenti (6) ad una telecamera ccd (7) che cattura un'immagine digitale. Le "prime" 2D immagini a raggi X (in alto a destra dell'immagine esempio è un esempio fusto della pianta ruotata di 180 ° nel corso di una scansione completa con un incremento di 0,25 ° risultanti in 720 immagini 2D) si trasformano e il risultato in una pila di immagini trasversali (in basso a destra), che vengono utilizzati per le ricostruzioni in 3D. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 2. Immagine scattata all'interno della hutch della linea di luce ALS 8.3.2 mostra un live, vite in vaso preparato per la scansione. La vite è contenuto in un tubo acrilico (1). Il fascio di raggi X entra hutch verso sinistra (2), quindi passa attraverso il campione (ad esempio, il gambo della vite) (3) e poi entra in una scatola a tenuta di luce contenente la telecamera, scintillatore e ottica (casella non mostrato in questa immagine ).

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Figura 3. Esempio di fessurazione campione (indicato con le frecce bianche) quando una radice legnosa (vedere qui) è stato sottoposto ad essiccazione per troppo tempo e / o ad una temperatura troppo alta. Per evitare questo danno e di mantenere l'integrità strutturale e la fedeltà alla struttura del tessuto in disidratazione vivo richiede alcuni test prima del tempo. Barra di scala = 1 mm.

Figura 4. Le distorsioni della fotografia, come si vede qui per numerose piccole radici legnose, per effetto del movimento del campione durante il periodo di scansione. In questo esempio una colonna di radici legnose di piccole dimensioni (ogni punto bianco luminoso è una sola radice) ancora attaccati ad una pianta viva sono stati scansionati e apparentemente spostato durante la scansione e il risultatoed a immagine distorta. Per superare questo campioni questione devono essere saldamente stabilizzato con imbottitura supplementare all'interno del tubo acrilico circostante l'impianto.

Figura 5. Esempi di immagini trasversali di fusti legnosi a scansione (A) Coastal Redwood e (B) Valley Oak. Barre di scala bianca sono 1.0 mm in entrambe le immagini. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 6. Ricostruzione 3D di uno stelo generato da una scansione HRCT di un alberello vita costiera sequoia mostrato con una longitudinale e trpiano ansverse esposta. La maggior parte del xilema visto in questa immagine è pieno d'acqua, mentre ci sono riempiti di aria condotti al centro dello stelo (freccia nera) che il risultato di cavitazione durante un esperimento siccità. Questa scansione anche catturato condotti in atto di cavitazione, vedere i condotti intermedi della scala di grigi che formano un anello circa a metà strada tra il centro e lo stelo esterno (freccia bianca).

Figura 7. Immagine da Brodersen et al 2012 -. Piante, cellule e l'ambiente dimostrando la ricostruzione 3D della disposizione xilema vascolare in due specie di felci scansione in due punti diversi della fronda fasci vascolari sono visibili in blu, mentre il tessuto circostante è in verde. In Pteridium aquilinum, il panino vascolaredles sono ottimizzati per alta conducibilità con molti collegamenti sia la punta fogliare (a) e di base (c). In contrasto, Woodwardia fimbriata ha una disposizione molto più conservatore vascolare con pochi collegamenti tra fasci nella punta frond (b) e la base (d). Gli accordi risultanti vascolari portare ad alti tassi fotosintetici in P. aquilinum ma a scapito di una bassa tolleranza alla siccità, mentre W. fimbriata è ottimizzato per la longevità di fronde con tassi fotosintetici più bassi, ma più alta tolleranza alla siccità. Punta fronde e sezioni di base sono circa 4 mm e 9 mm di diametro, rispettivamente.

Figura 8. Ricostruzione 3D generato da una scansione HRCT di xilema stelo noce. Questa immagine contribuisce a dimostrare la capacità di esplorare il tessuto nella risoluzione incredibile quanto questi sono due condotti xilematici adiacenti che condividono una parete interconnesso per gran parte della loro lunghezza. Qui, l'elaborazione delle immagini e livellamento hanno rimosso la sottile parete nave condivisa nel volume rendering. Esatta posizione e spessore di questa parete del vaso viene mantenuta nei dati RAW e può essere usato per studiare connettività. Ciascuno dei vasi comunicanti in questa immagine sono ~ 40 micron di diametro.

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Discussion

Synchotron HRCT fornisce biologi vegetali con un potente, non distruttivo strumento per esplorare i meccanismi interiori della vascolarizzazione pianta in dettaglio incredibile. Questa tecnologia è stata utilizzata di recente per identificare precedentemente non descritta strutture anatomiche in modo differenziato xilema vite che alterano la connettività di rete xilema in varie specie di vite (Brodersen et al 2012b, in corso di stampa.) - Questa connettività potrebbe alterare drasticamente la capacità degli agenti patogeni vascolari ed embolia per diffondere distruttivo nelle reti xilematici. Le scansioni primi successi di piante viventi hanno anche rivelato dettagli fini scala da processi dinamici come diffusione embolia e riparazione (Brodersen et al 2010; McElrone et al 2012 Phytologist Nuova 196 (3) :661-665), e ha contribuito a coinvolgere il ruolo di uno specifico tipo di cellula vivente nella riparazione embolia-la risoluzione spaziale fornito da HRCT a ALS 8.3.2 reso possibile tutto questo. Specifiche su questi processi e altri aspects di reti xilema rimangono ancora sfuggente-HRCT probabilmente un ruolo chiave nella scoperta continua soprattutto se abbinato con altre tecniche ad alta risoluzione (ad esempio Microdissezione Laser Capture), e potrebbe essere abbinato ad altre tecniche di visualizzazione avanzata recentemente sviluppate per l'utilizzo in biologia vegetale ( ad esempio, Lee et al, 2006; Truernit et al, 2008; Jahnke et al 2009;. Iyer-Pascuzzi et al 2010).

Materials

See specifics listed above regarding equipment at the Advanced Light Source beamline 8.3.2