Utilisation à haute résolution tomodensitométrie pour visualiser la structure tridimensionnelle et la fonction des vaisseaux sanguins des végétaux
Summary
Haute résolution x-ray tomodensitométrie (TDM-HR) est une technique non destructive d'imagerie diagnostique qui peut être utilisée pour étudier la structure et la fonction des vaisseaux des plantes en 3D. Nous montrons comment HRCT facilite l'exploration des réseaux du xylème dans un large éventail de tissus et espèces végétaux.
Abstract
Haute résolution x-ray tomodensitométrie (TDM-HR) est une technique non destructive d'imagerie diagnostique avec capacité de résolution inférieure au micron qui est maintenant utilisé pour évaluer la structure et la fonction de réseau du xylème des plantes en trois dimensions (3D) (par exemple Brodersen et al . 2010; 2011; 2012a, b). HRCT imagerie est basée sur les mêmes principes que les systèmes médicaux CT, mais une forte intensité de résultats synchrotron source de rayons X à haute résolution spatiale et une diminution du temps d'acquisition d'images. Ici, nous démontrons en détail comment synchrotron à base HRCT (effectué à l'avancée Source lumineuse LBNL-Berkeley, CA, USA) en combinaison avec le logiciel Avizo (VSG Inc, Burlington, MA, USA) est utilisé pour explorer le xylème des plantes dans tissu excisé et plantes vivantes. Ce nouvel outil d'imagerie permet aux utilisateurs de se déplacer au-delà statique traditionnelle, la lumière 2D ou micrographies électroniques et des échantillons d'étude en utilisant des coupes en série virtuels dans n'importe quel plan. Un nombre infini de coupes de tous les c orientationun être effectuées sur le même échantillon, une caractéristique qui est physiquement impossible à l'aide des méthodes de microscopie traditionnels.
Les résultats démontrent que HRCT peut être appliqué à la fois les espèces herbacées et ligneuses, et une gamme des organes végétaux (feuilles, pétioles, c.-à-tiges, troncs, racines). Les chiffres présentés ici aider à démontrer à la fois une gamme d'anatomie des plantes vasculaires représentant et le type de détail extraites de bases de données, y compris les analyses HRCT de séquoia (Sequoia sempervirens), noyer (Juglans spp.), Le chêne (Quercus spp.) Et l'érable ( jeunes arbres Acer spp.) aux tournesols (Helianthus annuus), la vigne (Vitis spp.), et les fougères (Pteridium aquilinum et Woodwardia fimbriata). Échantillons excisés et séché à partir des espèces ligneuses sont plus faciles à analyser et généralement d'obtenir les meilleures images. Cependant, des améliorations récentes (c.-à-scans plus rapides et la stabilisation de l'échantillon) ont rendu possble d'utiliser cette technique de visualisation des tissus écologiques (p. ex pétioles) et en plantes vivantes. À l'occasion de rétrécissement des tissus hydratés plantes vertes fera images de flou et les méthodes pour éviter ces problèmes sont décrits. Ces avancées récentes avec HRCT offrir de nouvelles perspectives prometteuses dans la fonction vasculaire des plantes.
Introduction
L'eau est transportée des racines des plantes aux feuilles dans un tissu vasculaire appelé xylème – un réseau de conduits interconnectés, de fibres et de vie, les cellules métaboliquement actives. Fonction de transport du xylème des plantes doit être maintenue pour fournir des éléments nutritifs et de l'eau sur les feuilles pour la photosynthèse, la croissance et la survie en fin de compte. Transport de l'eau dans les conduits du xylème peut être perturbé lorsque le réseau du xylème est compromise par des organismes pathogènes. En réponse à ces plantes produisent souvent des infections des gels, des gencives et thylles comme un moyen d'isoler la propagation des agents pathogènes (par exemple McElrone et al 2008; 2010). Le stress hydrique peut également limiter le transport de l'eau dans le xylème. Comme les plantes perdent de l'eau en période de sécheresse prolongée, la tension monte dans la sève du xylème. Eau sous tension est métastable (c'est à dire à un certain seuil la tension devient suffisamment grande pour cavitation colonnes d'eau contenues dans les conduits du xylème). Après cavitation, une bulle de gaz (embolie) peuvent se former et remplir les conduit, le mouvement de l'eau bloquant (Tyree et Sperry 1989), un phénomène analogue à la maladie de décompression (c.-à-«bends») chez les plongeurs en eaux profondes.
En dépit de l'importance du transport hydrique du xylème pour la fonction optimale de l'installation tel que démontré par un vaste corpus de littérature historique et contemporain sur ce sujet (Tyree et Zimmermann, 2002;. Holbrook et al, 2005), il ya encore des aspects de réseaux xylème qui restent insaisissables . Plusieurs groupes de recherche ont récemment commencé à utiliser à haute résolution des rayons X micro-tomographie informatisée (TDM-HR) pour évaluer les moindres détails de l'anatomie du bois et des tissus vasculaires (par exemple, Mayo et al; 2010, 2008; Mannes et al 2010;. Brodersen et al 2010. , 2011, 2012a, b; Maeda et Miyake, 2009; Steppe et al 2004).. HRCT est une technique non destructive utilisée pour visualiser les caractéristiques de l'intérieur de corps solides et à obtenir des informations numériques sur les 3-D des propriétés structurelles. HRCTdiffère de classiques CAT-imagerie médicale dans sa capacité à résoudre des détails aussi petits qu'un micron, même pour des objets à haute densité. Les progrès récents dans la technologie synchrotron HRCT ont amélioré la résolution d'image et de rapport signal sur bruit suffisamment pour que les réseaux et les connexions des navires de plantes intervasculaires peuvent être visualisés, attribué des coordonnées 3D, et exportées pour des simulations de modèles hydrauliques. Brodersen et al. (2011) a récemment avancé cette technique en combinant des reconstructions 3D générés par synchrotron HRCT avec un modèle Fortran qui extrait automatiquement les données du réseau xylème à une résolution beaucoup plus élevée que ne l'était jamais possible avec les méthodes traditionnelles anatomiques (ie coupe de série avec un microtome capture d'image et en microscopie optique, par exemple, Zimmermann, 1971). Ce travail a également été utilisé pour optimiser les modèles hydrauliques du système de xylème et identifié des caractéristiques uniques de transport (flux inverse c'est à dire dans une certaine vexelles pendant les périodes de pointe de la transpiration) (Lee et al., en révision).
Synchrotron HRCT peut maintenant être utilisé pour visualiser les fonctionnalités du xylème, la sensibilité à la cavitation et la capacité d'une des plantes pour réparer les conduits embolisés. Le défaut de rétablir la circulation dans les conduits embolisés réduit la capacité hydraulique, photosynthèse limites, et entraîne la mort des plantes dans des cas extrêmes (McDowell et al. 2008). Les plantes peuvent faire face à une embolie en détournant l'eau autour des blocages via connexion fosses adjacentes conduits fonctionnels, et par la croissance du xylème pour remplacer la perte de capacité hydraulique. Certaines plantes possèdent la capacité de réparer les ruptures dans les colonnes d'eau, mais les détails de ce processus dans le xylème sous tension sont restés clair depuis des décennies. Brodersen et al. (2010) a récemment visualisés et quantifiés dans le processus de remplissage vignes en direct en utilisant HRCT. Navire succès remplissage dépend de l'apport d'eau à partir de cellules vivantes entourant le xyllui conduits, où des gouttelettes d'eau individuelles développées au fil du temps, des navires remplis, et forcé la dissolution du gaz piégé. La capacité des usines différentes pour réparer les vaisseaux du xylème compromis et les mécanismes de contrôle de ces réparations sont actuellement à l'étude.
Description de l'installation de la SLA Beamline 8.3.2
Notre travail à ce jour a été effectuée sur le Hard X-ray micro-tomographie Beamline 8.3.2 à la source de lumière avancée à Lawrence Berkeley National Lab (Berkeley CA USA). Des échantillons de plantes sont placées dans une cage plombée situé à 20 m de la source de rayons X, généré par un aimant 6 Tesla courbure dipôle supraconducteur à l'intérieur de la Source de Lumière exploitation avancée anneau d'électrons de stockage à une énergie critique de 11,5 keV. Un schéma de la station terminale est illustré à la figure 1. Les radiographies entrer dans la huche avec une taille de faisceau de 40x ~ 4,6 mm et de passer à travers l'échantillon qui est monté sur une platine motorisée en rotation. Latransmis les rayons X empiètent sur un cristal scintillateur (deux matériaux couramment utilisés sont LuAG ou CdWO 4) qui convertit les rayons X en lumière visible qui est transmise par l'intermédiaire de lentilles sur un capteur CCD de collecte d'image. L'appareil photo, et l'optique de scintillateur sont contenus dans une boîte étanche à la lumière qui est sur des rails qui permettent la distance échantillon-à-scintillateur à être optimisé pour l'imagerie à contraste de phase.
Tous les échantillons sont montés sur l'étage 10 cm de diamètre tournant à son tour est monté sur des platines de translation horizontale et verticale pour le positionnement de l'échantillon. Un échantillon de plante vivante, avec le système racinaire monté dans un support adapté usine construite pot et le feuillage contenue dans un tube acrylique, on peut le voir dans la figure 2. Temps d'exposition typiques peuvent aller de 0,1 à 1 sec utilisant 10-18 keV, et les durées de balayage iront de 5 à 40 min en fonction des paramètres optimisés pour un échantillon particulier. Pour les échantillons de grande taille (typiquement des réseaux xylème des plantes), des analyses de données peuvent êtrecarrelage en répétant la mesure de l'échantillon à des hauteurs différentes, qui est commandé automatiquement, sans soudure, en permettant des coupes en série le long d'une hauteur maximale de l'échantillon de ~ 10 cm. Largeur maximale de l'échantillon lorsque l'imagerie à 4,5 um résolution est de ~ 1 cm pour des échantillons qui sont presque parfait en position verticale. Génération et traitement des données est réalisée en utilisant le protocole ci-dessous. En raison de la différence de x-ray atténuation entre l'air et l'eau, excellent contraste d'image peut être obtenue de plantes sans l'utilisation de solutions de contraste typique des systèmes CT médicaux. La lumière du vaisseau rempli d'air se distingue aisément de la rempli d'eau entourant les tissus des plantes hydratées.
Protocol
Representative Results
Discussion
Synchotron HRCT fournit phytobiologistes avec une puissante non destructive outil pour explorer les rouages du système vasculaire des plantes en détail incroyable. Cette technologie a été utilisée récemment pour identifier auparavant non décrite structures anatomiques dans le xylème vigne qui modifient de façon différentielle la connectivité réseau du xylème chez les espèces de vigne diverses (Brodersen et al 2012b, sous presse.) – Cette connectivité peut considérablement altérer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier S Castorani, AJ Eustis, GA Gambetta, CM Manuck, Z Nasafi, et A Zedan. Ce travail a été financé par: le ministère américain de l'Agriculture-Agricultural Research Service recherche sur le système de financement actuel d'information (projet de recherche ne 5306-21220-004-00; La source de lumière avancée est prise en charge par le directeur, Bureau de la science, Bureau de la base. sciences de l'énergie, de l'US Department of Energy en vertu du contrat n ° DE-AC02-05CH11231);. NIFA et des cultures spéciales initiative de recherche de subvention à AJM.
Materials
| Material Name/Equipment | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| See specifics listed above regarding equipment at the Advanced Light Source beamline 8.3.2 |
References
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