Usando tomografia de tórax para visualizar a estrutura tridimensional e Função da Usina Vasculatura
Summary
Alta resolução de raios-X de tomografia computadorizada (PCA), é um não-destrutiva técnica de imagiologia de diagnóstico que pode ser utilizada para estudar a estrutura e função dos vasos de plantas em 3D. Demonstramos como TCAR facilita a exploração de redes de xilema através de uma ampla variedade de tecidos e espécies vegetais.
Abstract
Alta resolução de raios-X a tomografia computadorizada (TCAR) é uma técnica não-destrutiva de diagnóstico por imagem com sub-mícron capacidade de resolução que está sendo usada agora para avaliar a estrutura e função da rede de xilema de plantas em três dimensões (3D) (por exemplo, Brodersen et al . 2010; 2011; 2012a incumbentes, b). TCAR de imagem baseia-se nos mesmos princípios que o médico CT sistemas, mas uma alta intensidade de sincrotrão resultados de raios-x de fonte na maior resolução espacial e diminuição do tempo de aquisição de imagem. Aqui, demonstramos detalhadamente como síncrotron baseado TCAR (realizado na Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, EUA) em combinação com Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, EUA), está a ser utilizada para explorar xilema de plantas em excisadas do tecido e plantas vivas. Esta ferramenta permite que os usuários de imagem nova para ir além tradicional luz estática, 2D ou microscopia eletrônica e amostras de estudo usando virtuais cortes seriados em qualquer plano. Um número infinito de fatias em qualquer orientação cum ser feitas com a mesma amostra, uma característica que é fisicamente impossível utilizar métodos de microscopia tradicionais.
Os resultados demonstram que a TCAR pode ser aplicada a ambos herbáceas e espécies de plantas lenhosas, e uma variedade de órgãos da planta (folhas, ou seja, pecíolos, caules, troncos, raízes). Os números apresentados aqui ajudar a demonstrar tanto uma gama de anatomia representante plantas vasculares e do tipo de detalhe extraído de conjuntos de dados de TCAR, incluindo verificações de costa sequóias (Sequoia sempervirens), nogueira (Juglans spp.), Carvalho (Quercus spp.), E de bordo ( Acer spp.) mudas de árvores para girassóis (Helianthus annuus), videiras (Vitis spp.) e samambaias (Pteridium aquilinum e Woodwardia fimbriata). Amostras excisadas e secas de espécies lenhosas são mais fáceis de digitalizar e normalmente produzem as melhores imagens. No entanto, as melhorias recentes (varreduras ou seja, mais rápidos e de estabilização da amostra), tornou possvel para usar esta técnica de visualização de tecidos verdes (por exemplo, pecíolos) e em plantas vivas. Na ocasião algum encolhimento de tecidos vegetais verdes hidratados fará imagens para borrão e métodos para evitar estes problemas são descritos. Esses avanços recentes com TCAR fornecer promissores novos insights sobre a função vascular da planta.
Introduction
Água é transportada das raízes para as folhas em um tecido vascular chamado xilema – uma rede de condutas interligados, fibras e vivos, células metabolicamente ativas. Função de transporte do xilema da planta deve ser mantida para fornecer nutrientes e água para as folhas para a fotossíntese, o crescimento e, finalmente, de sobrevivência. O transporte da água nas condutas do xilema pode ser interrompida quando a rede do xilema é comprometida por organismos patogénicos. Em resposta a tais plantas infecções muitas vezes produzir geles, gomas, e Tilos como um meio para isolar propagação agente patogénico (por exemplo, McElrone et al 2008; 2010). O estresse hídrico também pode limitar o transporte de água no xilema. Como as plantas perdem água durante a seca prolongada, a tensão na seiva do xilema. Água sob tensão é metastãvel (isto é, a um certo limiar, a tensão torna-se suficientemente grande para cavitar colunas de água contida nas condutas de xilema). Após a cavitação ocorre, uma bolha de gás (embolismo) podem formar e encher as conduit, o movimento da água de forma eficaz de bloqueio (Tyree e Sperry, 1989), um fenômeno análogo a doença de descompressão (ou seja, "as curvas") em mergulhadores de águas profundas.
Apesar da importância do transporte de água no xilema para a função planta ideal, como demonstrado por um vasto corpo de literatura histórica e contemporânea sobre este tema (Tyree & Zimmermann, 2002;. Holbrook et al, 2005), ainda há aspectos de redes do xilema que permanecem indescritível . Vários grupos de pesquisa começaram recentemente a utilização de alta resolução de raios-x computadorizada micro-tomografia (TCAR) para avaliar pequenos detalhes de anatomia da madeira e tecido vascular (por exemplo, Mayo et al; 2010, 2008; Mannes et al 2010;. Brodersen et al 2010. , 2011, 2012a incumbentes, b; Maeda e Miyake, 2009; Estepe et al 2004).. TCAR é uma técnica não destrutiva utilizada para visualizar as características do interior de objectos sólidos e de obter a informação digital sobre os seus 3-D propriedades estruturais. TCARdifere da medicina convencional CAT-scanning na sua capacidade de resolver os detalhes tão pequenos quanto um micron de tamanho, até mesmo para os objectos de alta densidade. Os recentes avanços na tecnologia síncrotron TCAR melhorou a resolução da imagem e relação sinal-ruído suficiente para que as redes de recursos de navios e conexões intervasculares pode ser visualizado, atribuído coordenadas 3D, e exportado para simulações hidráulicas. Brodersen et al. (2011) recentemente avançou esta técnica combinando reconstruções 3D gerados pelo síncrotron TCAR com um modelo de Fortran que extrai automaticamente os dados da rede xilema em resolução muito maior do que jamais foi possível com os tradicionais métodos anatômicos (ou seja, o corte de série com um micrótomo e captura de imagem com microscopia de luz, por exemplo, Zimmermann 1971). Este trabalho também tem sido utilizada para optimizar modelos hidráulicos do sistema de xilema e identificadas características únicas de transporte (isto é, o fluxo reverso em algumas vessels durante os períodos de pico de transpiração) (Lee et al., em revisão).
Síncrotron TCAR pode agora ser usado para visualizar a funcionalidade do xilema, a susceptibilidade a cavitação, e capacidade de plantas para reparar condutas embolização. A falta de restabelecer o fluxo nas condutas embolizados reduz a capacidade hidráulica, a fotossíntese limites, e resulta na morte das plantas, em casos extremos (McDowell et al. 2008). As plantas podem lidar com êmbolos pelo desvio da água em torno de bloqueios através de poços de ligação adjacentes condutas funcionais, e pela crescente xilema novo para substituir perdeu capacidade hidráulica. Algumas plantas possuem a capacidade de reparar quebras nas colunas de água, mas os detalhes deste processo no xilema sob tensão não está claro por décadas. Brodersen et al. (2010) recentemente visualizado e quantificado o processo de recarga em videiras ao vivo usando TCAR. Vaso sucesso reenchimento foi dependente influxo de água a partir de células vivas em torno do xylin condutas, onde gotículas de água individuais expandiram ao longo do tempo, vasos cheios, e forçaram a dissolução do gás aprisionado. A capacidade de plantas diferentes para reparar vasos do xilema comprometidos e os mecanismos que controlam esses reparos estão sendo investigadas.
Descrição da instalação de ALS Beamline 8.3.2
Nosso trabalho até à data tem sido realizados sobre o Hard X-ray Micro-Tomografia Beamline 8.3.2 na fonte avançada Luz no Laboratório Nacional Lawrence Berkeley (Berkeley CA EUA). As amostras de plantas são colocadas em um revestida de chumbo hutch localizado a 20 m da fonte de raios-x, gerado por um ímã curva 6 Tesla supercondutor dipolo dentro da Fonte de Luz Avançado elétron operacional anel de armazenamento com uma energia crítica de 11,5 KeV. Um esquema da estação final é mostrado na Figura 1. As radiografias entrar na gaiola com um tamanho de feixe de 40x ~ 4,6 mm e passar através da amostra que está montado sobre uma fase de rotação motorizada. Otransmitido raios X colidem com um cintilador de cristal (dois materiais vulgarmente utilizados são LuAG CdWO ou 4) que convertem raios X em luz visível que é transmitido através de lentes sobre um CCD de recolha de imagem. A câmara de cintilação, e ópticas estão contidos dentro de uma caixa de luz que é apertado sobre trilhos que permite que a distância de amostra-para-cintilador para ser optimizado para imagens de contraste de fase.
Todas as amostras são montadas na etapa 10 cm de diâmetro de rotação que por sua vez está montada sobre as fases de tradução horizontal e vertical para o posicionamento da amostra. Uma amostra de planta viva, com o sistema de raiz montado em um suporte de panela planta construída personalizado e a folhagem contido em um tubo de acrílico, pode ser visto na Figura 2. Tempos de exposição típica pode variar 0,1-1 seg usando 10-18 keV, e durações de varredura irá variar 5-40 min, dependendo das configurações optimizadas para uma determinada amostra. Para amostras de altura (típica das redes de xilema de plantas), varreduras de dados podem serladrilhado, repetindo a medição com a amostra em alturas diferentes, o que é controlado automaticamente, permitindo seamless secções seriadas ao longo de uma altura de amostragem máxima de ~ 10 cm. Largura máxima da amostra, quando imagiologia em 4,5 uM resolução é ~ 1 cm em relação às amostras que são quase perfeitas na orientação vertical. Geração de dados e processamento é concluído usando o protocolo listados abaixo. Por causa da diferença de atenuação de raios X entre o ar e a água, o contraste da imagem pode ser obtida excelente nas plantas sem a utilização de soluções de contraste típico de sistemas médicos de TC. O lúmen do vaso cheio de ar é facilmente distinguível do tecido circundante cheia de água em plantas hidratadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Synchotron TCAR fornece biólogos de plantas com uma ferramenta poderosa, não-destrutivo para explorar o funcionamento interno dos vasos de plantas com detalhes incríveis. Esta tecnologia tem sido usada recentemente para identificar previamente não descritas estruturas anatômicas do xilema videira que diferencialmente alteram a conectividade de rede do xilema em espécie de videira diversas (Brodersen et al 2012b, no prelo.) – Essa conectividade pode alterar drasticamente a capacidade de patógenos…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a S Castorani, AJ Eustis, GA Gambetta, CM Manuck, Z Nasafi, e A Zedan. Este trabalho foi financiado por: o Departamento de Agricultura dos EUA-Agricultural Research atual financiamento Serviço de Pesquisa do Sistema de Informação (projeto de pesquisa não 5306-21220-004-00; fonte de luz avançada é apoiada pelo diretor do Escritório de Ciência, Instituto de Basic. ciências da energia, do Departamento de Energia dos EUA sob Contrato n º DE-AC02-05CH11231);. Especiais e Nifa culturas pesquisa iniciativa subvenção para AJM.
Materials
| Material Name/Equipment | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| See specifics listed above regarding equipment at the Advanced Light Source beamline 8.3.2 |
References
- Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Matthews, M. A., Shackel, K. A. The dynamics of embolism repair in xylem: in vivo visualizations using high resolution computed tomography. Plant Physiology. 154, 1088-1095 (2010).
- Brodersen, C. R., Lee, E., Choat, B., Jansen, S., Phillips, R. J., Shackel, K. A., McElrone, A. J., Matthews, M. A. Automated analysis of 3D xylem networks using high resolution computed tomography (HRCT). New Phytologist. 191 (4), 1168-1179 (2011).
- Brodersen, C., Roark, L., Pittermann, J. The physiological implications of primary xylem organization in two ferns. Plant, Cell & Environment. , (2012).
- Brodersen, C., Choat, B., Chatelet, D., Shackel, K. A., Matthews, M. A., McElrone, A. J. Conductive xylem bridges contribute differentially to radial connectivity in grapevine stems (Vitis vinifera and V. arizonica). American Journal of Botany. , (2012).
- McElrone, A. J., Jackson, S., Habdas, P. Hydraulic disruption and passive migration by a bacterial pathogen in oak tree xylem. Journal of Experimental Botany. 59, 2649-2657 (2008).
- McElrone, A. J., Grant, J., Kluepfel, D. The role of ethylene-induced tyloses in canopy hydraulic failure of mature walnut trees afflicted with apoplexy disorder. Tree Physiology. 30, 761-772 (2010).
- Tyree, M., Sperry, J. Vulnerability of xylem to cavitation and embolism. Annual Review of Plant Biology. 40 (1), 19-36 (1989).
- Tyree, M., Zimmermann, M. . Xylem structure and the ascent of sap. , (2002).
- Holbrook, N. M., Zwienieck, M. A. . Vascular Transport in Plants. , (2005).
- Mayo, S. C., Chen, F., Evans, F. Micron-scale 3D imaging of wood and plant microstructure using high-resolution x-ray phase-contrast microtomography. Journal of Structural Biology. 171, 182-188 (2010).
- Mannes, D., Marone, F., et al. Application areas of synchrotron radiation tomographic microscopy for wood research. Wood Science and Technology. 44, 67-84 (2010).
- Maeda, E., Miyake, H. A non-destructive tracing with an x-ray micro ct scanner of vascular bundles in the ear axes at the base of the lower level rachis-branches in japonica type rice (oryza sativa. Japanese Journal of Crop Science. 78 (3), 382-386 (2009).
- Steppe, K., Cnudde, V., et al. Use of x-ray computed microtomography for non-invasive determination of wood anatomical characteristics. Journal of Structural Biology. 148 (1), 11-21 (2004).
- Zimmermann, M. Dicotyledonous wood structure (made apparent by sequential sections). Encyclopaedia Cinematographica. , (1971).
- Lee, E. F., Brodersen, C. R., McElrone, A. J., et al. Analysis of HRCT-derived xylem network reveals reverse flow in some vessels. , (2013).
- McDowell, N. G., Pockman, W. T., et al. Mechanisms of plant survival and mortality during drought: why do some plants survive while others succumb. New Phytologist. 178, 719-739 (2008).
- McElrone, A. J., Brodersen, C. R., et al. Centrifuge technique consistently overestimates vulnerability to water-stress induced cavitation in grapevines as confirmed with high resolution computed tomography. New Phytologist. , (2012).
- Lee, K., Avondo, J., et al. Visualizing plant development and gene expression in three dimensions using optical projection tomography. Plant Cell. 18, 2145-2156 (2006).
- Truernit, E., Bauby, H., et al. High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis. Plant Cell. 20, 1494-1503 (2008).
- Jahnke, S., Menzel, M. I., et al. Combined MRI-PET dissects dynamic changes in plant structures and functions. The Plant Journal. 59, 634-644 (2009).
- Iyer-Pascuzzi, A. S., Symonova, O., et al. Imaging and analysis platform for automatic phenotyping and trait ranking of plant root systems. , (2010).
