Bilaterale carotis occlusie combinatie met systemische hypotensie produceert wereldwijde hersenen ischemie in de rat, met schade aan de hippocampus met reproduceerbare ernst. Proefdieren worden verminderd met voorspelbare patronen van hersenbeschadiging, ze herstellen doelmatig en sterftecijfers zijn relatief laag.
Hartstilstand gevolgd door reanimatie resulteert vaak in dramatische hersenschade veroorzaakt door ischemie en daaropvolgende reperfusie van de hersenen. Wereldbrein ischemie schade veroorzaakt specifieke hersengebieden getoond dat zeer gevoelig voor ischemie 1. Hippocampale neuronen hogere gevoeligheid voor ischemische beledigingen vergelijking met andere celpopulaties, en specifiek, het CA1 gebied van de hippocampus is bijzonder kwetsbaar voor ischemie / reperfusie 2.
Het ontwerp van therapeutische interventies of studie van mechanismen betrokken bij hersenschade vereist een model dat soortgelijke schade de klinische toestand en reproduceerbare wijze produceert. Bilaterale carotis vatocclusie met hypotensie (2VOH) is een model dat reversibele voorhersenen ischemie produceert, emuleren de cerebrale gebeurtenissen die kunnen optreden tijdens een hartstilstand en reanimatie. We beschrijven een model modificatie van Smith et al.. (1984) 2, Zoals eerst gepresenteerd in zijn huidige vorm Sanderson et al.. (2008) 3, die reproduceerbaar letsel veroorzaakt selectief kwetsbare hersengebieden 3-6. De betrouwbaarheid van het model wordt bepaald door nauwkeurige controle van de systemische bloeddruk tijdens toegepast hypotensie, de duur van de ischemie, scherpe temperatuurcontrole, een specifiek regime anesthesie en ijverig post-operatieve zorg. 8 minuten ischemie veroorzaakt celdood van CA1 hippocampale neuronen die in de loop van 6 tot 24 uur reperfusie vordert, terwijl minder kwetsbare hersenengebieden gespaard. Deze progressieve celdood gemakkelijk gekwantificeerd na 7-14 dagen na reperfusie, als een bijna volledig verlies van CA1 neuronen blijkt op dit moment.
Daarnaast hersentraumamodel presenteren we een werkwijze voor het CA1 schadekwantificatie op eenvoudige, maar grondige, methodologie. Belangrijk is dat kwantificering worden bereikt met behulp van een eenvoudige camera gemonteerde microscoop, eenda gratis ImageJ (NIH) software plugin, wegnemen van de noodzaak voor de kosten prohibitief stereology software programma's en een gemotoriseerde microscopische podium voor de beoordeling van schade.
Hersenletsel als gevolg van een hartstilstand en beroerte is een belangrijke doodsoorzaak en langdurige arbeidsongeschiktheid. Terwijl reanimatie van slachtoffers van hartstilstand lukt herstellen spontane circulatie bij ongeveer 70.000 patiënten per jaar in de Verenigde Staten 7,8 tenminste 60% van deze patiënten later sterven in het ziekenhuis als resultaat van uitgebreide hersenbeschadiging en slechts 3-10% van gereanimeerd patiënten kunnen hun vroegere levensstijl te hervatten 9,10. Duidelijk, het begrijpen van de mechanismen die leiden tot hersenbeschadiging na globale ischemie van de hersenen en het ontwerpen van therapeutische interventies om neurologische trauma te minimaliseren is het van cruciaal belang is.
Hersenischemie gemodelleerd worden gebruik meerdere methoden. Meestal wordt hersenischemie geproduceerd bij knaagdieren door afsluiten van een belangrijke bloedvat in de hersenen, de middelste cerebrale slagader, waardoor een focale ischemische beroerte 11,12 produceren. Hoewel klinisch belangrijke,focale hersenischemie geen nauwkeurige methode van hersenbeschadiging door hartstilstand / reanimatie bestuderen. Om deze klinische paradigma model het volledige hersenen dient te geschieden ischemische gevolgd door herintroductie van de bloedstroom. Om deze klinische presentatie na te bootsen, onderzoekers experimenteel induceren hartstilstand gevolgd door reanimatie met reanimatie en defibrillatie 13,14. Dit model is klinisch relevant, kan echter onvoorspelbaar reanimatie malen te verhogen variabiliteit en kan data-analyse moeilijk te interpreteren. Tevens wordt dit model geassocieerd met een hoge mortaliteit, een verdere verhoging dier benodigd zijn om een hypothese te testen. Onderzoek van de cerebrale reactie op globale ischemie en / of reperfusie in een reproduceerbare consistente en survivable insult de voorkeur.
Globale ischemie kan worden geïnduceerd in de hersenen, terwijl sommige bloedstroom behoud systemisch. Dit vermindert sterfte, terwijl investigation van de mechanismen van weefselbeschadiging in de hersenen 2. Om wereldbrein ischemie produceren, is het noodzakelijk te onderbreken of aanzienlijk te beperken stroming in alle vier vaten die de hersenen, het interne halsslagaders en vertebrale slagaders leveren. Deze schepen leveren de hersenen met de bloedstroom door een vasculaire structuur genaamd de cirkel van Willis, die een anastomotische lus vormt. Deze vasculaire architectuur kan de hersenen perfusie bij proximale vasculaire occlusie behouden. Daarom, om volledig ischemie van de hersenen, de doorbloeding te induceren door alle bijdragende vaartuigen moeten plaatsvinden. Occlusie van de halsslagader kan worden bereikt met behulp van een minimaal invasieve ventrale nek cut-down en toepassing van aneurysma clips voor een gewenste periode. Onderbreking van de bloedstroom via de vertebrale slagaders kan moeilijk zijn, omdat ze incased in de dwarsrichting foramen van de wervelkolom. Onderzoekers hebben dit voorafgaand aan de halsslagader aangepakt door electrocauterizing de vertebrale slagaders 24-48 uurocclusie en ischemie van de hersenen (4VO model) 15. In tegenstelling tot deze aanpak, Smith et al.. Ontwikkelden een werkwijze voor het induceren globale hersenischemie doordat de gemiddelde arteriële bloeddruk (MAP) systemisch aan 40 mmHg perfusie te verminderen door de vertebrale slagaders naar een punt waar de bloedstroom wordt verloren of sterk verminderd 2 . In combinatie met carotis occlusie, produceert deze methode ischemie in de voorhersenen, waardoor een patroon van hersenbeschadiging die nabootst die van hartstilstand overlevenden. In een verdere verfijning van deze methode, het model hier geïntroduceerde vereist strak MAP regeling op 30 mmHg ± 1mHg gedurende de gehele 8 min ischemie. We vonden deze wijziging verbetert de reproduceerbaarheid van hersenletsel veroorzaakt door dit model met behoud van het lage sterftecijfer van de oorspronkelijke techniek ontworpen door Smith et al..
De precieze fenotype van celdood en totale mate van weefselschade doorde hier gepresenteerde model zijn direct afhankelijk van ischemische duur 16. Na 8 min ischemie, CA1 neuronen vertonen vertraagde celdood, suggereert dat er een tijdelijk venster voor therapeutische interventie in de reperfusiefase 15,17. Bij het begin van reperfusie, neuronen snel weer functie en geen directe celdood detecteerbaar 18. Deze belediging veroorzaakt echter inductie van celdood cascades (apoptose) die culmineren in afgifte van apoptotische eiwitten uit mitochondriën, waaronder cytochroom c, tussen 4-6 uur van reperfusie 3,19. Tussen 6 en 24 uur van reperfusie, hebben neuronen van de hippocampus CA1 inzetten voor cel ondergang, en de apoptotische celdood programma wordt uitgevoerd 19. Opgemerkt wordt dat celdood fenotype verantwoordelijk voor ischemische schade zeer controversieel. Vroege studies hebben gesuggereerd necrose is de primaire celdood fenotype 20,21, terwijl andere anderen melden apoptosis als het voornaamste mechanisme 22,23. In totaal, de huidige gegevens suggereren dat cellen sterven van een spectrum van celdood fenotypes variërend van klassiek apoptose tot necrose. De specifieke wijze van celdood is afhankelijk van vele factoren, met de mogelijke bijdrage van elke fenotype afhankelijk van de ernst van de belediging, onder andere factoren 24,25. Door 24 uur van reperfusie, stervende cellen bezitten pyknotische kernen, gecondenseerde cytosol met duidelijk bewijs van geaggregeerde cellulaire inhoud, en het verlies van functionele mitochondriale morfologie. Dode cellen worden verder onderverdeeld, opgeslokt door immuuncellen, zoals macrofagen en / of de microglia, en gewist uit de CA1 hippocampus regio. Door het 4-7 dagen van reperfusie, worden dode cellen verwijderd, en alles wat overblijft zijn ontstekingscellen en geactiveerde gliacellen 17,26. Derhalve 7 dagen reperfusie vertegenwoordigt een optimale tijd waar hippocampale CA1 neuronale dood kan worden gekwantificeerd met behulp van eenvoudige, niet-specifieke cel vlekken inclusief Cresyl violet of hemotoxyline-eosine en geteld op basis van criteria morfologische insluiting. Nog op dit late reperfusie interval cellen kunnen worden geteld als overlevende cellen, waardoor een index van hersenbeschadiging.
Indien dit model wordt gebruikt om therapeutische interventies te testen, wordt voorgesteld dat de proefopzet volgen TRAPPEN criteria (Stroke Therapy Academic Industrie Roundtable) 27. Deze richtsnoeren moeten worden gevolgd bij het ontwerpen en uitvoeren van een onderzoek, worden echter niet besproken.
Het beschreven model produceert een ischemisch insult de hersenen die kan optreden als gevolg van een hartstilstand en reanimatie, die een verwonding vergelijkbaar met die bij mensen. Deze werkwijze voor het produceren wereldbrein ischemie is een van meerdere protocollen. We maken gebruik van dit protocol vooral voor haar relatief lage sterfte, sneller herstel, en reproduceerbare resultaten. De hartstilstand / reanimatie-model is waarschijnlijk de meest klinisch relevante model, maar technisch de moeilijkste om voortdur…
The authors have nothing to disclose.
Material Name | |||
5-0 VICRYL suture, reverse cutting | Ethicon | J391H | |
Scalpel, No.10 | Swann-Morton | 6601 | |
Gauze Sponges | Fisher | 22-362-178 | |
18G x 1 ½ in needle | BD | 305201 | |
23G x 1 in needle | BD | 305145 | |
26 G x 3/8 in needle | BD | 305110 | |
18 G x 1 ¼ catheter | EXEL | 26735 | |
1 ml syringe | BD | 309659 | |
10 ml syringe | BD | 309604 | |
60 ml syringe | BD | 309653 | |
Surgilube | Henry Schein | 1152666 | |
.9% Saline, plastic IV bag | Henry Schein | 1537468 | |
Suture 3-0 Silk | Henry Schein | 1007842 | |
Puralube Ophthalmic Ointment | Henry Schein | 3390017 | |
Betadine | Henry Schein | 6903564 | |
Sterile Towel Drape | Moore Medical | 14170 | |
Polyethylene Tubing, 50 | Intramedic | 427411 | |
Stopcock, 3 way | Smiths medical | MX9311L | |
Drug Name | |||
AERRANE (isoflurane) | Henry Schein | 2091966 | |
Mapap Liquid (Tylenol) | Major Pharmaceuticals | 1556 | |
Kedavet (ketamine) | Ketathesia Butney | NDC 50989-996-06 | |
Butorphic (butorphanol) | Lloyd Labs | 4881 | |
Heparin | APP Pharmaceuticals | 504011 | |
Chemical Name | |||
Paraformaldehyde prills | Elecron Microscopy Sci. | 19202 | |
2-methylbutane | Sigma | 270342 | |
Cresyl Violet Acetate | Sigma | C5042 | |
Sucrose | Sigma | S9378 | |
Software | |||
ImageJ | NIH |