Et isoler immunocoloration des lymphocytes et des cellules dendritiques à partir des plaques de Peyer murin de
Summary
Il ya un intérêt croissant pour la compréhension des fonctions immunologiques des sous-populations spécifiques de cellules dans les plaques de Peyer (PP), les sites principaux inducteurs de tissus lymphoïdes associés à l'intestin. Ici, nous décrivons les protocoles parallèles pour la préparation PP préparations cellulaires simples pour l'analyse par cytométrie en flux et cryosections PP immunomarquage.
Abstract
Les plaques de Peyer (PP) font partie intégrante des tissus lymphoïdes associées à l'intestin (GALT) et jouent un rôle central dans l'homéostasie intestinale et immunosurveillance. Antigènes particulaires et des microbes dans la lumière intestinale sont continuellement échantillonné par les cellules M PP dans l'épithélium folliculaire associée (EAF) et transportés vers un réseau sous-jacent des cellules dendritiques (CD), les macrophages et les lymphocytes. Dans cet article, nous décrivons les protocoles dans lesquels PP murins sont (i) dissociée en suspensions de cellules isolées et soumises à la cytométrie en flux et (ii) préparé pour découpe au cryostat et immunomarquage. Pour la cytométrie en flux, PPs sont dissociées mécaniquement et ensuite filtré à travers 70 pm à générer des membranes suspensions monocellulaires libres des cellules épithéliales et les gros débris. Démarrage avec 20-25 PP (à partir de quatre souris), cette méthode rapide et reproductible donne une population de> 2,5 x 10 6 cellules avec> 90% de viabilité cellulaire. Pour découpe au cryostat, fraisPP ly isolés sont immergés dans la température de coupe optimale (PTOM) moyen, composant logiciel enfichable congelés dans l'azote liquide, puis sectionnée à l'aide d'un cryomicrotome. Les coupes de tissus (5-12 um) sont séchés à l'air, fixées à l'acétone ou le méthanol, puis soumis à immunomarquage.
Introduction
Les plaques de Peyer (PP) sont des agrégats macroscopiques organisés follicules lymphoïdes présents tout au long de l'intestin grêle de l'homme et la souris (figure 1) et constituent les principaux sites à laquelle des réponses immunitaires muqueuses sont engagées contre des antigènes alimentaires, les bactéries commensales, les agents pathogènes microbiens et les vaccins oraux 1-4. Contrairement à d'autres tissus lymphoïdes périphériques tels que les ganglions lymphatiques mésentériques, PP manquent vaisseaux lymphatiques afférents. En tant que tels, des réponses immunitaires adaptatives en PP sont entraînés en réponse à des antigènes provenant de la lumière intestinale. L'échantillonnage des antigènes luminal est accomplie par l'épithélium du follicule-associé (EAF), qui se compose de deux entérocytes et l'antigène d'échantillonnage cellules appelées cellules M. Sous l'EAF, dans le dôme sous-épithélial (SED) région, se trouve un réseau de cellules dendritiques (CD) entremêlés avec les macrophages, les lymphocytes B et les lymphocytes T CD4 + 5-9. Au cœur de chaque follicl PP lymphoïdee sont des cellules dendritiques folliculaires (FDC) et un B riche en cellules germinales centre central, flanqué de zones T interfolliculaires cellules riches. D'échantillonnage de l'antigène par les résultats PP dans le développement de plasmablastes + IgA cellules B et cellules CD4 + mémoires et effectrices que les semences de la lamina propria environnante et offrir une immunité à un large éventail d'envahisseurs muqueuses.
Disséquer les événements immunologiques complexes associées à l'échantillonnage antigène, le traitement et la présentation de PP est une tâche ardue, étant donné que les cellules PP ne constituent qu'une infime partie de la totalité des cellules lymphoïdes dans la muqueuse intestinale. Pour aider à la caractérisation in vitro de cellules dans ce contexte, nous proposons un protocole de préparation total des cellules de souris PP pour la cytométrie en flux et fonctionnelles, ainsi que d'un protocole de préparation PP cryosections pour la microscopie d'immunofluorescence et immunohistochimie. Notre protocole pour l'isolement, la caractérisation et immunomarquage des protocoles d'ententee cellules PP n'est pas nouvelle en soi, comme en témoigne le fait qu'il ya de nombreuses références datant de plus de 25 ans qui citent ces techniques 5,6,9-11. Au contraire, notre protocole prévoit une procédure simplifiée (et visuel) méthode de collecte des enquêteurs PP pour la première fois. Les techniques que nous décrivons sont faciles à maîtriser et facile à produire un grand nombre de cellules avec> 90% de viabilité cellulaire. Le protocole de découpe au cryostat donne hautement reproductibles coupes sériées parfaitement adaptés pour immunofluorescence et la microscopie confocale. En outre, notre protocole complète deux autres articles Jove dernières années. La première, par Fukuda et ses collègues, décrit l'utilisation de tests anse iléale ligaturée à évaluer l'absorption de bactéries pathogènes par les cellules M PP 12. L'autre, par Geem et ses collègues, décrit l'isolement et la caractérisation des cellules dendritiques et les macrophages de la muqueuse intestinale de la souris, mais exclut explicitement les PP à partir de leur analyse 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cet article, nous avons fourni des protocoles parallèles pour la préparation PP préparations de cellules uniques pour l'analyse par cytométrie en flux et fonctionnelle et cryosections pour immunomarquage. Les deux méthodes sont hautement reproductibles et facilement accessible, à condition d'un cytomètre en flux et cryostat sont disponibles. Pour les enquêteurs première fois, il convient de souligner que, par rapport à la rate, les rendements cellulaires totaux provenant PP sont relativement maigr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions chanson Renjie (Wadsworth Center de base de cytométrie en flux) de l'aide pour l'analyse cellulaire et Helen Johnson (Wadsworth Center animale Histopathologie de base) pour la préparation de coupes en paraffine. Nous remercions le Dr Richard A. Cole (Wadsworth Center de base Light Microscopy) de l'aide pour la microscopie confocale et collection d'images. Nous tenons à remercier Andy Bentley (Wadsworth Center Photo et illustration) à l'aide d'animations.
MDJ est soutenu par la Fondation Life Sciences Research, Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Fellowship. SA est soutenu par un Wadsworth Center-Health Research Inc bourse de recherche postdoctorale intra-muros. Ce travail a été financé en partie par des subventions du NIH HD061916 et GM082978.
Materials
| Item | Company | Cat. # | Comments (optional) |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| 7x7x5 mm Base Molds | Fisherbrand | 22-363-552 | |
| ImmEdge Pen | Vector Labs | H-4000 | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | 4951 | |
| Edge Rite Blade | Thermo Scientific | 4280L | |
| Anti-Mouse CD11c-PE | eBioscience | 17-0114-82 | |
| Anti-Mouse CD45R/B220-APC | BD Pharmigen | 553092 | |
| Anti-Mouse CD3-FITC | BD Pharmigen | 561798 | |
| Anti-Mouse CD4-PE | BD Pharmigen | 553652 | |
| Anti- Mouse CD8-PE | BD Pharmigen | 553032 | |
| Anti-Mouse CD19-PercP | BioLegend | 115531 | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) without phenol red | Fisher Scientific | 14175-079 | |
| 70 μm cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Spleen Dissociation Medium | Stem Cell Technologies | 7915 | |
| Goat serum | Invitrogen | 16210-072 | |
| Fc Block | ATCC 2.4.G2 | HB-197 | Supes obtained from cell line 2.4.G2 |
| Curved Scissor | F.S.T | 14061-09 | |
| Cryostat | Leica | 3050S | |
| FACS Calibur | BD | ||
| Countess Cell Counter | Invitrogen | ||
| Hematoxylin | Richard Allan | 7211 | |
| Eosin | Richard Allan | 71304 | |
| Formalin | Starplex Scientific | 3661 | |
Table 1. Reagents and equipment used in this study. |
References
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