Isolera och immunofärgning Lymfocyter och dendritiska celler från murina Peyers plack
Summary
Det finns ett ökande intresse för att förstå de immunologiska funktioner specifika subpopulationer av celler i Peyers plack (PP), de primära induktiva platser av tarmar-associerade lymfoida vävnader. Här redogör vi för parallella protokoll för beredning PP encelliga förberedelserna för flödescytometrisk analys och PP kryosnitt för immunfärgning.
Abstract
Peyers plack (PP) är integrerade delar av tarmen-associerade lymfoida vävnader (GALT) och spelar en central roll i tarmen immunosurveillance och homeostas. Partikelformiga antigener och mikrober i tarmlumen kontinuerligt samplas av PP M-celler i follikel-associerade epitel (FAE) och transporteras till ett underliggande nätverk av dendritiska celler (DC), makrofager och lymfocyter. I den här artikeln beskriver vi protokoll där murina köpkraftsstandarder (i) dissocieras till enkelcellsuspensioner och utsattes för flödescytometri och (ii) beredd på cryosectioning och immunfärgning. För flödescytometri, PP är dissocierades mekaniskt och filtrerades sedan genom 70 um membran för att generera enkelcellsuspensioner fria från epitelceller och stora skräp. Starta med 20-25 PP (från fyra möss), ger detta snabb och reproducerbar metod en population av> 2,5 x 10 6 celler med> 90% cellviabilitet. För cryosectioning, färskaly isolerade PP är nedsänkta i Optimal Cutting Temperature (oktober) medium snabbfrystes i flytande kväve och sedan sektioneras med en cryomicrotome. Vävnadssnitt (5-12 pm) är luft-torkades, fixerades med aceton eller metanol, och utsattes sedan för immunomärkning.
Introduction
Peyers plack (PP) är makroskopiska aggregat av organiserade lymfoida folliklar som finns i hela tunntarmen hos människor och möss (Figur 1) och utgör de primära platser där slemhinnan immunsvar inleds mot kosten antigener, bakteriefloran, mikrobiella patogener och orala vacciner 1-4. Till skillnad från andra perifera lymfoida vävnader såsom kröslymfknutor PP saknar afferenta lymfkärlen. Som sådana, adaptiva immunsvar i PP drivs som svar på antigener härledda från tarmlumen. Provtagningen av luminala antigener åstadkommes den genom follikelstimulerande associerade epitel (FAE), vilket består av både enterocyter och antigen-provtagning celler kända som M-celler. Under FAE, i sub-epiteliala kupol (SED) regionen, ligger ett nätverk av dendritiska celler (DC) blandade med makrofager, B-celler och CD4 + T-celler 5-9. Kärnan i varje PP lymfoid follicle är follikulära dendritiska celler (FDC) och en B-cell-rika centrala germinal center, flankerad av T-cell-rika interfollikulära zoner. Antigen provtagning av PPS resulterar i utvecklingen av IgA + B-celler plasmablasts och CD4 + effektor och minnesceller att utsäde omgivande lamina propria och ge immunitet mot en rad till slemhinnor inkräktare.
Dissekera de komplexa immunologiska händelser som är associerade med antigen provtagning, behandling och presentation i PPS är en svår uppgift med tanke på att PP celler utgör bara en liten del av de totala lymfoida celler i tarmslemhinnan. För att underlätta in vitro karaktärisering av celler i denna miljö ger vi ett protokoll för beredning totala mus PP celler för flödescytometrisk och funktionell analys, samt ett protokoll för att förbereda PP kryosnitt för immunofluorescensmikroskopi och immunhistologi. Vår protokoll för isolering, karakterisering och immunfärgning av samförståndsavtale PP celler är inte ny i sig, vilket framgår av det faktum att det finns många referenser som går tillbaka mer än 25 år som citerar dessa tekniker 5,6,9-11. Snarare ger vår protokollet en strömlinjeformad (och visuell) metod för utredarna samlar PP för första gången. Teknikerna vi beskriver lätt bemästras och lätt ge stora antal celler med> 90% cellviabilitet. Den cryosectioning Protokollet ger mycket reproducerbara seriella sektioner idealiskt lämpade för immunofluorescensfärgning och konfokal avbildning. Dessutom kompletterar vårt protokoll två andra nya Jove artiklar. Den första av Fukuda och kollegor, beskriver användningen av ligerade ileal loop analyser för att bedöma upptag av patogena bakterier genom PP M-celler 12. Den andra, som Geem och kollegor, beskriver isolering och karaktärisering av DCS och makrofager från mus tarmslemhinnan, men uttryckligen utesluter PP från deras analys 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
I den här artikeln har vi tillhandahållit parallella protokoll för beredning PP encelliga förberedelser för flödescytometrisk och funktionell analys och kryosnitt för immunfärgning. Båda metoderna är mycket reproducerbara och lätt åtkomliga, tillhandahålls en flödescytometer och kryostat finns tillgängliga. För första gången utredare bör påpekas att jämfört med mjälte, totalt cellutbyten från PP är relativt magert. Trots protokollet vi beskriva allmänhet ger mellan 0,8-1,2 x 10 6 tot…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Renjie Song (Wadsworth Center flödescytometri Core) för att få hjälp i cell analys och Helen Johnson (Wadsworth Center Animal Histopathology Core) för beredning av paraffinsektioner. Vi tackar Dr Richard A. Cole (Wadsworth Center Ljus Mikroskopi Core) för hjälp med konfokalmikroskopi och bildsamling. Vi vill tacka för Andy Bentley (Wadsworth Center-bild och illustration) för att få hjälp med animationer.
MDJ stöds av Life Sciences Research Foundation, Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Fellowship. SA stöds av en Wadsworth Center-Health Research Inc. Intramural postdoktorsstipendium. Detta arbete stöddes delvis av NIH bidrag HD061916 och GM082978.
Materials
| Item | Company | Cat. # | Comments (optional) |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| 7x7x5 mm Base Molds | Fisherbrand | 22-363-552 | |
| ImmEdge Pen | Vector Labs | H-4000 | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | 4951 | |
| Edge Rite Blade | Thermo Scientific | 4280L | |
| Anti-Mouse CD11c-PE | eBioscience | 17-0114-82 | |
| Anti-Mouse CD45R/B220-APC | BD Pharmigen | 553092 | |
| Anti-Mouse CD3-FITC | BD Pharmigen | 561798 | |
| Anti-Mouse CD4-PE | BD Pharmigen | 553652 | |
| Anti- Mouse CD8-PE | BD Pharmigen | 553032 | |
| Anti-Mouse CD19-PercP | BioLegend | 115531 | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) without phenol red | Fisher Scientific | 14175-079 | |
| 70 μm cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Spleen Dissociation Medium | Stem Cell Technologies | 7915 | |
| Goat serum | Invitrogen | 16210-072 | |
| Fc Block | ATCC 2.4.G2 | HB-197 | Supes obtained from cell line 2.4.G2 |
| Curved Scissor | F.S.T | 14061-09 | |
| Cryostat | Leica | 3050S | |
| FACS Calibur | BD | ||
| Countess Cell Counter | Invitrogen | ||
| Hematoxylin | Richard Allan | 7211 | |
| Eosin | Richard Allan | 71304 | |
| Formalin | Starplex Scientific | 3661 | |
Table 1. Reagents and equipment used in this study. |
References
- Mantis, N. J., Rol, N., Corthesy, B. Secretory IgA’s complex roles in immunity and mucosal homeostasis in the gut. Mucosal. Immunol. 4, 603-611 (2011).
- Neutra, M., Mantis, N., Kraehenbuhl, J. P. Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissue. Nature Immunology. 2, 1004-1009 (2001).
- Rescigno, M., Sabatino, A. D. i. Dendritic cells in intestinal homeostasis and disease. J. Clin. Invest. 119, 2441-2450 (2009).
- Suzuki, K., Kawamoto, S., Maruya, M., Fagarasan, S. GALT: organization and dynamics leading to IgA synthesis. Adv. Immunol. 107, 153-185 (2010).
- Iwasaki, A., Kelsall, B. L. Localization of distinct Peyer’s patch dendritic cell subsets and their recruitment by chemokines macrophage inflammatory protein (MIP)-3alpha, MIP-3beta, and secondary lymphoid organ chemokine. Journal of Experimental Medicine. 191, 1381-1394 (2000).
- Iwasaki, A. Mucosal dendritic cells. Annu. Rev. Immunol. 25, 381-418 (2007).
- Lelouard, H., Fallet, M., de Bovis, B., Meresse, S., Gorvel, J. P. Peyer’s Patch Dendritic Cells Sample Antigens by Extending Dendrites Through M Cell-Specific Transcellular Pores. Gastroenterology. 42, 592-601 (2011).
- Lelouard, H., et al. Pathogenic bacteria and dead cells are internalized by a unique subset of Peyer’s patch dendritic cells that express lysozyme. Gastroenterology. 138, 173-184 (2010).
- Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer’s patches. Infect. Immun. 71, 504-509 (2003).
- Favre, L., Spertini, F., Corthesy, B. Secretory IgA possesses intrinsic modulatory properties stimulating mucosal and systemic immune responses. J. Immunol. 175, 2793-2800 (2005).
- Kelsall, B. L., Strober, W. Distinct populations of dendritic cells are present in the subepithelial dome and T cell regions of the murine Peyer’s patch. J. Exp. Med. 183, 237-247 (1996).
- Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer’s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. J. Vis. Exp. (58), e3225 (2011).
- Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine. J. Vis. Exp. (63), e4040 (2012).
- Lopez-Guerrero, D. V., et al. Rotavirus infection activates dendritic cells from Peyer’s patches in adult mice. J. Virol. 84, 1856-1866 (2010).
