Ved hjelp av høyoppløselig CT for å visualisere tredimensjonale struktur og funksjon Plant vasculature

Summary

Høy oppløsning x-tomografi (HRCT) er en ikke-destruktiv diagnostisk avbildningsteknikk som kan brukes til å studere strukturen og funksjonen av anlegget vaskulatur i 3D. Vi viser hvordan HRCT forenkler utforskning av Xylem nettverk over et bredt spekter av plantemateriale og arter.

Abstract

Høy oppløsning x-ray computertomografi (HRCT) er en ikke-destruktiv bildediagnostikk teknikk med sub-micron oppløsning evne som nå brukes til å evaluere struktur og funksjon av anlegget Xylem nettverk i tre dimensjoner (3D) (f.eks Brodersen et al . 2010; 2011; 2012a, b). HRCT bildebehandling er basert på de samme prinsippene som medisinsk CT-systemer, men en høy intensitet synkrotron x-ray kilde resultater i høyere romlig oppløsning og redusert image oppkjøpet tid. Her viser vi i detalj hvordan synkrotron-baserte HRCT (utført ved Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) i kombinasjon med Avizo programvare (VSG Inc., Burlington, MA, USA) blir brukt til å utforske plante Xylem i excised vev og levende planter. Denne nye imaging verktøy lar brukerne til å gå utover tradisjonelle statiske, 2D lys eller elektron mikrografer og studere prøver å bruke virtuelle serielle seksjoner i alle plan. Et uendelig antall skiver i alle retninger cen skje på samme prøve, en funksjon som er fysisk umulig å bruke tradisjonelle mikroskopi metoder.

Resultatene viser at HRCT kan brukes til både urteaktige og treaktige planter, og en rekke plante organer (dvs. blader, petioles, stengler, kofferter, røtter). Tallene som presenteres her bidra til å vise både en rekke representative anlegg vaskulær anatomi og den typen detaljer hentet fra HRCT datasett, inkludert skanner for kysten redwood (Sequoia sempervirens), valnøtt (Juglans spp..), Eik (Quercus spp.)., Og lønn ( Acer spp.). tre saplings til solsikker (Helianthus annuus), vinranker (Vitis spp..) og bregner (Pteridium aquilinum og Woodwardia fimbriata). Skåret og tørket prøver fra woody arter er lettest å skanne og gir vanligvis de beste bildene. Imidlertid har de siste forbedringer (dvs. raskere skanner og prøve stabilisering) gjort det possusynlige å bruke denne visualiseringen teknikken på grønne vev (f.eks petioles) og i levende planter. I anledning krympe litt til hydrert grønn plante vev vil føre til at bilder til uskarphet og metoder for å unngå disse problemene beskrives. Disse siste fremskritt med HRCT gir lovende ny innsikt i anlegget vaskulær funksjon.

Introduction

Vannet transporteres fra planterøttene til bladene i en vaskulær vev kalt Xylem – et nettverk av sammenhengende rør, fiber og levende, metabolsk aktive celler. Transport funksjon av anlegget Xylem må opprettholdes for å levere næringsstoffer og vann til bladene for fotosyntese, vekst, og til slutt overlevelse. Vanntransport i Xylem rør kan bli forstyrret når Xylem nettverket kompromittert av patogene organismer. Som svar på slike infeksjoner planter ofte produsere gels, tannkjøtt, og tyloses som et middel for å isolere patogen spredning (f.eks McElrone et al 2008; 2010). Tørkestress kan også begrense vanntransport i Xylem. Som plantene mister vann under langvarig tørke, bygger spenningen i Xylem saft. Vann under spenning er metastabil (dvs. ved en viss terskel spenningen blir stor nok til å kavitere vannsøyler inneholdt i Xylem rør). Etter kavitasjon oppstår, kan en gassboble (emboli) dannes og fylle condUiT, effektivt blokkerer vann bevegelse (Tyree og Sperry 1989), et fenomen analogt til dykkersyke (dvs. "svingene") i dypvannsdykkere.

Til tross for viktigheten av Xylem vann transport for optimal plante funksjon som demonstrert av en omfattende samling av historiske og moderne litteratur om dette emnet (Tyree & Zimmermann, 2002;. Holbrook et al, 2005), er det fortsatt deler av Xylem nettverk som forblir unnvikende . Flere forskningsmiljøer har nylig begynt å bruke høy oppløsning x-ray computertomografi mikro-tomografi (HRCT) til å vurdere finere detaljer av tre anatomi og vaskulær vev (f.eks Mayo et al; 2010, 2008, Mannes et al 2010;. Brodersen et al 2010. 2011, 2012a, b, Maeda og Miyake, 2009; Steppe et al 2004).. HRCT er en destruktiv teknikk som brukes til å visualisere funksjoner i det indre av faste gjenstander og til å få digital informasjon på sine 3-D strukturelle egenskaper. HRCTskiller seg fra konvensjonell medisinsk CAT-scanning i sin evne til å løse detaljer så små som en mikron i størrelse, selv for høy tetthet objekter. Nylige fremskritt innen synkrotron HRCT teknologi har bedret bildeoppløsning og signal til støy-forhold tilstrekkelig slik at anlegget fartøy nettverk og intervessel tilkoblinger kan bli visualisert, tildelt 3D koordinater, og eksportert for hydrauliske modellsimuleringer. Brodersen et al. (2011) har nylig fremmet denne teknikken ved å kombinere 3D rekonstruksjoner generert av synkrotron HRCT med en Fortran modell som automatisk trekker ut data fra Xylem nettverk på mye høyere oppløsning enn noensinne var mulig med tradisjonelle anatomiske metoder (dvs. seriell seksjonering med en mikrotom og fotografering med lysmikroskopi, f.eks Zimmermann 1971). Dette arbeidet har også blitt brukt til å optimalisere hydrauliske modeller av Xylem system og identifisert unike egenskapene transport (dvs. motsatt retning i noen vessels i perioder med topp transpirasjon) (Lee et al., i gjennomgang).

Synkrotron HRCT kan nå brukes til å visualisere Xylem funksjonalitet, mottakelighet for kavitasjon, og en plantenes evne til å reparere embolized rør. Unnlatelse av å re-etablere flyt i embolized rør reduserer hydraulisk kapasitet, grenser fotosyntesen, og resulterer i plante død i ekstreme tilfeller (McDowell et al. 2008). Planter kan takle emboli ved å avlede vann rundt blokkeringer via groper forbinder tilstøtende funksjonelle kanaler, og ved å dyrke nye Xylem å erstatte tapt hydraulisk kapasitet. Noen planter har evnen til å reparere brudd i vannmassene, men detaljene i denne prosessen i Xylem under spenning har vært uklart i flere tiår. Brodersen et al. (2010) har nylig visualiseres og kvantifisert påfylling prosessen i live grapevines bruker HRCT. Vellykket fartøy påfylling var avhengig av vann tilstrømningen fra levende celler rundt Xylem rør, der enkelte vanndråper utvidet over tid, fylt fartøyer, og tvunget oppløsningen av innesluttet gass. Kapasiteten på ulike planter for å reparere kompromitterte Xylem fartøy og mekanismene som styrer disse reparasjonene blir nå etterforsket.

Beskrivelse av ALS anlegget Beamline 8.3.2

Vårt arbeid hittil har vært gjennomført på Hard X-ray Micro-tomografi Beamline 8.3.2 på Advanced Light Source i Lawrence Berkeley National Lab (Berkeley CA USA). Plant Prøvene plasseres i en bly-lined hutch ligger 20 meter fra x-ray kilde, generert av en 6 Tesla superledende bend magnet dipol innenfor Advanced Light Source elektron lagring ring som drives ved en kritisk energi på 11,5 KeV. En skjematisk av endestasjonen er vist i figur 1. The X-stråler inn i bur med en bjelke størrelse på 40x ~ 4,6 mm og passerer gjennom prøven som er montert på en motorisert roterende scene. Denoverførte røntgen impinge på en krystall scintillator (to materialer som vanligvis brukes er Luag eller CdWO ₄₎ som konverterer røntgenbilder til synlig lys som er videresendt via linser bort på en CCD for bildesamling. Kameraet, scintillator og optikk er med i en lys tett boks som er på skinner som gjør at prøven til scintillator avstand til å være optimalisert for fase kontrast bildebehandling.

Alle prøver er montert på 10 cm i diameter roterende stadium som i sin tur er montert på horisontale og vertikale oversettelse stadier for prøven posisjonering. En levende plante prøven, med rot-systemet montert i en tilpasset bygget plante gryteklut og løvverk inneholdt i en akryl tube, kan sees i Figur 2. Typiske eksponeringstider kan variere 0,1 til 1 sek ved hjelp 10-18 KeV og skanner varighet vil variere 5-40 min avhengig av innstillingene optimalisert for en enkelt prøve. For høye prøver (typisk for plante Xylem nettverk), kan data skanninger væreflislagt ved å gjenta målingen med prøven ved forskjellige høyder, som styres automatisk, slik at sømløse serielle seksjoner langs en maksimal prøve høyde ~ 10 cm. Maksimal prøve bredde når bildebehandling på 4,5 mikrometer oppløsning er ~ 1 cm for prøver som er nesten perfekt i vertikal retning. Data generasjon og behandling er fullført ved å bruke protokollen listet nedenfor. På grunn av forskjellen i x-ray dempningen mellom luft og vann, kan utmerket bildekontrasten oppnås i planter uten bruk av kontrastmidler løsninger som er typiske for medisinske CT-systemer. De luftfylte årehulrommet er lett skjelnes fra det omgivende vann-fylt vev i hydratiserte planter.

Protocol

Protokoll detaljer beskrevet nedenfor ble skrevet spesielt for arbeid på Advanced Light Source 8.3.2 beamline. Tilpasninger kan være nødvendig for arbeid på andre synkrotron anlegg. Forsvarlig sikkerhet og stråling opplæring er nødvendig for bruk av disse fasilitetene. 1. Prøveopparbeidelse for levende planter Dyrke planter i ~ 10 cm diameter potter, og sørge for at de viktigste stammen (eller en del av anlegget som skal skannes) er som sentrert som mulig og vertikalt i p…

Representative Results

Synchotron HRCT skanninger har blitt implementert på et bredt utvalg av plantemateriale og arter som bruker beamline 8.3.2 (figur 5), og har gitt ny innsikt i struktur og funksjon av anlegget Xylem på enestående oppløsning i 3D. Visualisering og leting evner tilbys av 3D rekonstruksjoner (som illustrert i fig 6-8; og filmer 1-3) muliggjør presis bestemmelse av plasseringen og orienteringen av strukturer med Xylem nettverkene på begge utskårende prøver og i levende planter. <…

Discussion

Synchotron HRCT gir plante biologer med en kraftig, ikke-destruktiv verktøy for å utforske den interne driften av anlegget blodkar i utrolige detaljer. Denne teknologien har vært brukt nylig for å identifisere tidligere ubeskrevet anatomiske strukturer i grapevine Xylem som differensielt endre Xylem nettverkstilkobling i ulike grapevine arter (Brodersen m.fl. 2012b, in press.) – Denne tilkoblingen kan drastisk forandre evne vaskulære patogener og emboli å spre destruktivt hele Xylem nettverk. De …

Materials

Material Name/Equipment	Company	Catalogue Number	Comments (optional)
			See specifics listed above regarding equipment at the Advanced Light Source beamline 8.3.2