Summary
Oclusão carotídea bilateral juntamente com hipotensão sistêmica produz isquemia cerebral em ratos, resultando em danos ao hipocampo com gravidade reproduzível. Assuntos animais são prejudicados com padrões previsíveis de danos cerebrais, eles se recuperam expediente, e as taxas de mortalidade são comparativamente baixas.
Abstract
Parada cardíaca seguido de reposição muitas vezes resulta em danos cerebrais dramática causada por isquemia e reperfusão posterior do cérebro. Isquemia cerebral global produz dano para regiões específicas do cérebro revelaram estar altamente sensíveis à isquemia 1. Neurónios do hipocampo têm maior sensibilidade a insultos isquémicos em comparação a outras populações de células, e, especificamente, na região CA1 do hipocampo, é particularmente vulnerável a lesão de isquemia / reperfusão 2.
O desenho das intervenções terapêuticas, ou estudo dos mecanismos envolvidos nos danos cerebrais, exige um modelo que produz danos similares aos do estado clínico e de uma forma reproduzível. Oclusão do vaso carótida bilateral com hipotensão (2VOH) é um modelo que produz isquemia do prosencéfalo reversível, emulando os eventos cerebrais que podem ocorrer durante a parada cardíaca e ressuscitação. Descrevemos aqui um modelo modificado de Smith et ai. (1984) 2, Como apresentado pela primeira vez em sua forma atual em Sanderson et al. (2008) 3, que gera lesão reprodutível para seletivamente regiões cerebrais vulneráveis 3-6. A confiabilidade deste modelo é ditada pelo controle preciso da pressão arterial sistêmica durante hipotensão aplicada, o tempo de isquemia, controle de temperatura perto, um regime de anestesia específico, e diligente cuidados pós-operatórios. Um insulto isquémico 8 minutos produz a morte celular dos neurónios CA1 do hipocampo, que progride ao longo de 6 a 24 horas de reperfusão, enquanto que as regiões do cérebro menos vulneráveis são poupados. Esta morte celular progressiva é facilmente quantificada após 7-14 dias após reperfusão, com uma perda quase total de neurónios CA1 é evidente nesta altura.
Em adição a este modelo de lesão cerebral, apresentamos um método para quantificação de dano CA1 usando um método simples, mas completa, a metodologia. Importante, a quantificação pode ser realizada utilizando um microscópio de câmara simples montado, umada livre ImageJ (NIH) plug-in de software, eliminando a necessidade de programas de software estereologia custo proibitivo e um palco motorizado microscópica para avaliação dos danos.
Introduction
Dano cerebral em conseqüência de parada cardíaca e acidente vascular cerebral é a principal causa de morte e incapacidade a longo prazo. Enquanto ressuscitação cardiopulmonar para vítimas de parada cardíaca consegue restaurar a circulação espontânea em cerca de 70 mil pacientes por ano em os EUA 7,8 pelo menos 60% desses pacientes morrem posteriormente no hospital, como resultado de extensa lesão cerebral e apenas 3-10% dos pacientes reanimados pode retomar seus antigos estilos de vida 9,10. Claramente, a compreensão dos mecanismos que levam a danos cerebrais após isquemia cerebral global e planejamento de intervenções terapêuticas para minimizar o trauma neurológico é de importância crítica.
A isquemia cerebral pode ser modelado utilizando vários métodos. Mais vulgarmente, a isquemia cerebral é produzida no roedor, ocluindo um grande vaso sanguíneo no cérebro, a artéria cerebral média, produzindo, assim, um acidente vascular cerebral isquémico focal 11,12. Embora clinicamente importante,isquemia cerebral focal não é um método preciso para estudar danos cerebrais produzidos pela prisão / reanimação cardíaca. Para modelar este paradigma clínico todo o cérebro deve ser feita isquêmica seguido de reintrodução do fluxo sanguíneo. Para imitar de perto esta apresentação clínica, os investigadores experimentalmente induzir parada cardíaca seguida de reanimação com CPR e desfibrilação 13,14. Este modelo é clinicamente relevante, os tempos de ressuscitação entanto imprevisíveis podem aumentar a variabilidade e análise dos dados pode tornar difícil de interpretar. Além disso, este modelo está associado a uma taxa de mortalidade elevada, aumentando ainda mais o número necessário para testar uma hipótese animal. Investigação da resposta a isquemia cerebral global e / ou reperfusão num insulto mais reprodutível, consistente e sobrevivência podem ser preferidos.
Isquemia global pode ser induzida no cérebro enquanto preserva alguma circulação sanguínea sistémica. Isto reduz a mortalidade, enquanto permite Investigation dos mecanismos de danos nos tecidos no cérebro 2. Para produzir a isquemia global do cérebro, que é necessário para interromper ou limitar o fluxo grandemente em todos os quatro vasos que alimentam o cérebro, as artérias carótida interna e artérias vertebrais. Estas embarcações abastecer o cérebro com o fluxo de sangue através de uma estrutura vascular chamado Círculo de Willis, que faz um loop anastomose. Esta arquitectura permite que o cérebro vascular para manter a perfusão no caso de oclusão vascular proximal. Portanto, para induzir isquemia completo do cérebro, o fluxo de sangue através dos vasos contributivo deve ocorrer. A oclusão da artéria carótida interna pode ser realizada utilizando um pescoço ventral minimamente invasivo de corte para baixo e de aplicação de clipes aneurisma durante um período desejado. A interrupção do fluxo de sangue através das artérias vertebrais, pode ser difícil, uma vez que são encaixada no forame transversal da coluna vertebral. Investigadores têm abordado este por electrocauterizing as artérias vertebrais 24-48 h antes da carótidaoclusão e isquemia cerebral (modelo 4VO) 15. Em contraste com esta abordagem, Smith et ai. Desenvolveu um método de indução de isquemia cerebral global reduzindo a pressão arterial média (PAM) sistemicamente a 40 mmHg, para reduzir a perfusão através das artérias vertebrais, para um ponto onde o fluxo de sangue é perdido muito reduzida ou dois . Quando combinada com a oclusão da carótida, este método produz ao longo da isquemia do prosencéfalo, resultando num padrão de dano cerebral que imita o de sobreviventes de paragem cardíaca. Num outro aperfeiçoamento deste método, o modelo que aqui apresentamos requer regulação apertada MAP em 30 mmHg ± 1mHg durante toda a 8 minutos de isquemia. Encontramos esta alteração melhora a reprodutibilidade de dano cerebral induzido por este modelo, preservando a baixa taxa de mortalidade da técnica original desenhado por Smith et al.
O fenótipo precisa da morte celular e da extensão total do dano tecidual causado pelao modelo apresentado aqui são diretamente dependentes da duração isquêmica 16. Após 8 minutos de isquemia, neurónios CA1 exibem retardada de morte celular, sugerindo que existe uma janela temporal para a intervenção terapêutica, durante a fase de reperfusão 15,17. No início da reperfusão, os neurónios rapidamente recuperar a função de morte celular e não é detectável 18 imediato. No entanto, este insulto provoca indução de cascatas de morte celular (apoptose) que culminam na liberação de proteínas apoptogénica de mitocôndrias, incluindo o citocromo c, entre 4-6 horas de reperfusão 3,19. Entre 6 e 24 horas de reperfusão, os neurônios CA1 do hipocampo se comprometeram a morte celular, eo programa de morte celular por apoptose é executado 19. Deve notar-se que o fenótipo de morte celular responsável pela lesão isquémica é altamente controversa. Estudos anteriores sugeriram que a necrose é a morte celular primário fenótipo 20,21, enquanto outros outros relatam apoptosis como o principal mecanismo 22,23. No total, as evidências atuais sugerem que as células morrem de um espectro de fenótipos de morte celular que variam de apoptose clássico à necrose. O modo específico de morte de células está dependente de muitos factores, com o grau de contribuição de cada fenótipo dependendo da gravidade da lesão, entre outros factores 24,25. Por 24 horas de reperfusão, as células morrem possuem núcleos picnóticos, citoplasma condensado com clara evidência de conteúdo celular agregados e perda de morfologia mitocondrial funcional. As células mortas são subdivididas, tragado por células do sistema imunológico, como os macrófagos e / ou micróglia e limpa da região CA1 do hipocampo. Por 4-7 dias de reperfusão, as células mortas são removidas, e tudo o que resta são as células inflamatórias e ativado células gliais 17,26. Portanto, 7 dias de reperfusão representa um momento ideal CA1 do hipocampo, onde a morte neuronal pode ser quantificado usando, manchas de células não-específicos simples eminclusive violeta Cresyl ou hemotoxilina-eosina e contou com base em critérios de inclusão morfológicas. As células remanescentes no final deste intervalo de reperfusão pode ser contado como células sobreviventes, proporcionando assim um índice de danos cerebrais.
Se este modelo é para ser utilizado para testar intervenções terapêuticas, sugere-se que o projeto experimental seguir critérios Stair (Curso Terapia Indústria Acadêmico Roundtable) 27. Essas diretrizes devem ser seguidas na concepção e realização de um estudo, no entanto, não são discutidos aqui.
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Protocol
1. Preparação
Todos os experimentos com animais devem estar em conformidade com as diretrizes institucionais e receber a aprovação por um respectivo comitê de cuidados com os animais antes do início. Todos os procedimentos aqui apresentados foram aprovados pela Wayne State University Institutional Animal Care e do Comitê Use e siga as orientações sobre o tratamento ético dos animais, como colocar diante do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e aos Princípios do Governo dos EUA para o utilização e cuidados dos animais vertebrados utilizados em testes, Pesquisa e Treinamento. Antes de iniciar a cirurgia, preparar o material cirúrgico necessário e uma gaiola de recuperação da cirurgia. Este procedimento é uma cirurgia de sobrevivência e, portanto, que é necessário para a prática de técnicas de esterilização.
- Para fazer um cateter vascular, corte um comprimento de 8 polegadas de polietileno de 50 (PE50) tubulação e inserir uma agulha de calibre 23 embotada em uma das extremidades. Os cateteres podem ser comprados individualmente pré-esterilizados ou comprado em bulk e depois esterilizado com etileno-glicol, conforme necessário.
- Proteger esta agulha para uma porta de uma torneira de três vias e colocar outra torneira de três vias na porta oposta. Heparinizar as torneiras e cateter através da execução de solução salina através de heparina. Ligue uma seringa de 10 ml solução salina para a torneira perpendicular e distal ao cateter. Ligação a torneira distal do cateter ao transdutor de pressão no tubo, encher o sistema com solução salina e remover quaisquer bolhas de ar.
- Configure a gaiola de recuperação, de acordo com regulamentação do uso de animais. A sala de recuperação deveria ser silencioso e ter baixo tráfego. Transformar importantes na mesa downdraft ou sistema de eliminação de gás semelhante antes da cirurgia início para filtrar isoflurano vaporizado.
2. Preparação cirúrgica
Ratos Sprague-Dawley (300-350 g) são utilizados no modelo de isquemia global 2VOH prosencéfalo. A anestesia é induzida e mantida com isoflurano e supcomplementado com uma dose sub-dissociativo de cetamina. Temos observado que a anestesia mantida pelo isoflurano só provoca um aumento da ocorrência de apreensão durante a recuperação pós-operatória. As convulsões podem contribuir para a lesão neural e mortalidade, o que irá impactar a reprodutibilidade deste modelo. Completando a anestesia com cetamina permite uma dose mais baixa de isoflurano para chegar a um grau cirúrgico de anestesia. Usando um cobertor térmico homeostático permite uma regulação rigorosa da temperatura central. O procedimento cirúrgico envolve artéria carótida de corte para baixo e de isolamento, e a artéria femoral de corte para baixo e canulação.
NOTA É importante manter registros detalhados durante cada procedimento cirúrgico individual. As alterações de temperatura do núcleo, a pressão sanguínea, ou outras variáveis fisiológicas que ocorrem antes ou durante a cirurgia podem alterar drasticamente os resultados, e os registos podem ser analisados para assegurar a coerência processual entre indivíduos e grupos. Consistêncianos parâmetros fisiológicos do animal pode ser melhorada através do jejum, os animais antes da cirurgia. Experimentadores são encorajados a determinar o método que resulta na mais consistentes hemodinâmica pré-operados e concentração de glicose no soro para seus estudos.
- Induzir a anestesia por colocação do rato a uma câmara de indução e encher com uma oxygen/70% de mistura de óxido nitroso a 30% a 5% de isoflurano. Entubar com um cateter de calibre 12, utilizando um laringoscópio roedores e ventilar, com 30% oxygen/70% mistura de óxido nitroso, com 2,5% de isoflurano. Taxa de ventilação deve ser de 80 respirações por minuto em 2,5 ml por respiração.
- Submeter uma injecção intra-peritoneal de cetamina (20 mg / kg) em solução salina e reduzir isoflurano a 1,5%. IMPORTANTES É imperativo para monitorar o nível de anestesia ao longo do processo para assegurar plano cirúrgico de anestesia adequada. Para verificar a profundidade da anestesia, pitada entre os dígitos hind-membros, enquanto monitora pedal reflexo. Se o reflexo éausente, a anestesia é adequada. Após canulação da artéria femoral, da pressão arterial pode ser utilizada como um indicador do nível de anestesia. Manter a dose de isoflurano, tão baixa quanto possível mantendo ao mesmo tempo um plano cirúrgico de anestesia, para minimizar o potencial de convulsões pós-isquémicos.
- As incisões serão feitas no pescoço e na área pélvica. Shave do pescoço e da pelve para a direita, onde a coxa se encontra com o abdômen. Oriente o rato em decúbito dorsal sobre a homeostático thermo-cobertor e coloque o termômetro retal usando lubrificante cirúrgico. Aplique lubrificante protetora dos olhos. Uma lâmpada de 60 watts pode ajudar a regular a temperatura. A lâmpada nunca deve ser mais do que oito polegadas a partir do animal. IMPORTANTES temperaturas acima ou abaixo da temperatura fisiológica normal (37 ° C) pode influenciar muito dano final neurológica. Manter a temperatura interna a 37 ° C ± 0,5 ° C.
- Esfregue as áreas de incisão com betadine e enxágüe com etanol 70%. Repita este two Mais vezes. Coloque um campo cirúrgico sobre o rato, e cortar orifícios para expor as áreas de incisão. Artérias carótidas e femoral IMPORTANTES pode ser isolado sem causar trauma na musculatura circundante, o que vai melhorar a recuperação e minimizada a subsequente necessidade de analgesia pós-operatória.
- Pendente anestesia adequada, usar um No. 10 bisturi para fazer uma incisão na linha média ao longo do pescoço e, em seguida, utilizando-se pinças hemostáticas bruscamente dissecar entre as glândulas salivares, até atingir o músculo esterno, na linha média do grupo muscular proeminente cobrindo a traqueia. Novamente usando cuidadosa técnica de dissecção romba, separe os principais grupos musculares do esterno do esternomastoideu, bilateralmente. Estes dois grupos musculares formar um recorte triangular, que pode ser usada como um ponto de referência para localizar o feixe neurovascular que contém a artéria carótida. Os ramos da carótida comum para as artérias carótidas interna e externa. Isolar a artéria carótida comum proximal ao bibifurcação.
- Suavemente separar estes dois músculos e localizar a artéria carótida. Para ajudar a identificar este olhar navio para um pulso. Isolar as artérias carótidas de ambos os lados por meio de um ~ 5 polegadas de comprimento de sutura de seda 3-0 sob a embarcação. Limpar fascia dos vasos. CUIDADO O nervo vago e cadeias simpáticas estão incluídos no pacote neurovascular cervical e cuidados devem ser tomados para evitar causar danos a ele quando isolar a artéria carótida.
- Use a tesoura para fazer uma segunda incisão na virilha, ao longo do recorte onde os músculos posteriores da coxa-membros se encontra com o abdômen. Dissecar abaixo do músculo abdominal, ao longo dos músculos da coxa até chegar ao ligamento inguinal. Isto irá expor o feixe neurovascular femoral. Isolar cuidadosamente a artéria femoral por meio de um ~ 5 polegadas de comprimento de sutura de seda 3-0 sob a embarcação. Limpar distância fáscia deixando 5-7 mm de recipiente exposta.
- Um nó permanente na extremidade distai da artéria exposta.
- Aplicar tracção no fio de sutura na extremidade proximal da artéria para ocluir o fluxo de sangue, puxando as suturas ensinadas. Adicione uma pequena incisão na parte superior do vaso com uma tesoura oftálmicas. Tracção insuficiente no recipiente irá resultar em hemorragia, que pode ser interrompido por aplicação de tracção mais pesado. Feche o cateter na torneira.
- Usando um introdutor vascular, inserir o tubo do cateter dentro do vaso, 7-9 mm depois da incisão do vaso e para a linha média. Uma vez que o cateter é colocado a uma distância desejada, o nó frouxo em torno do vaso e do cateter para a segurar no lugar. Remover tração do navio e permitir que ele a mentir naturalmente.
- Administrar 0,3 ml de heparina (100U/ml em salino), por via intravenosa. Lave qualquersangue para fora do cateter, com uma pequena quantidade de solução salina para evitar a coagulação. Ligue o monitor de pressão e calibrar o equipamento. Abrir as torneiras de passagem para permitir que o transdutor para detectar a pressão arterial. Para obter medições precisas da pressão arterial, o posicionamento do sistema não deve ser mudado após a calibração.
- O isoflurano dosagem deve ser ajustada para se obter uma pressão sanguínea arterial média (MAP) de 110 mm Hg a 130 mm Hg. Este MAP deve ser indicativa de plano cirúrgico de anestesia adequada.
3. Protocolo de isquemia
Como mencionado anteriormente, quatro vasos fornecer perfusão para o cérebro. Oclusão proximal das duas artérias carótidas não irá resultar em isquemia cerebral, porque as artérias vertebrais irá compensar através do Círculo de Willis. Tem sido demonstrado que a oclusão da artéria carótida, juntamente com a hipotensão sistémica induzida, irá limitar a perfusão através das artérias vertebrais, resultando em isquemia cerebral. Aqui nós descrIBE o protocolo para a retirada de sangue para a produção de hipotensão e de fixação das artérias carótidas para produzir isquemia controlada, reversível. Veja a figura 1.
De oxigênio no sangue e dióxido de carbono, a concentração de glicose e pH pode variar entre os indivíduos do grupo de amostra e causar variação na lesão. O monitoramento dessas variáveis fisiológicas pode reduzir a variabilidade do infarto. Como mencionado, a temperatura é um outro parâmetro que é importante regular, no entanto a temperatura do cérebro pode não corresponder à temperatura de núcleo, tal como a perfusão é muito restrito, durante a isquemia experimental 28. Nossos resultados cirúrgicos de configuração específicas em mudanças de temperatura no cérebro que as mudanças espelho em temperatura central durante a isquemia. No entanto, é importante para o experimentador para determinar empiricamente por esse controlo de temperatura do cérebro com termopares ou por outros meios para padronização do procedimento. Se a temperatura do núcleo não espelha temperatura cerebralratura, é importante para manter a temperatura do cérebro normotérmica durante todo o procedimento, independentemente da temperatura do núcleo.
Randomização dita que o cirurgião randomizes o animal à isquemia ou grupo controle sham-operado neste momento. Sham cirurgia vai acompanhar todos os procedimentos exatamente o mesmo que os animais isquêmicos com exclusão de qualquer redução na pressão arterial e oclusão da artéria carótida. É importante que os controlos sham-operated estar sob a mesma dose de anestesia por uma duração que coincide com a dos animais isquémicos. Se houver um grupo de tratamento incluiu, que exige anestesia antes ou após a isquemia, isquemia simulada e grupos não tratados deve corresponder à dose e duração da anestesia do grupo de tratamento.
- Pronto clipes hemostáticos e clip do aplicador. Clipes deve ocluir totalmente o recipiente, sem causar qualquer tipo de trauma. A isquemia pode ser induzido quando a hemodinâmica se tornaram coerentes. Ligação a 10 ml heparinizada syriESL para a torneira de passagem, perpendicular e proximal do cateter. Deve haver 0,3 ml (30 unidades) de soro fisiológico heparinizado no interior da seringa para impedir a coagulação do sangue retirado.
- Definir um temporizador para 1 min e abra a torneira para a seringa heparinizada, para que o sangue possa ser retirado.
- Retirar sangue puxando o êmbolo da seringa. Se muita sucção é aplicada, o navio vai recolher ou vedar contra a abertura do cateter e sangue não será desenhado. Deve ser possível remover 7-9 ml de sangue em 1 min. Se não for este o caso, ainda mais avançada do catéter na artéria e repetição. Descobrimos que 7-9 mL de sangue deve ser removida para reduzir o MAP de cerca de 30 mm Hg, a pressão sanguínea, a isquemia. IMPORTANTE Assegurar o sangue retirado é mantida a 37 ° C para evitar o arrefecimento durante a reinfusão do sangue.
- Após a uma coleta de sangue minuto (7-9 ml de sangue deve ser retirado), aplicar clipes hemostáticos para as artérias carótidas e começar umatimer para 8 min. Imediatamente verificar a pressão arterial. Se o mapa não é de 30 mmHg, infundir ou retirar sangue lentamente para atingir 30 mm Hg ± 1 mmHg. Continue esta prática em todo isquemia para manter PAM de 30 mm Hg. Pressão arterial importante registro ao longo de todo o protocolo de isquemia. Deixar de reduzir a pressão arterial de 30 mmHg pode limitar isquemia. Monitor de núcleo e / ou a temperatura do cérebro de perto durante a reinfusão de aumentos ou diminuições de temperatura podem influenciar danos cerebrais.
- No final de 8 min, começa a reperfusão por remoção dos clipes hemostáticos e reinfusing o sangue lentamente, 2 ml por minuto.
- Quando o sangue ter sido reinfundido a cânula pode ser removida a partir da artéria femoral. Para evitar qualquer sangramento no pós-operatório, seguras dois nós distintos proximal da incisão na artéria.
- Sutura das incisões com um padrão descontínuo utilizando uma agulha de corte inverso, com 5-0 sutura VICRYL. Esta sutura se dissolve, por isso não vai rEquire remoção. NOTA Durante o procedimento, se a anestesia suficiente não pode ser alcançado com níveis mais baixos de isoflurano, administrar uma dose adicional de cetamina.
4. Analgesia e Recuperação
Bem-estar animal é a prioridade, durante a recuperação, bem como o procedimento cirúrgico. Cuidados pós-operatórios devem seguir as orientações específicas da instituição. Animais submetidos a isquemia cerebral global são suscetíveis a ataques. Para minimizar a ocorrência de convulsões é importante que a sala de recuperação ter um mínimo de estimulação, ou seja, ruídos e distúrbios visuais. De acordo com nosso protocolo de utilização de animais, que casa animais pós-operatório durante 72 horas numa sala isolada para esta finalidade.
- Após as incisões foram suturadas o rato pode ser desmamados do ventilador. Desligue o isoflurano e continuar a ventilação em 30% oxygen/70% de óxido nitroso até o rato começa a respirar contra o ventilador.
- Administrar 0,5 mg / kbutorfanol g em 5 ml de soro fisiológico, por via subcutânea entre as omoplatas.
- Rapidamente reinfusing sangue pode aumentar pré-carga do ventrículo direito. Isso aumenta a pressão na circulação pulmonar e poderia provocar edema pulmonar. Sinais dessa incluem respiração forçada e torresmo sons durante a respiração. Aplicando pressão expiratória final positiva vai ajudar a melhorar edema pulmonar.
- Quando o controle voluntário da respiração é recuperada, extubação, retire o termômetro e desligar o cobertor de aquecimento. Neste ponto, o animal pode ser colocado numa gaiola de recuperação. A gaiola de recuperação deve ser posicionado de modo a metade da gaiola está em cima de uma manta de circulação de água (34 ° C) durante as primeiras 24 horas de reperfusão. Colocar o animal da parte do piso da gaiola sobre a manta de aquecimento para auxiliar a manutenção da temperatura. Uma vez que o animal começa a se recuperar da anestesia e analgesia, ela se moverá ao redor da gaiola de termorregulação em si. Os animais serão alojados separadamente no pós-operatório.
- O animal deve ter acesso ilimitado a água. Durante dois dias pós-operatórios, esta água deve conter 4 mg / kg solução Tylenol líquido. Além de roedores, cereais de pequeno-almoço adoçado é fornecida na gaiola para estimular a alimentação e evitar a perda de peso.
- Cobrir metade da gaiola com uma cortina e acompanhar de perto a recuperação pós-operatória.
- Quando o animal se recupera da anestesia, é importante monitorar os sinais de aflição. Trabalharam ou respiração inconsistente pode ser um sinal de sofrimento, possivelmente causada por edema pulmonar ou irritação das vias aéreas durante a intubação. Butorphenol vai sedar o animal, reduzindo a atividade, porém atividade leve deve ser restabelecida dentro de uma hora. Encontramos animais vão começar a comer doces e beber dentro de 4 horas de extubação. Por 12 horas, o comportamento normal e atividade alimentar deve ser retomado. Outro sinal de sofrimento é a perda de peso, um animal não deve perder mais de 20% do peso corporal original, em qualquer período de 48 horas, se a perda de peso excessivo is observou o animal deve ser sacrificado.
- Intervenção humana é necessária se ocorrerem convulsões. Este tipo de atividade convulsiva é geralmente visto de 24 a 48 horas após a reperfusão. As convulsões podem causar aumento de dano cerebral, que é independente do insulto isquêmico per se, assim, a atividade de apreensão deve ser considerada um critério de exclusão estabelecidos no local antes do início do estudo, 29. Convulsões podem ocorrer quando ninguém está presente, por isso, é importante reconhecer os sinais. Fundamento será perturbado e, possivelmente, expelido da gaiola. Um rato postictal terá uma disposição lânguida com rápida, dificuldade para respirar e / ou ter um nariz machucado ou sangrando.
Nota Quaisquer sinais de dor ou sofrimento é imediatamente aliviada com analgésicos. Se sympotoms não são atenuadas com uma dose de analgésicos ou persistir após a quarta dose de analgesia consecutivo, o animal ser sacrificado e excluídos do estudo. Wo cirúrgicounds devem ser inspecionados para a cicatrização adequada durante oito dias pós-operatórios.
5. Coleção de tecidos e Processamento
O cérebro é fixado por perfusão transcardial de paraformaldeído. Após secção bruta e crioproteção, nós tirar congelar o cérebro ea seção em um criostato. Estas seções cerebrais são corados com violeta Cresyl e fotografada em um microscópio de luz.
- Induzir a anestesia por colocação do animal na câmara de indução e de enchimento com 30% de oxigénio / óxido nitroso a 70% com 5% de isoflurano. Intubate e ventilar o animal em 30% de oxigénio / óxido nitroso a 70% com 5% de isoflurano.
- Preparar o material para o procedimento de perfusão. Encher um copo com 100 ml de 1 x tampão fosfato salino (PBS) a 4 ° C, e um copo com 100 ml de 4% de paraformaldeído (PFA) a 4 ° C. O cérebro é lavada com PBS seguido de PFA, por meio de uma bomba de perfusão. Tubos será colocado em cada copo e ligados por uma torneira de três vias a umLlow uma transição suave de PBS para PFA perfusão. Depositar uma agulha de calibre 18 romba no tubo e encher a linha com PBS. Garantir que não haja bolhas na agulha e tubos de ar pode formar uma embolia, que poderia impedir a perfusão. Além disso, um pequeno recipiente pronto com PFA para fixação imersão do cérebro.
- Use uma bandeja de coleta de líquido, com capacidade suficiente para armazenar, no mínimo, 200 ml de líquido. Neste ponto, o animal deve ter sido ventilada com isoflurano durante o tempo suficiente (pelo menos 3 min) para atingir uma anestesia profunda.
- IMPORTANTE Certifique-se de plano cirúrgico de anestesia é alcançado.
- Prossiga por fazer uma incisão para acessar a cavidade torácica através do abdômen. Grampo da aorta descendente. Quando o coração é exposto, inserir a agulha de calibre 18 romba através do vértice do coração para a aorta. Faça um pequeno corte na orelha direita para permitir perfusato para sair do animal.
- Ligar a bomba a 50 ml / min, começando com PBS. Depois pumping 100 ml de PBS, mude a torneira para perfundir 100 ml de PFA.
- Remover o cérebro, tomando cuidado para não danificar o tecido.
- Colocar o cérebro em uma matriz de tecido e cortado entre o cérebro e cerebelo. Seção do cérebro anterior; ~ 3 milímetros da frente e de trás do córtex cerebral. Isto irá produzir três seções, a seção do meio conterá o hipocampo.
- Coloque as seções do cérebro em um frasco com PFA suficiente para a imersão completa. Imersão consertar o cérebro para exatamente 2 horas.
- Para proteger o tecido de danos provocados pelo congelamento, o cérebro é cryoproteced substituindo o PFA com 30% de sacarose em PBS. Crioprotecção é completa, com as amostras de tecido afundam na solução de sacarose (~ 24-48 h).
- Para encaixar congelar as secções do cérebro, coloque num copo com gelo seco e encher com 2-metil-butanol durante dez minutos. Coloque as fatias cerebrais para o metil-butanol durante 5 min, em seguida, transferir para um recipiente selado e armazenar a -80 ° C até cryostna corte.
- Seção Cryostat o cérebro em 20 mM, a coleta pelo menos três seções em 3 coordenadas atlas do cérebro (cérebro do rato em Coordenadas Estereotáxicas. Paxinos e Watson, seções de placa 29, de 31, 33 ou Bregma -2,8 mm -3,3 mm e -3,8 mm). As secções são colocadas em lâminas de microscópio carregadas e deixada secar antes de armazenamento a -80 ° C.
- Violeta Cresyl (0,1% em pH 3,5) mancha nove seções do cérebro, 3 em cada cérebro atlas de coordenadas.
- Imagem região CA1 do hipocampo em 40x com um microscópio de câmara montada e inserir uma barra de escala 300 um paralelo com o plano neuronal CA1. Salvar imagens como arquivos TIFF.
6. Danos Quantificação cérebro
ImageJ, um programa gratuito oferecido pelo Instituto Nacional de Saúde, pode ser usado para contar e quantificar os neurônios viáveis, o que irá representar a extensão do dano cerebral.
- Abertas imagens TIFF microscópio com plugin ImageJ o "contador de células". Selecione ummarcação de cor e contagem de neurónios dentro dos limites da barra de escala. Neurônios são contados com base em critérios de inclusão simples, com base na morfologia neuronal (forma grande, piramidal) ou critérios de exclusão para a morfologia da microglia / astrócitos (pequena redonda ou forma tubular longo).
IMPORTANTE Seja consistente com os critérios de inclusão / exclusão entre os slides, e os indivíduos quando a contagem de neurônios. - Recorde contagem de neurônios e salvar janela balcão da célula.
- Contagem de neurônios deve ser concluído por duas pessoas distintas para atingir consistentes, a contagem de neurônios precisos.
- A média de todas as nove imagens de cada animal irá proporcionar um significativo único "contagem neuronal", que é a medida quantitativa do dano CA1 do hipocampo para ser utilizado na análise estatística. Os grupos podem ser comparados estatisticamente através de um one-way ANOVA seguido pelo teste de Tukey HSD para a análise post hoc, ou, se for teste de normalidade de falhar, uma Kruskal-Wallis ANOVA em fileiras seguido de Dunn poanálise rua hoc para avaliar estatisticamente as diferenças entre os grupos. Análise estatística específica deve ser ditada pelo desenho do estudo individual, que é aqui apresentada pode não ser apropriado para as hipóteses específicas a serem testadas.
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Representative Results
O 2VOH modelo de isquemia cerebral global / reperfusão provoca a morte neuronal na região CA1 do hipocampo. Figura 2 representa a lesão produzida por 8 min de isquemia cerebral global, processada 14 dias após a reperfusão. Figuras 2A e 2B comparar os hipocampos de engodo e cérebros pós-isquêmica, corados com violeta Cresyl. figura 2A mostra um hipocampo de um rato sham-operado que apresenta morfologia normal, incluindo um CA1 intacta. figura 2B mostra o hipocampo sujeitos a isquemia / reperfusão, onde o giro denteado, CA2 e CA3 ter minimamente afetado morfologia. Os neurônios seletivamente vulneráveis da CA1 do hipocampo não sobrevivem isquemia / reperfusão e apenas neurônios espalhados permanecem. Contudo, um aumento dramático na infiltração de macrófagos e / ou células da microglia (Iba-1-positivas), e astrócitos reactivos (células GFAP-positivos) são evidentes na CA1 hcampo ippocampal. Rotulagem de imunofluorescência específico de neurônios com NeuN, macrófagos / microglia rotulagem com Iba-1, e rotulagem astrócitos com GFAP corroboram esses achados.
Figura 2C apresenta amostra neurônio contando janelas para imagens de microscópio do CA1 com ampliação de 40x. O painel superior mostra CA1 a partir de um controle sham-operated eo painel inferior mostra o CA1 seguinte isquemia / reperfusão. Os feridos CA1 exibe uma coloração que inclui microglia e astrócitos, que parecem pequenos e tubular ou em forma de lágrima. Estes podem ser distinguidos dos neurónios pela sua forma. Neurônios do hipocampo intacto, se no giro denteado, CA2 ou a CA1, são grandes, com uma forma circular ou piramidal.
A Figura 2D é uma análise gráfica da lesão induzida 2VOH CA1 quantificada por contagem neuronal. Pode concluir-se que 8 min de isquemia produzida pelo modelo 2VOH pode causar uma consistente e reproducibllesão e que está essencialmente isolado do hipocampo CA1.
Figura 1. Cronologia Experimental. Experimental A linha do tempo é uma representação dos passos cirúrgicos e processamento do tecido.
Figura 2. Os resultados representativos. Danos Hippocampal em um rato sem tratamento submetido a I / R (B) em comparação com um rato controle sham-operado (A). Cresyl violeta manchado hipocampo (10X) [Surround] ampliações 40X de CA1, CA2, CA3, hilo e DG (top lefta horário). (B) O dano é localizada no CA1 hippocAmpus. (C) Representante janelas contagem utilizados para neurônio contagem e quantificação de danos em um animal controle sham-operado (superior, controle) e um animal exposto a isquemia cerebral global (baixo, I / R). (D) Representante quantificação de CA1 contagens de neurónios do hipocampo a partir de um estudo não publicado (média + desvio padrão, n = 8, p <0,05).
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Discussion
O modelo descrito aqui produz um insulto isquémico no cérebro que pode ocorrer como resultado de paragem cardíaca e ressuscitação, proporcionando uma lesão similar à encontrada nos seres humanos. Este método para a produção de isquemia cerebral global é um de vários protocolos. Nós utilizamos esse protocolo mais importante para a sua comparativamente baixa taxa de mortalidade, uma rápida recuperação e reprodutibilidade dos resultados. O modelo de prisão / ressuscitação cardíaca é sem dúvida o modelo mais clinicamente relevante, no entanto, tecnicamente, a mais difícil de reproduzir constantemente. O 4VO modelo de isquemia cerebral global é um outro protocolo vulgarmente utilizado, valiosos no facto de que todos os quatro vasos contribuintes são ocluído durante a isquémia. Este modelo também tem desvantagens, que incluem várias cirurgias e possibilidade de pré-condicionamento neuroprotetor. O modelo 4VO foi adaptado, permitindo a oclusão transiente de todas as quatro vasos durante um procedimento para produzir isquemia, no entanto, a cirurgia continua a ser técnicoly exigente 30.
Variações sobre 2VOH foram mostradas para produzir uma gama de resultados 31,32. Duração da isquemia e grau de hipotensão são as principais variáveis que podem afectar resultado. Relatórios mostram que, se a pressão arterial não é reduzido bastante a lesão produzida pode ser inconsistente ou unilateral em ratos 30. Foram encontradas 30 mmHg para ser um grau ótimo de hipotensão, pois produz isquemia confiável, sem causar lesão periférica notável. Este paradigma produz isquemia caracterizado como grave, porém seguindo nosso protocolo irá reduzir a outra maior chance de complicações. A natureza grave do insulto pode ser o motivo ligeira variação em parâmetros fisiológicos entre os animais normalmente não afecta a consistência lesão.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesses financeiros.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material Name | |||
| 5-0 VICRYL suture, reverse cutting | Ethicon | J391H | |
| Scalpel, No.10 | Swann-Morton | 6601 | |
| Gauze Sponges | Fisher | 22-362-178 | |
| 18G x 1 ½ in needle | BD | 305201 | |
| 23G x 1 in needle | BD | 305145 | |
| 26 G x 3/8 in needle | BD | 305110 | |
| 18 G x 1 ¼ catheter | EXEL | 26735 | |
| 1 ml syringe | BD | 309659 | |
| 10 ml syringe | BD | 309604 | |
| 60 ml syringe | BD | 309653 | |
| Surgilube | Henry Schein | 1152666 | |
| .9% Saline, plastic IV bag | Henry Schein | 1537468 | |
| Suture 3-0 Silk | Henry Schein | 1007842 | |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Henry Schein | 3390017 | |
| Betadine | Henry Schein | 6903564 | |
| Sterile Towel Drape | Moore Medical | 14170 | |
| Polyethylene Tubing, 50 | Intramedic | 427411 | |
| Stopcock, 3 way | Smiths medical | MX9311L | |
| Drug Name | |||
| AERRANE (isoflurane) | Henry Schein | 2091966 | |
| Mapap Liquid (Tylenol) | Major Pharmaceuticals | 1556 | |
| Kedavet (ketamine) | Ketathesia Butney | NDC 50989-996-06 | |
| Butorphic (butorphanol) | Lloyd Labs | 4881 | |
| Heparin | APP Pharmaceuticals | 504011 | |
| Chemical Name | |||
| Paraformaldehyde prills | Elecron Microscopy Sci. | 19202 | |
| 2-methylbutane | Sigma | 270342 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma | C5042 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Software | |||
| ImageJ | NIH | ||
References
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