Summary

Lenfositler ve mürin Peyer en Yamalar itibaren Dendritik Hücreler İzolasyon Ve immün

Published: March 17, 2013
doi:

Summary

Peyer plaklarında hücrelerin belirli altgrupları (PPs), gut-ilişkili lenfoid dokuların primer endüktif sitelerin immünolojik işlevlerini anlamak giderek artan bir ilgi var. Burada akım sitometri analizi ve immun için PP cryosections için tek hücre hazırlıkları PP hazırlamak için paralel protokolleri anahat.

Abstract

Peyer plaklarında (PPs) gut-ilişkili lenfoid dokuların ayrılmaz bileşenleri (GALT) ve intestinal immünosürveylansında ve homeostasis merkezi bir rol oynamaktadır. Bağırsak lümeninde Partikül antijen ve mikrop sürekli folikül ilişkili epitel (FAE) PP M hücreleri tarafından örneklenmiş ve altta yatan bir dendritik hücreler ağı (DC'ler), makrofajlar ve lenfositler taşınmaktadır. Bu yazıda, murin PPs (i) tek hücre süspansiyonları içine uzaklaşılmış ve akım sitometri tabi ve (ii) cryosectioning ve immün için hazırlanan hangi protokolleri tanımlar. Flow sitometri için santrallerin mekanik ayrılmış ve daha sonra epitel hücreleri ve büyük enkaz ücretsiz tek hücre süspansiyonları üretmek için 70 mikron membran ile filtre vardır. 20-25 PPs (dört fareler) ile başlayarak, bu hızlı ve tekrarlanabilir bir yöntemdir> 2,5 nüfusu verir x 10> 90% hücre canlılığı ile 6 hücre. Cryosectioning, taze içinly izole PPs bir cryomicrotome kullanarak o Optimal Kesme Sıcaklık (OCT) orta, sıvı azot içinde ek dondurulmuş ve kesitli batırılır. Doku kesitleri (5-12 mikron), aseton veya metanol ile tespit edilmiş, hava ile kurutulmuş, ve daha sonra immün tabi tutulmuştur.

Introduction

Peyer plaklarında (PPs) insan ve farelerde (Şekil 1) ince barsak boyunca mevcut organize lenfoid folikül makroskopik büyüklükler ve mukozal immün yanıtları diyet antijenler, komensal bakteriler, mikrobiyal patojenler ve oral aşılar karşı başlatılan hangi birincil siteler teşkil 1-4. Böyle mezenterik lenf düğümleri gibi diğer periferal lenfoid dokuların aksine, PPs afferent lenfatikler yoksundur. PPs böyle, adaptif immün yanıtları intestinal lümen elde antijenlere yanıt olarak tahrik gibi. Luminal antijenlerinin örnekleme M hücreleri olarak bilinen enterocytes ve antijen-örnekleme hücrelerinin her iki oluşan folikül ilişkili epitel (FAE) ile gerçekleştirilmektedir. FAE altında, alt-epitelyal kubbe (SED) bölgesinde, makrofaj, B hücreleri ve CD4 + T hücreleri 5-9 ile iç içe dendritik hücreler (DC) bir ağ yatıyor. Her PP lenfoid follicl özündeE foliküler dendritik hücreler (FDCs) ve T hücreden zengin interfolliküler zonları ile çevrili bir B hücre zengini Orta germinal merkez vardır. IgA + B hücre plasmablasts ve CD4 + efektör ve bellek hücrelerinin gelişiminde PPs sonuçları Antijen örnekleme o tohumu çevreleyen lamina propria ve mukoza işgalciler geniş bir bağışıklık sağlar.

PPs antijen örnekleme, işleme ve sunum ile ilişkili kompleks immünolojik olaylar Diseksiyon PP hücreleri bağırsak mukozasında toplam lenfoid hücrelerin ancak çok küçük bir kısmını teşkil ettiği göz önüne alındığında, zor bir iştir. Bu ortamda hücrelerin in vitro olarak karakterize yardımcı olmak için, akış sitometrisi ve işlevsel analizi, hem de immün flüoresan mikroskopi ve immünohistoloji için cryosections PP hazırlanması için bir protokol için toplam fare PP hücrelerinin hazırlanması için bir protokol sağlar. Mous izolasyonu, karakterizasyonu ve immun Bizim protokolE PP hücreleri bu teknikler 5,6,9-11 cite daha 25 yıl öncesine tarihlenen çok sayıda başvuru olduğu gerçeğini kanıtladığı, başlı başına roman değildir. Aksine, protokol, ilk kez için PPs toplama araştırmacılar için düzenlenmiş bir (görme ve) bir yöntem sağlar. Bizim tarif teknikler kolayca hakim ve kolayca>% 90 hücre canlılığı ile hücrelerin büyük sayıda elde edilir. Cryosectioning protokolü ideal immünofloresan boyama ve konfokal görüntüleme için uygun son derece tekrarlanabilir seri kesitler verir. Ayrıca, protokol diğer iki yeni vallahi makaleler tamamlar. İlk, Fukuda ve arkadaşları tarafından, PP M hücreleri 12 ile patojen bakterilerin alımını değerlendirmek için bağlanan ileal loop testlerinin kullanımı anlatılmaktadır. Diğer, Geem ve arkadaşları tarafından, DC'ler ve fare intestinal mukozadan makrofaj izolasyonu ve karakterizasyonu açıklar, ancak açıkça onların analiz 13 PPs dışlar.

Protocol

Hayvanlar geleneksel, spesifik patojen free koşullarda muhafaza edildi ve Wadsworth Merkezi'nin Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu (IACUC) kurallarına tam uyumlu olarak tedavi edildi. 1. Oral Gavaj 22 G x1.5-kullanarak ilgi antijen veya mikroplarla seçim (İsteğe bağlı) Gavaj fare zorlanma. Künt uç besleme iğne (Popper Bilimsel, New Hyde Park, NY). Teslimat hacimleri fare başına 400 ul geçmemelidir. 2. Akış sitometrisi iç…

Representative Results

Toplam PP hücreleri monodisperse süspansiyonlarının akış sitometrik analizi, iyi ve kötü hücre hazırlıkları arasında net bir ayrım ortaya koymaktadır. % 80'in üzerinde canlılığı ile iyi cep hazırlıkları, hücreler büyük çoğunluğu yüksek ileri saçılım (FSC), yüksek hücre hacmi bir göstergesi ve düşük yan dağılım (SSC), düşük hücre granülarite (Şekil 2A) bir göstergesi gösterir. Bu deneyde, biz de kasıtlı (yerine PHEM PBS artı% 1 FCS ile hücreler ku…

Discussion

Bu yazıda, immün akım sitometri ve fonksiyonel analiz ve cryosections için tek hücre hazırlıkları PP hazırlamak için paralel protokolleri sağlamıştır. Her iki yöntem bir akış sitometresinin ve kriyostat olarak sağlanır, yüksek oranda tekrarlanabilir ve kolayca erişilebilir. Ilk kez araştırmacılar için bu dalak göre, santrallerin toplam hücre verimleri nispeten yetersiz olduğuna işaret edilmelidir. Bununla birlikte, protokol biz genellikle tek bir fare 0,8-1,2 x 10 6 toplam PP hüc…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz hücre analizi ve kesitler hazırlamak için Helen Johnson (Wadsworth Merkezi Hayvan Histopatoloji Çekirdek) yardım için Renjie Song (Wadsworth Merkezi Akış Sitometri Çekirdek) teşekkür ederim. Biz konfokal mikroskopi ve görüntü toplama konusunda yardım almak için Dr Richard A. Cole (Wadsworth Merkezi Işık Mikroskobu Çekirdek) teşekkür ederim. Biz animasyonlar ile yardım için Andy Bentley (Wadsworth Center Fotoğraf ve İllüstrasyon) kabul etmek istiyorum.

MDJ Yaşam Bilimleri Araştırma Vakfı, Howard Hughes Tıp Enstitüsü (HHMI) Kardeşliği tarafından desteklenmektedir. SA Wadsworth Merkezi-Sağlık Araştırma A.Ş. intramural doktora sonrası dostluk tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma NIH hibe HD061916 ve GM082978 tarafından kısmen desteklenmiştir.

Materials

Item Company Cat. # Comments (optional)
OCT Compound Tissue-Tek 4583
7x7x5 mm Base Molds Fisherbrand 22-363-552
ImmEdge Pen Vector Labs H-4000
Superfrost Plus Slides Thermo Scientific 4951
Edge Rite Blade Thermo Scientific 4280L
Anti-Mouse CD11c-PE eBioscience 17-0114-82
Anti-Mouse CD45R/B220-APC BD Pharmigen 553092
Anti-Mouse CD3-FITC BD Pharmigen 561798
Anti-Mouse CD4-PE BD Pharmigen 553652
Anti- Mouse CD8-PE BD Pharmigen 553032
Anti-Mouse CD19-PercP BioLegend 115531
Hank’s balanced salt solution (HBSS) without phenol red Fisher Scientific 14175-079
70 μm cell strainer BD Falcon 352350
Spleen Dissociation Medium Stem Cell Technologies 7915
Goat serum Invitrogen 16210-072
Fc Block ATCC 2.4.G2 HB-197 Supes obtained from cell line 2.4.G2
Curved Scissor F.S.T 14061-09
Cryostat Leica 3050S
FACS Calibur BD
Countess Cell Counter Invitrogen
Hematoxylin Richard Allan 7211
Eosin Richard Allan 71304
Formalin Starplex Scientific 3661

Table 1. Reagents and equipment used in this study.

References

  1. Mantis, N. J., Rol, N., Corthesy, B. Secretory IgA’s complex roles in immunity and mucosal homeostasis in the gut. Mucosal. Immunol. 4, 603-611 (2011).
  2. Neutra, M., Mantis, N., Kraehenbuhl, J. P. Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissue. Nature Immunology. 2, 1004-1009 (2001).
  3. Rescigno, M., Sabatino, A. D. i. Dendritic cells in intestinal homeostasis and disease. J. Clin. Invest. 119, 2441-2450 (2009).
  4. Suzuki, K., Kawamoto, S., Maruya, M., Fagarasan, S. GALT: organization and dynamics leading to IgA synthesis. Adv. Immunol. 107, 153-185 (2010).
  5. Iwasaki, A., Kelsall, B. L. Localization of distinct Peyer’s patch dendritic cell subsets and their recruitment by chemokines macrophage inflammatory protein (MIP)-3alpha, MIP-3beta, and secondary lymphoid organ chemokine. Journal of Experimental Medicine. 191, 1381-1394 (2000).
  6. Iwasaki, A. Mucosal dendritic cells. Annu. Rev. Immunol. 25, 381-418 (2007).
  7. Lelouard, H., Fallet, M., de Bovis, B., Meresse, S., Gorvel, J. P. Peyer’s Patch Dendritic Cells Sample Antigens by Extending Dendrites Through M Cell-Specific Transcellular Pores. Gastroenterology. 42, 592-601 (2011).
  8. Lelouard, H., et al. Pathogenic bacteria and dead cells are internalized by a unique subset of Peyer’s patch dendritic cells that express lysozyme. Gastroenterology. 138, 173-184 (2010).
  9. Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer’s patches. Infect. Immun. 71, 504-509 (2003).
  10. Favre, L., Spertini, F., Corthesy, B. Secretory IgA possesses intrinsic modulatory properties stimulating mucosal and systemic immune responses. J. Immunol. 175, 2793-2800 (2005).
  11. Kelsall, B. L., Strober, W. Distinct populations of dendritic cells are present in the subepithelial dome and T cell regions of the murine Peyer’s patch. J. Exp. Med. 183, 237-247 (1996).
  12. Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer’s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. J. Vis. Exp. (58), e3225 (2011).
  13. Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine. J. Vis. Exp. (63), e4040 (2012).
  14. Lopez-Guerrero, D. V., et al. Rotavirus infection activates dendritic cells from Peyer’s patches in adult mice. J. Virol. 84, 1856-1866 (2010).

Play Video

Cite This Article
De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer’s Patches. J. Vis. Exp. (73), e50167, doi:10.3791/50167 (2013).

View Video