Isolering og immunfarvning Lymfocytter og dendritiske celler fra murine Peyerske plaks
Summary
Der er en stigende interesse for at forstå de immunologiske funktioner af specifikke subpopulationer af celler i Peyerske plaques (PP), de primære induktive steder af tarm-associerede lymfoide væv. Her skitserer vi parallelle protokoller til fremstilling PP encellede forberedelserne til flowcytometrisk analyse og PP kryosektioner for immunfarvning.
Abstract
Peyerske plaques (PP) er uadskillelige dele af tarmen-associerede lymfoide væv (GALT) og spiller en central rolle i intestinal immunosurveillance og homeostase. Partikelformige antigener og mikrober i det intestinale lumen kontinuerligt samplet af PP M-celler i follicle-associerede epitel (FAE) og transporteres til et underliggende netværk af dendritiske celler (DC'er), makrofager og lymfocytter. I denne artikel beskriver vi protokoller, i hvilke murine PPs er (i) dissocieret til enkeltcelle-suspensioner og underkastet strømningscytometri og (ii) forberedt til cryosectioning og immunfarvning. Til flowcytometri, er PP dissocieret mekanisk og derefter filtreret gennem 70 um membraner til at generere enkeltcelle-suspensioner fri for epitelceller og stort affald. Startende med 20-25 PPs (fra fire mus), den hurtige og reproducerbar metode giver en population af> 2,5 x 10 6 celler med> 90% cellelevedygtighed. For cryosectioning, friskely isolerede PP'er nedsænkes i Optimal Cutting Temperature (OCT) medium, lynfrosset i flydende nitrogen og derefter gennemskåret med et cryomicrotome. Vævssnit (5 til 12 um) er lufttørret, fikseret med acetone eller methanol, og derefter underkastet immunolabeling.
Introduction
Peyerske plaques (PP) er makroskopiske aggregater af organiserede lymfoide follikler stede i hele tyndtarmen hos mennesker og mus (figur 1) og udgør de primære steder, hvor mucosale immunresponser der indledes over diæt antigener, kommensale bakterier, mikrobielle patogener samt orale vacciner 1-4. I modsætning til andre perifere lymfoide væv såsom mesenteriallymfeknuder, mangler PPs afferente lymfekar. Som sådan, adaptive immunrespons hos PP drives som reaktion på antigener afledt fra det intestinale lumen. Udtagning af prøver af luminale antigener opnås det ved follikel-associerede epitel (FAE), som består af både enterocytter og antigen-sampling celler kendt som M-celler. Under FAE, i sub-epithelial kuppel (SED) region ligger et netværk af dendritiske celler (DC'er) blandet sammen med makrofager, B-celler og CD4 + T-celler 5-9. Kernen i hvert PP lymfoide follicle er follikulære dendritceller (FDC'er) og en B-celle-rige centrale germinal center, flankeret af T-celle-rige interfollicular zoner. Antigen prøveudtagning af PP resulterer i udviklingen af IgA + B-celle plasmablasts og CD4 +-effektor-og memory-celler, at frø den omgivende lamina propria og giver immunitet over for en lang række til mucosale angribere.
Dissekere de komplekse immunologiske hændelser, der er forbundet med antigen prøvetagning, behandling og præsentation i PP er en skræmmende opgave, i betragtning af at PP-celler udgør kun en lille brøkdel af de samlede lymfoide celler i tarmslimhinden. Til hjælp i in vitro karakterisering af celler i dette miljø, vi leverer en protokol til fremstilling af total muse PP-celler til flowcytometrisk og funktionel analyse, samt en protokol for at forberede PP kryosektioner for immunfluorescensmikroskopi og immunhistologi. Vores protokol til isolering, karakterisering og immunfarvning af aftalememorandae PP-celler er ikke ny i sig selv, som det fremgår af den kendsgerning, at der er talrige referencer helt tilbage mere end 25 år, der citerer disse teknikker 5,6,9-11. Snarere vores protokol giver en strømlinet (og visuelt) metode for efterforskerne indsamler PPs for første gang. De teknikker, vi beskriver, er let styr og let danner et stort antal celler med> 90% cellelevedygtighed. Den cryosectioning protokol giver meget reproducerbare seriesnit ideelt egnede til immunfluorescensfarvning og konfokal billeddannelse. Desuden er vores protokol supplerer to andre nylige Jupiter artikler. Den første, som Fukuda og kolleger, beskriver anvendelsen af ligerede ileal løkke-assays for at vurdere optagelsen af patogene bakterier ved PP M celler 12. Dels ved Geem og kolleger, beskriver isoleringen og karakteriseringen af DC'er og makrofager fra mus tarmslimhinden, men udelukker udtrykkeligt PPs fra deres analyse 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne artikel har vi givet parallelle protokoller til fremstilling PP encellede forberedelserne til flowcytometrisk og funktionel analyse og kryosektioner for immunfarvning. Begge metoder er meget reproducerbar og let tilgængelig, tilvejebragt et flow-cytometer og kryostat er tilgængelige. For første gang efterforskere skal det påpeges, at i forhold til milten, alt celleudbytter fra PPs er forholdsvis beskedne. Alligevel protokollen vi skitsere generelt udbytter mellem 0,8-1,2 x 10 6 totale PP celler fr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Renjie Song (Wadsworth center Flowcytometri Core) for at få hjælp i celle analyse og Helen Johnson (Wadsworth center Animal Histopatologi Core) til fremstilling af paraffinsnit. Vi takker Dr. Richard A. Cole (Wadsworth center lysmikroskopi Core) for at få hjælp med konfokal mikroskopi og billedsamling. Vi vil gerne anerkende Andy Bentley (Wadsworth Center-billede og Illustration) for at få hjælp med animationer.
MDJ er støttet af Life Sciences Research Foundation, Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Fellowship. SA er understøttet af en Wadsworth Center-Health Research Inc. murene postdoc-stipendium. Dette arbejde blev støttet delvist af NIH tilskud HD061916 og GM082978.
Materials
| Item | Company | Cat. # | Comments (optional) |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| 7x7x5 mm Base Molds | Fisherbrand | 22-363-552 | |
| ImmEdge Pen | Vector Labs | H-4000 | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | 4951 | |
| Edge Rite Blade | Thermo Scientific | 4280L | |
| Anti-Mouse CD11c-PE | eBioscience | 17-0114-82 | |
| Anti-Mouse CD45R/B220-APC | BD Pharmigen | 553092 | |
| Anti-Mouse CD3-FITC | BD Pharmigen | 561798 | |
| Anti-Mouse CD4-PE | BD Pharmigen | 553652 | |
| Anti- Mouse CD8-PE | BD Pharmigen | 553032 | |
| Anti-Mouse CD19-PercP | BioLegend | 115531 | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) without phenol red | Fisher Scientific | 14175-079 | |
| 70 μm cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Spleen Dissociation Medium | Stem Cell Technologies | 7915 | |
| Goat serum | Invitrogen | 16210-072 | |
| Fc Block | ATCC 2.4.G2 | HB-197 | Supes obtained from cell line 2.4.G2 |
| Curved Scissor | F.S.T | 14061-09 | |
| Cryostat | Leica | 3050S | |
| FACS Calibur | BD | ||
| Countess Cell Counter | Invitrogen | ||
| Hematoxylin | Richard Allan | 7211 | |
| Eosin | Richard Allan | 71304 | |
| Formalin | Starplex Scientific | 3661 | |
Table 1. Reagents and equipment used in this study. |
References
- Mantis, N. J., Rol, N., Corthesy, B. Secretory IgA’s complex roles in immunity and mucosal homeostasis in the gut. Mucosal. Immunol. 4, 603-611 (2011).
- Neutra, M., Mantis, N., Kraehenbuhl, J. P. Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissue. Nature Immunology. 2, 1004-1009 (2001).
- Rescigno, M., Sabatino, A. D. i. Dendritic cells in intestinal homeostasis and disease. J. Clin. Invest. 119, 2441-2450 (2009).
- Suzuki, K., Kawamoto, S., Maruya, M., Fagarasan, S. GALT: organization and dynamics leading to IgA synthesis. Adv. Immunol. 107, 153-185 (2010).
- Iwasaki, A., Kelsall, B. L. Localization of distinct Peyer’s patch dendritic cell subsets and their recruitment by chemokines macrophage inflammatory protein (MIP)-3alpha, MIP-3beta, and secondary lymphoid organ chemokine. Journal of Experimental Medicine. 191, 1381-1394 (2000).
- Iwasaki, A. Mucosal dendritic cells. Annu. Rev. Immunol. 25, 381-418 (2007).
- Lelouard, H., Fallet, M., de Bovis, B., Meresse, S., Gorvel, J. P. Peyer’s Patch Dendritic Cells Sample Antigens by Extending Dendrites Through M Cell-Specific Transcellular Pores. Gastroenterology. 42, 592-601 (2011).
- Lelouard, H., et al. Pathogenic bacteria and dead cells are internalized by a unique subset of Peyer’s patch dendritic cells that express lysozyme. Gastroenterology. 138, 173-184 (2010).
- Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer’s patches. Infect. Immun. 71, 504-509 (2003).
- Favre, L., Spertini, F., Corthesy, B. Secretory IgA possesses intrinsic modulatory properties stimulating mucosal and systemic immune responses. J. Immunol. 175, 2793-2800 (2005).
- Kelsall, B. L., Strober, W. Distinct populations of dendritic cells are present in the subepithelial dome and T cell regions of the murine Peyer’s patch. J. Exp. Med. 183, 237-247 (1996).
- Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer’s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. J. Vis. Exp. (58), e3225 (2011).
- Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine. J. Vis. Exp. (63), e4040 (2012).
- Lopez-Guerrero, D. V., et al. Rotavirus infection activates dendritic cells from Peyer’s patches in adult mice. J. Virol. 84, 1856-1866 (2010).
