Summary
私たちは、勉強のための堅牢な生化学的および顕微鏡的手法を提示
Abstract
線虫C.虫は、それがヒトの肥満とその関連病態に関わっているように、脂肪の代謝を調節する保存された遺伝経路の研究のための重要なモデルとして登場しました。 Cの可視化のために開発されたいくつかの以前の方法論エレガンストリグリセリドに富む脂肪質の店は脂肪滴以外の細胞区画を強調して、誤ったことが証明されている。他の方法は、特殊な装置を必要とし、時間がかかる、または矛盾した結果が得られます。我々は、Cの中性脂肪滴を正確かつ迅速に検出するための迅速で再現性のある、固定ベースナイルレッド染色法を紹介エレガンス 。 40パーセントイソプロパノールの短い固定ステップは、動物を染色するために使用されるナイルレッド、完全に透過性の動物を作ります。この親油性色素のスペクトル特性は、それが強くかつ選択的に黄緑色スペクトルで蛍光を発することができる場合にのみ、脂質が豊富な環境ではなく、もっとで極域環境。このように、脂肪滴はイソプロパノールで唯一の簡単なナイルレッド染色工程後に簡単なのGFPイメージング機能を搭載した蛍光顕微鏡で可視化することができる。速度、手頃な価格、そしてこのプロトコルの再現性は、それが理想的にハイスループットスクリーニングに適しています。我々はまた、トリグリセリドおよびガスクロマトグラフィー質量分析法を用いたリン脂質の生化学的測定のためのペアリング方法を示しています。このより厳密なプロトコルは、ナイルレッド微視的脂質測定から得られた結果の確認として使用されるべきである。私たちは、これらの技術はCの分野における新たな基準となることを予想してelegansの代謝研究。
Introduction
人間と線虫 Caenorhabditis elegansの間の代謝経路の保全は肥満の研究のための強力なモデル生物になります。一方、C.エレガンスは、哺乳類のような脂肪の蓄積に専念脂肪細胞を持っていない、彼らは脂肪滴1店舗トリグリセリドを行うと脂肪の蓄積とエネルギー使用2,3の同じレギュレータの多くを持っています。 Cの脂肪レベルをアッセイするエレガンスは 、いくつかの方法を使いやすさと成功の様々なレベルで提案されている。蛍光、バイタル色素4-7の一回一般的な用途は、最近疑問視されており、これらの試薬 は、Cの主な脂肪の蓄積デポから異なるコンパートメントを染色することが証明されたエレガンス 1,8-11。そのようなスーダンと黒のオイルレッドOとして固定ベースの非蛍光染料、ワーム12-14に脂肪滴を強調することに成功しながら、蛍光などの定量化のための広いダイナミックレンジとして持っていないセント染料8,13,15。さらに、蛍光および非蛍光色素の両方のための固定の現在の方法は時間がかかりますし、複数の凍結融解工程および/ または有毒化学物質1,9,10の使用を含む。短期的なラベリング15と共に生きるワームに供給するときに、特定BODIPY標識脂質類似体の使用は、脂肪滴を強調することが報告されている。しかし、これは色素の取り込みに依存しているため、Cによって付勢されているBODIPY脂肪酸類縁体のelegansの取り扱いと代謝。脂質染色色素に設立代替手段は、ラベルフリー、コヒーレント反ストークスラマン散乱（CARS）または脂肪質の店10,16を可視化する脂質分子の特徴的な振動特性を活用誘導ラマン散乱（SRS）顕微鏡であり、 17。しかし、高価な特殊な機器では、このメソッドのために必要であり、スループットは最高の状態で低くなっています。
急速な、スケーラブルanalyの必要性を満たすために、Cの中性脂質店のSIS エレガンス代謝研究、我々は固定ベースナイルレッド脂質染色の小説、非常に再現性のある方法をご紹介します。親油性染料ナイルレッドのスペクトルと物理化学的性質は、それが唯一の時脂質の豊富な環境ではなく、より極性の環境18で緑色発光スペクトルの蛍光を発することができ、その励起発光ピークのイエローゴールド-スペクトルシフトを誘発する、19。したがって、脂肪滴を、蛍光顕微鏡用に設定、緑色蛍光タンパク質（GFP）は、フィルタを使用することによって、単純な染色後に検出することができる。この技術の使いやすさと手頃な価格は、それが理想的にハイスループットスクリーニングに適しています。我々はまた、トリグリセリドおよび固相抽出とガスクロマトグラフィー - 質量分析法を用いたリン脂質の生化学的測定のためのペアリング、厳密な方法を示しています。生化学脂質測定は 、Cのナイルレッドベースの顕微鏡測定と相関エレガンス FAtは質量、微視的脂質決定で作ら所見の確認として使用されるべきである。
Protocol
1。長方形アンプ/テト（A / T）LB寒天プレートおよびNGM IPTGのRNAiプレートの調製
/ Tのプレートを4℃で使用するように1-4週間前に準備して暗所で保存して下さい
- メディアの1L用1Lの脱イオン水、32グラムのLB寒天、1.5ミリリットルの2M NaOH、および2gバクト寒天を追加します。液体のサイクルで40分オートクレーブ。 60℃に冷却した後、3 mlテトラサイクリンおよび0.5 mlのアンピシリンを追加します。各プレートに培地45mlを注ぎます。
事前に2週間までRNAiの96ウェルプレート3日の準備をします。
- 1Lの脱イオン水、3グラムのNaCl、17グラムアガロース、および2.5gのバクト：25、96ウェルプレートのRNAiを注ぐために、線虫の増殖培地（NGM）の1 Lを用意する。 121℃オートクレーブ液体サイクル℃の攪拌棒を備えた40分間。 60℃までホットプレートセットに攪拌、冷ます
- 1ミリリットルの1M MgSO 4を 、1mlの5 mg / mlのコレステロール、25 mlの1 M KH 2時60℃まで冷却し、以下の原液を追加4（pH6.0）で、1ミリリットルの1M CaCl 2を 、1ミリリットル200 mg / mlのカルベニシリン、および5 mlの1 M IPTG（レシピの材料表を参照）。
- 電子マルチチャンネルピペッターを用いて平底96ウェルプレートの各ウェルにRNAiのメディアを150μlを分注する。気泡を避けてください。調剤しながら60℃の水浴中に浸漬滅菌ステンレス製の容器にメディアを保管してください。
- アガロースが固化するまでのRNAi板の高さを保ちます。プレートは、事前に2週間まで注ぎ、4℃で保存することができます
1日目
2。長方形アンプ/テト（A / T）をLB寒天プレートに冷凍ライブラリプレートをスタンプ
- 暗闇の中でそれらを維持し、室温にA / Tプレートを温める。
- -80からの振替96ウェルRNAiライブラリープレートは℃の氷を乾燥させる。ブンゼンバーナーの近くに密封されたアルミプレートを開きます。
- H 2 Oを脱イオン、10％漂白剤で（10秒ずつ）シリアル端子を浸漬することにより、96ピンレプリケータを殺菌し、70％EToHは炎を通してピンを通すことによって続いた。 EtOHと炎のステップを繰り返します。
- 各ピンが接触し、各ウェルの表面を確認しながら、冷凍、96ウェルのRNAiグリセロールストックにレプリケータを適用します。
- 有害寒天表面ずに各ピンと小さな円を描いて、A / Tプレートにスタンプ。
- -80〜再シールとリターンライブラリプレート℃、細菌の成長のために、37℃で一晩/ Tのプレートを刻印インキュベートする。
2日目
3。ディープウェルブロックで一晩RNAiの細菌クローンを育てる
- 37°CからA / Tのプレートを外して、細菌の増殖を確認します。
- 200μg/ mlのカルベニシリンを含むLB 1.5mlで96ウェルディープウェルブロックの各ウェルを埋める。
- 96ピンレプリケーター（ステップ2.3を参照）滅菌する。
- 必ずピンが各細菌のRNAiクローンと接触しながら、A / Tプレートの上部にレプリケータを適用します。ディープウェルブロックにレプリケータと浸すピンを持ち上げます。渦巻、ゆっくりと取り外し、CEを作る隣接した井戸を汚染しないrtain。
- 呼吸しやすいフィルムを使用してブロックを密封します。 37℃で一晩インキュベート℃で攪拌しながら（MT Infors Microtiteron IIの最寄りのシェーカー、または25ミリメートルスロー振盪インキュベーター中で250回転で950回転）。
3日目
4。 96ウェルNGMのRNAiプレートにシードRNAiの細菌クローン
- 4から96ウェルのRNAiプレートを取り外し℃、室温に戻した。
- ディープウェルブロックを取り外し、4,000×gで10分間遠心する。
- 急速にメディアを排出するためにシンクにブロックを反転し、余分なメディアを排除するためにペーパータオルの上に反転したスタンプ。
- 層流フードの下では、無菌の膜と各ウェルシールに200μg/ mlのカルベニシリンを含むLBの40μlを添加する。
- 10分のペレットを再懸濁し、または手動で慎重なピペッティングでペレットを再懸濁するために細菌のシェーカー室温にブロックを返す。
- 層流フードで、深いから滅菌フィルムと転送細菌を除去96ウェルのRNAiプレートにウェルブロック。他のすべての行からの行の 'A'と 'H'、35μlに再懸濁した細菌の40μlを添加する。多くの液体はoverdryingとアガロースの割れを防止するために、96ウェルプレートのRNAiのエッジウェルに添加する。
- 乾燥度を定期的に検査し、4-6時間、フード内で乾燥させる発見プレートのままにしておきます。ドライバクテリアは曇り、明確ではありませんが表示されます。カバー、プレートを反転させ、室温で一晩インキュベートする。
5。ワームの同期人口を準備
多くの妊娠ワームに満ち二つ10cmプレートは、6、96ウェルプレートのRNAiのための卵の準備のために使用されます。ワームは、少なくとも2世代（7日）のための非飢えていることを確認してください。
- 前述の20としてL1の同期人口を準備します。漂白剤溶液20mlについては、1ミリリットルのNaOH（10 M）を、5 mlのH 2 Oを脱イオン水、及び10ml M9バッファを4 mlの漂白剤を使用しています。
- 滅菌15mlに10ミリリットルM9で一晩ワームを同期する20℃回転にポリプロピレンチューブ℃の
4日目
6。 RNAiのプレートにワームを追加
- 1分間3000 xgで卵プレップを遠心分離します。 L1の孵化のペレットから離れて滞在し、上清を吸引します。 0.0005パーセントTriton X-100で5ミリリットルM9バッファーに再懸濁する。洗剤を少量の添加がピペットに付着する虫を防ぎ、脂肪染色には影響を与えません。
- 顕微鏡下でワームを数える。必要に応じて、マイクロリットル当たり10から15ワームに濃度を調整します。
- 層流フードでは、播種するために、各96ウェルプレートのため、浅いウェルアッセイブロックの1行の各ウェルに再懸濁させたワームの75μlを添加する。手動マルチチャンネルピペットを用いて、96ウェルのRNAiプレートの各ウェルに5μl中50から75のワームを追加します。
- プレートは30から60分間、フード内で乾燥することができます。乾燥すると、顕微鏡下で、ワームがスラッシングしない、這うように見えるはずです。
- RNAiのプレート上にワームを育てる20℃〜64時間加熱する。
7日目
7。ナイルレッドでワームを修正し、染色
- インキュベーターからRNAiのプレートを取り外します。これらの条件は脂肪量に影響を与えるとして、さらなる分析から除外する顕微鏡とレコード飢えやスラッシング（ウェット）の井戸の下で調べます。
- 電子リピートピペッターを用いて、RNAiのプレートの各ウェルにトリトンX-100 0.01％で150μlのPBSを追加します。 96ディープウェルPCRプレート内の対応する行にワームを使って手動マルチチャンネルピペッター、ミックス、移送液と。寒天を中断することは避けてください。ウェル当たり300μlのPBS中のワームの合計に対して、この手順を繰り返します。
- 4つのプレートが転送されたとき、1分間500rpmでプレートを遠心分離します。
- 井戸の底に〜25μlの液体やワームペレットを残して、96ピンの真空吸引器を使用して上清を吸引します。
- 動物を修正するための各ウェルにイソプロパノール40％の150μlを添加する。ワームを混ぜて十分に高い速度にピペッターであることを確認しイソプロパノール40％ペレット。 3分間室温でインキュベートする。
- 1分間500rpmで明らかにプレートを遠心分離します。
- 井戸の底にわずか25μlの40パーセントイソプロパノール+ワームペレットを残して、96ピンアスピレーターまたは手動を使用して、上清を吸引します。
- イソプロパノール40％の1ミリリットルあたりのアセトン中に0.5 mg / mlの6μlのナイルレッド原液：各ウェルに、使用直前に調製ナイルレッド染色液150μlを添加する。
- シール非滅菌接着フィルム付きプレートと、少なくとも2時間、暗所で染色。
8。ハイスループットMicroscopeの洗浄とイメージヴォルムス
- 1分間500rpmで遠心し、ナイルレッド染料のすべてが、25μLを吸引します。
- 少なくとも30分間、暗闇の中で各ウェルストアにトリトンX-100で0.01％のPBS 150μlを添加する。
- 1分間500rpmで遠心分離します。
- 、2×クイック7μlの各ウェルの底部から吸引動物を12チャンネルピペッターを使用してストロークと96ウェルテフロンプリントスライドガラス上に分注する。慎重に、ワームを除去することなく、スライドの各ウェルからのPBS 9.5μlを削除します。あなたのスライドガラスを顕微鏡のマウントに直接合わない場合は、カスタムのアルミ削り出しのスライドホルダーは、ワームをマウントするために使用する必要があります。
- 96ウェルスライド上にゆっくりと下カバーのスライド。このステップでは、バブルを回避したり、他のウェルにワームのクロスオーバーするいくつかの練習を取ることができる。接着剤タックを使った安全なコーナー。
- 自動顕微鏡でGFP / FITCフィルターセットを持つ明視野と蛍光の画像スライド。退色するとウェル間の人工の違いにつながるような脂質信号光退色は簡単ので、手動ではない、すべてのウェルにおける体系的な方法で画像化されるべきである。分析の詳細については、代表的な結果と考察を参照してください。
9。固相抽出（SPE）とガスクロマトグラフィー - 質量分析（GC / MS）を用いた生化学脂質決定
- 15 mlコニカルポリプロピレンチューブに10ミリリットルのM9バッファーで各10cmプレートから2,500〜5,000ワームを洗う。ペレット1分間500 xgでワーム、および10mlのM9バッファで再度ペレットを洗浄する。 500×gでペレット動物。窒素foの下で-80℃で液体窒素や店舗に250μlの総体積、どちら凍結°Cから吸引するrは後で処理または直接進んでください。
- ワームペレットはトリグリセリドの質量はリン脂質の質量8,13,21に正規化する場合は9.3を直接ステップとることがあります。しかし、研究者はタンパク質含量やDNA含量に対して正規化を望んでいるなら、ワームペレットを10分間超音波処理浴中で最高の強度で超音波処理されるべきであり、30秒オン、30秒オフ、4℃タンパク質やDNA正規化が望まれているなら、5μlのアリコートを除去し、UV分光光度計を用いて、カラム精製後、Bradford試薬または類似または総DNA含量を用いて総タンパク質濃度を決定する。
- スレッドホウケイ酸ガラス管中のメタノール：1.5ミリリットル2時01クロロホルムにワームを追加します。有機溶剤のすべての転送は、ガラスピペットを用いて行われるべきである。
- wiretrol50μlのピペットを使用して、50μlの25 nMのリン脂質標準、および50μlの16.7 nMのトリグリセリドの規格を追加します。メタノール、しっかり蓋をし、：両方の規格を2:1のクロロホルムに溶解されるべきであると酸化を避けるために-80℃の冷凍庫で光から保護し、窒素下で保存されます。
- フェノールキャップと渦の付いたキャップ。 15分毎にボルテックスし、室温で1時間抽出する。
- 5分間1,000 rpmで遠心分離します。ホウケイ酸培養管に死体なし低い有機相を転送します。
- 0.3ミリリットルの0.9％NaCl、5分間1,000 rpmでボルテックス、遠心を追加します。
- 水相のいずれかの上に転送しないように確認しながら、新鮮なホウケイ酸培養チューブに下部の有機層を転送します。
- 窒素下で乾燥した有機相。開始するには固相抽出（SPE）は、1ミリリットルのクロロホルムに乾燥した脂質を再懸濁する。代わりに、リン脂質クラス、糖脂質、スフィンゴ脂質、ジアシルグリセロール、トリアシルグリセロール、遊離脂肪酸、コレステロールエステルを含む別個の脂質クラスの詳細な分離·分析、薄層クロマトグラフィー用としてCでワットラボによって開拓22 エレガンス は、SPEの代わりに使用することができる。脂質はまた、Bかもしれないeは、GCMSにより分析HPLCおよび分数で区切られています。 liquid-chromatography/MSによって全体lipidomeプロファイリング（LCMS）の洗練された方法も、23から26を使用することができます。
- SPEマニホールド上のシリカSPEカラムを組み立てます。 3 mlのクロロホルムを伴うプレカラム平衡化。重力によって流れるように溶剤を許可します。
- 最初のフラクション（TAG画分）の一環として、スレッドホウケイ酸チューブにフロースルー収集、SPEカラム上に脂質サンプルをロードします。ほとんど中性脂質は、この最初の1ミリリットルフロースルーに通ってくるでしょう。 TAG画チューブにフロースルーを回収し、完全にTAG画分を溶出させるために、3 mlのクロロホルムを追加します。
- 取り外して、最初のコレクションチューブにキャップをし、クリーンなコレクションチューブに交換してください。メタノール9:1アセトン5mlでスフィンゴ糖脂質を溶出する。我々は日常的にこの画分の脂肪酸組成を分析しない、しかし、それは貴重な情報が含まれている可能性と活用、さらなる分析のためのメチルエステルと遊離スフィンゴイド塩基の調製のために保存することができ前述の27のように、タグとPLのものとは異なる特別な手順。
- 第二のねじホウケイコレクションチューブとスフィンゴ糖脂質コレクションチューブを交換してください。 3mlのメタノール（PL画分）とリン脂質を溶出する。
- 画分を、-80℃で窒素下に固くキャップこの時点で保存することができます。窒素下で脂質を精製し乾燥させてください。 33℃のドライヒートブロックで、乾燥速度℃に彼らは乾燥した状態での酸化に特に敏感であるため、乾燥形態で脂質を格納することはありません。
- ボルテックスでのメタノール2 mLの2％H 2 SO 4に再懸濁し、乾燥脂質画分とインキュベートはのFAMEを作成するために55℃の水浴中で一晩しっかり締めくくった。ケアは、これは非常に脂質の誘導体化を阻害するとしてFAMEの反応に全く水が入らないように注意しなければなりません。我々は、一晩インキュベートすることにより、より効率的な誘導体化を発見したと文献が示唆するより少ない脂質酸化はより低い温度で発生ドゥーリngのFAMEの準備28。代替のより迅速な方法は、メタノール中で2ミリリットル2.5パーセントのH 2 SO 4を使用し、70〜80℃で21,22,29で1時間誘導体化することです。
- 翌朝、浴から除去し、冷まします。各タグとPL画分に、1.5 mlのH 2 O（反応をクエンチするため）と0.3mlのヘキサン（のFAMEを抽出する）を追加します。激しく振り混ぜ、5分間1,000 rpmで遠心分離します。
- 非常に慎重に標準ピペットやパスツールピペットを用いて、トップヘキサン層を削除します。オートサンプラチューブに分注します。これはGCカラムとMSDが破壊され、任意の酸性メタノールを含めないことを確認してください。
- GC / MSの上にキャップをして、負荷のサンプル。サンプルは、PTFE - シリコーン、PTFEスクリューキャップで蓋をし、マイクロインサートAgilentのバイアルにヘキサンで転送されます。それはSupelcowax-10（24079）30メートル、250ミクロンの溶融シリカキャピラリーカラムを装備アジレントGCMSモデル6890/5973Nに転送されます。 1マイクロリットルはintに注入されるOAレス注入口は、250℃で13.33とPSIの超高純度ヘリウムをキャリアガスを使用されている設定。プロトコルの実行は、毎分1ミリリットル定数で次のとおりです。
| 手順 | 命令 | 目標温度 |
| 1 | 2分間保持 | 150℃ |
| 2 | ランプ10℃毎分 | 200℃ |
| 3 | 4分間保持 | 200℃ |
| 4 | ランプ5℃毎分 | 240℃ |
| 5 | 3分間保持 | 240℃ |
| 6 | ランプ10℃毎分 | 270℃ |
| 7 | 5分間保持 | 270℃ |
3分の溶媒遅延はFILの摩耗を最小限に抑えるために、MSDで使用されている知的障害者。その後、50〜550ダルトンとの間の質量は270の熱補助℃の温度で、150℃、230℃に設定したミリ秒のソースでMS四重セットで検出された
Representative Results
脂肪染色ワークフローを通じて撮影されている画像化された板の一例を図1に示します。高脂肪のための特定のコントロール（DAF-2、インスリン受容体RNAi）は、低脂肪（腸のRNAiにおける脂質貯蔵顆粒に必要なLPD-3タンパク質）、小型·低脂肪（FASN-1の脂肪酸合成酵素のRNAi）と、空ベクター（制御）動物の脂肪レベルに応じて蛍光強度の変動、およびGC / MS分析（ 図2）によって決定された対応する脂質の量を示しています。発達逮捕につながる遺伝子の不活性化は、小さな動物が頻繁にかかわらず、脂肪の代謝への接続（ 図3）、成人対照動物よりもはるかに低い脂肪を持っているように見えることに注意してください。似たような発達段階の野生型対照動物のSPE-GCMSによる染色分析および脂質生化学などの二次分析は、妥当性を確保するために行わなければなりません小規模または発達ポジティブヒットを逮捕した。 FASN-1 RNAiを（ 図2）、L2またはL3幼虫段階のいずれの動物を逮捕、成人コントロールRNAiのより低い脂肪染色を持っていますが、L2-L3段階コントロールRNAiの動物（脂肪汚れパーセントまで豊富にも同様の場合、 49.9±FASN-1 RNAiおよび20.2±L2制御RNAiのための2.1％および64.7±1.3 L3制御RNAiのための4.5％）：成人コントロールRNAiの。あるいは、生化学分析はL2段マッチN2の対照動物（：22.5±2.9 FASN-1 RNAiと46.1用の±3.4段をマッチさせたコントロールのRNAiは、P≤0.05のTAG / PL）より低いTAG / PL比を示した。したがって、この例ではFASN-1はむしろ脂肪量のちょうどステージ固有の削減よりも脂質貯蔵の役割を持っていることを生化学的解析によって確認することができる。
画像化されたワームのフォローアップ解析は、用いた細胞プロファイラとして計算プラットフォームに大きく依存していますWormToolbox 30。 NIHから自由に利用できる画像などImageJのように公的に利用可能な画像解析プラットフォームは、数が少ないために使用することができる。我々の分析では、ユニークなMatlabのスクリプトがうまくを識別するために最初に使用され、その後、空のウェルまたは泡でそれらを除外すると、ワームから小さな破片を区別する。マニュアルの品質管理は、上記の理由から除外するためのフラグが設定され画像が必要であった。私たちは、ワームの開発（ 図3）の全ての段階で染色強度の一貫したメトリック提供、うまく渡ってワームエリアへも、正規化された全体で経験的にワームの画素の90パーセンタイル強度を発見した。ワームの領域にわたる総脂肪量の統合、これに反して、大薄暗いワームと同等に小さな明るいワームを獲得する傾向があるでしょう。本手法は強度パーセンタイルを講ずるに際しては、ワームの領域を完全に蛍光シグナルを統合していないため、それ自体がワームの大きさの変更は行いませんトンバイアスは強度が測定された。その代わりに、ピクセル強度分布の差を測定する。しかし、これにもかかわらず、顕著な違いは、異なる発達段階の動物との間の画素強度分布を染色で見られるので、それは同等の発達段階（ 図3）の動物に対して任意の遺伝子に対するRNAiの効果を検討することが重要です。レプリケート間の平均変動性は、脂肪染色法の高い再現性を示し、図4に示されている。メソッドの強度が同一の露光時間を用いて、均一な照明条件の下で、各プレートのために質の高い画像を得ることに大きく依存しており、最小限の泡、破片、または他のウェルにワームのクロスオーバーであることに注意してください。
SPEは、TAGがPLS（ 図5A）から分離することができる程度を決定するために予め混合し、精製された基準に基づいて行った。この分析では、我々は100％sを達成TAGとPLのeparationは、午後5時00 TAGのサンプルでPL由来の脂肪酸とPLサンプルのTAG（ 図5A）から派生した夜1時脂肪酸の対応する完全な不在の完全な欠如として示されている。したがって、SPEは脂質クラスを分離するのに非常に効率的です。この分析では、様々な鎖長のすべてのタグは、SPEが同等に精製し、同様の効率でGCMSにより検出されることを示すものではありません。それだけで合計でTAGとPL脂質が互いに完全に分離されていることを保証します。
固相抽出と名声準備を通って取らN2は野生型動物のサンプルのGC-MSトレースを図5Bに示されています。タグとPLの両方について、ピークは保持時間とマススペクトル上の親と娘イオンは、それぞれの内部標準の面積に正規同定されたピークの下の総面積に基づいて識別することができます。 TAGの正規化された量、面積を決定するために、TAGのクロマトグラムの全てのピークの下、午後1時00分標準除いて、一緒に添加し、午後1時ピーク下の面積で割った値です。同様に、午後05時を除いて標準正規総PL量、すべてのピークの下の領域を決定するために、一緒に加え、17時ピーク下の面積で割った。タグとPLサンプルの正規化された値は、次にサンプルのため最終的なタグPL /比率を計算するために使用されています：
それは、SPE-GCMSからデータがPL比の合計TAGの単純計算よりも、各脂質画分に存在する脂肪酸のはるかに洗練された分析を可能にすることに留意すべきである。例えば、研究者が単一の脂肪酸に対応する単一のピークを統合することができます（ 例えば、cサンプル間の正規化された豊かさを比較DAF-2 RNAiは午前17時のPL標準ピーク面積で割ったPLの質量に正規化された午後1時標準ピーク）で割った夜06時のピークの積分面積に対してN2は、野生型にomparing：
調査員が選択する必要があります、それはまた、脂肪酸の合計量の割合として、TAGまたはPL画分に任意の脂肪酸の割合を決定することが可能であろう（N2ワームのTAG画分中の午前18時00分例として定量）：
図1。全体の実験の典型的なワークフロー。1日目、凍結RNAiライブラリープレートはアンプ/テトLB寒天プレートに刻印して、37℃でインキュベート2日目は、アンプ/テトプレートは深井戸ブロックにおけるRNAiクローンの種子液体培養に使用されています。 3日目、細菌を遠心分離により濃縮し、96ウェルプレートのRNAiに転送されます。 4日目は、L1孵化後エレガンスは、液体でRNAiプレートに添加し、乾燥させる。 7日目に、動物は96ウェルテフロンスライドに載せ、40％イソプロパノールでナイルレッドで染色し、液体中に収集された、高スループットの顕微鏡で撮像する。
図2。主要な固定ベースナイルレッド汚れ
図3。脂肪量が異なる幼虫段階で固定ナイルレッド染色によって決定されます。動物はOP50細菌上に成長させて、L1で収集した、L2、L3、L4と妊娠成人の発達段階。画像は固定染色後にキャプチャされ、90 パーセンタイル oを決定するためにカスタマイズされたMATLABスクリプトを用いて分析した識別されたワームの領域上のfの画素強度。動物の脂質濃度は、動物がL2からL4の段階に進むにつれて大幅に増加した後、動物は成体の生殖細胞の増殖に向けてカロリーを流用し始めるとわずかに減少することに注意してください。示されたデータは、平均±SEMは6-8（対、両側t検定によって決定妊娠成人へ** P≤0.0001相対的に、）を複製します。
図4。独立した生物全体で、高い再現性が複製されます。示されては、生物全体でナイルレッドの蛍光強度の散布図は、（n = 6-8）複製されています。各反復では、すべての値が空のベクターコントロールの平均強度に正規化されます。示されたデータは、平均±SEM（**、P対によって決定≤0.0001相対的なコントロールに、両側t検定と仮定して平均値である等分散）。
図5。 GC-MSによるSPEの分離基準のクロマトグラムと野生型のTAGとPL豊富。（A）は、GC-MSトレースはTAGとPL規格のSPE分離の示されています。 PLからTAGの完全分離（tritridecanoin）（1,2 - diheptadecanoyl-sn-グリセロを示すPLトレース内の13時00脂肪酸の完全な欠如とTAGトレースで午後05時00分脂肪酸の対応が存在しないことを注意してください-3 -ホスホ-（1'-RAC-グリセロール））。 N2は野生型動物飼育ベクトル制御のRNAi（L4440空ベクトルのRNAiとHT115細菌）のサンプルからタグとPL（B）の代表的なフルスペクトル。サンプルの1マイクロリットルはプロトコルに従ってアジレント6890/5973N GCMSに注入し、個々のピークは網によって同定されたntion時間とそれぞれの質量スペクトル。略語：シクロシクロプロパン脂肪酸; ISO：ISO-メチル分枝鎖脂肪酸、GLAは、ガンマリノレン酸、α-リノレン酸、αリノレン酸、DGLA、ジホモガンマリノレン酸、EPAは、エイコサペンタエン酸は、 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
Discussion
提示プロトコルはCの脂質レベルの急速な、大規模なスクリーニングを可能にする簡単にハイスループットスクリーニングに適合させることができるエレガンス 。いくつかの凍結融解サイクル8,10続くホルムアルデヒドの長い固定ステップを伴う以前に使用されている方法とは異なり、我々のプロトコルはイソプロパノールでシンプルな3分の固定が必要です。我々が発見したCを染色することにより、イソプロパノール40％elegansは 、彼らは追加の凍結融解または固定ステップを使用せずに、ナイルレッドが自由に透過になります。ナイルレッドが選択的に緑のスペクトル18,19,31における疎水性の区画に蛍光を発するとしても、全く脱色は必要ありません。合計では、動物は、わずか2.5時間で染色し、画像の動物への準備へのRNAiのプレートから撮影することができます。この方法は、比較的安価かつ高い再現性で行うことができます。この方法は、Cの能力に依存しない取り込みまたは濃縮物に虫したがって染料し、重要な染料を使用してベースの方法を供給すると同じ制限を持っていません。測定の再現性と精度を考えると、この方法は、RNAiによる遺伝子の不活性化、多数のスクリーニングに適しています。脂質濃度の定量は、固定ナイルレッド染色に基づいて所望される場合、我々は4-6生物の使用をお勧めし、適切なコントロールおよび応用統計的検定で複製されます。
それは、小動物（遅れたり、逮捕された開発を引き起こしたRNAiクローンに起因する）につながる多くの遺伝子の不活性化とは関係なく、脂肪の代謝への接続の、脂肪レギュレータ用の画面から出てくるというのはよくあることです。我々はワーム領域に蛍光強度を正規化することにより、さまざまなサイズのワーム用のアカウントを利用し、画像解析プログラムが、個々の研究者はまた同じような発達段階の野生型動物と小動物の脂肪染色レベルを比較検討する必要があります。で見かけの低脂肪の質量を持つ小規模または発達逮捕動物の場合は、我々は、単一のモダリティが変更された脂質代謝を示すのに十分ではないことを示唆している。 SPE-GCMSを含むいくつかのフォローアップの実験は、これらの遺伝子の脂質調節機能を確認するために要求される可能性がある。既知の代謝レギュレータ用FASN-1 SPE-GCMS分析が発達マッチN2、L2対照動物と比較すると、成人の対照動物と比較したときに見つかった明らかな低脂肪の表現型を確認する必要がありました。ナイルレッド脂肪染色がステージにマッチしたL2制御RNAiの動物と比較して、大人のRNAiを制御するために相対的な低脂肪のレベルを示しているが、明らかな違いは見られなかった。したがって、第二の方法の使用は、TAG、PL /比すなわち生化学定量がFASN-1は脂肪量の真の制御因子であることを決定することが必要であった、FASN-1としてRNAiはステージにマッチしたL2制御RNAiの動物から生化学的に区別される。
20の上に、または従来の大きさのテフロンプリント8から12までよく顕微鏡スライド上にマウントされたワームから画像をキャプチャするために使用することができ。唯一の制限は、迅速ナイルレッドの光漂白剤で染色し、脂肪滴の緑の蛍光として、体系的、均一な露光条件は、画像間の比較可能性を確保するために使用する必要があるということです。私たちは、一様な画像取得の条件と完全に自動化された顕微鏡は、この効果に最も適していることを見つける。
このプロトコルの大きな強みの1つは、画像が収集された後、彼らは将来の再分析のために保存されるかもしれないということです。同じ画像は、脂肪含有量に加えて、体の大きさを決定するために使用することができる。計算プログラムは、より高度になると、さらに、統計的に有意な結果を生成し、単一ワーム分析のための見通しがある単一ウェルから。したがって、高スループット顕微鏡を利用し我々の手法では蛍光シグナル32,33を定量化するためにCOPASのBiosortを使用公表画面手法と比べていくつかの利点を持っています。しかし、方法論は間違いなく無料でご利用いただけます。
SPEとGC / MSによる脂質含量の正確な、生化学的測定は 、C言語の主要な脂肪質の店のナイルレッド染色を確認エレガンス 。固定ナイルレッド染色と生化学脂質決定から達成絶対定量は、しばしば完全には一致していませんが、両方のメソッドは定性的に一致し、再現性の高い、統計的に有意な結果を生成します。また、このメソッドはスフィンゴ糖脂質、リン脂質、または様々な試料中のトリグリセリドに存在する別のクラスの更なる分析が必要になることがあり、個々の研究者の特定のニーズを満たすように調整することができます。それは、他のグループは他の技術のthaを使用していることに留意すべきであるGC / MSで22の前の脂質クラスを分離するためのn個のSPE。薄層クロマトグラフィー（TLC）と高速液体クロマトグラフィー（HPLC）は、彼らが（ホスファチジルコリン、極性脂質からより独立した別個の中性脂質（ 例えば 、TAG、ジアシルグリセロール、遊離脂肪酸、コレステロールエステル）することが可能ということで、SPE上の利点があります。ホスファチジルエタノールアミン）とグリコール - スフィンゴ脂質。我々は、それが出発物質の最小値（2,500〜5,000ワーム）が必要ですので、それは中性脂質画分4の大部分を構成する主要な長期エネルギー貯蔵、タグを重視し、迅速であり、全く特殊な装置を必要としないまたはSPE選ぶプレート。これは、標準的な混合物に基づいて、SPEは完全にPLSからタグを分離し、（ 図5Aを参照してください）非常に再現性と信頼性があることを強調すべきである。脂肪酸メチルエステルの定量および分析はGC / MSを必要としますが、この装置がローカルで一般的に利用可能であり、そうでない場合、サンプルかもしれない上記のように生成され、協力者や商業、GC / MSによる分析サービスが配置されるまで、-80℃で窒素下で保存することができます。
GCMSの出力は、各脂質種内の各脂肪酸で高解像度のデータが含まれています。これは、比較サンプル間の詳細な相違の決定を可能にする。例として、治験責任医師は、特定の脂肪酸のレベルがDAF-2、LPD-3またはFASN-1 RNAiの対ベクトル制御も他のものよりもかなり豊富に変更されたかどうかを判断することができます。この非常に強力なツールは、したがって、脂質種は、任意の実験的操作と豊富で変更されている詳細な情報を提供することができます。
我々の分析のために、私たちはほとんどの場合、PL質量にTAGの質量を正規化します。タンパク質やDNAはまた、超音波処理したワームペレットのアリコートからの判定以下の脂質量を正規化するために使用することができるが、我々は、これらのメソッドはintへの対象であることに気付くすべてのピペット操作中に、各抽出物からの試料回収におけるヒューマンエラーをroduced。それは私達が私達の代わりに正規化係数としてPL質量を使用することを選択したのはこのためです。不自然な基準は、プロトコルの開始（TAGにtritridecanoin、1,2 - diheptadecanoyl-sn-グリセロ-3 -ホスホ- （1'-RAC-グリセロール）のPL用）で導入固相抽出のすべてのステップを通って運ばれ、 FAMEの準備、およびTAGとPL画分の両方を定量的かつ代表的な回復を保証します。調査官はTAGの質量を正規化するためにタンパク質やDNAを使用する場合と同じ保証を行うことはできません。我々は、PLは試料間でのタグ·レベルを比較していることで最も堅牢なゲージであると信じて、それが以前のPLだけ細かくTAGのレベル、 例えば拡張飢餓における大質量シフトをもたらす同じ刺激によって変更または運動34を増加させることが示されているように- 36。 PLは、膜の流動性と携帯INTEを確保、構造的役割を果たしていると考えられているむしろエネルギー貯蔵37から39としてよりgrityとシグナリングの役割。我々の手では、タグ/ PL比が最も密接にナイルレッドと固定ベースの脂質染色によって得られるものと一致し、他のグループ21によって検出されたことと一致する。代替戦略は脂質TAGのパーセンテージは、全脂質9,22,29に対して計算されるワット実験室で使用されます。
タグとPL標準の非ネイティブ型を使用してもネイティブ脂肪酸が正規の計算に含まれないことを保証します。鎖の長さの選択は純粋にネイティブ脂肪酸の質量スペクトルと干渉しないため、これらの規格の必要性に基づいている。私たちは、午後1時00分および17時の脂肪酸はこの目的のためにベストに役立つことを発見した。それは私たちの不自然な脂肪酸基準はすべての鎖長の脂肪酸またはdiffとチェーンの回復を表していない可能性があること、短鎖脂肪酸の異なる化学的性質を考えると、可能であるerent飽和指数。したがって、SPEまたはGCMS中、我々は様々な鎖長の脂質間の精製や検出効率の違いを見ている可能性がある。このおよびGCMSの異なる脂肪酸の異なるイオン化に基づいて、それは、任意の脂肪酸が豊富約absoluteステートメントを作成することはできません。したがって、我々は、任意の特定の脂肪酸の単一の実験の存在量内のサンプル間で比較する。 1は絶対に一つの方法は、脂肪酸を定量したいのであれば、これはそれができるように、上記のようにそのまたは類似の脂肪酸の安定同位体で標識された13 Cバージョンの既知量をスパイクして調製したサンプルを実行することです達成することができた例えば、MSD内の親イオンの質量に基づいて区別。我々は唯一の脂質クラスまたは任意の脂肪酸の相対量を比較していることを考えると、私たちの午前13時と17時のTAG PLの標準規格は改善され、コストの最小値で、十分にこの目的を果たす各脂質クラスの適切かつ代表的な回復を保証します。
この時点まで、様々な方法論によって得られた特定の結果の解釈、に及び現行の方法論がどうあるべきかに関してコンセンサスの欠如があった。全体的には孤立して誰も方法が理想的にCの脂肪の代謝を研究するのに適していないことに留意すべきであるエレガンス 。ただし、複数のスクリーニングおよび検証モダリティを使用することによって、人は脂質調節遺伝子について得られたデータの信頼性を達成することができます。したがって、私たちはCの分野で今後の活動のためのベンチマークとして機能するように、我々のプロトコルを意図エレガンス脂肪研究。
Disclosures
著者らは、開示することは、競合する利害関係はありません。
Acknowledgments
我々は議論して原稿を読み取るための技術支援とLianfeng呉用マイケルKacergisに感謝したいと思います。この作品は、NIH / NIDDK（AASへK08DK087941）からキャリア開発賞は、NIH / NIDDK訓練助成金（ECPに5T32DK007028）、老化賞エリソン医学財団新奨学生（AAS）、およびチャールズHによってサポートされていましたフッド財団母子保健研究賞（AAS）である。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-pin replicator | Nunc | 250520 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| LB Agar | US Biologicals | L1500 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Mechanical Pipettors | Biohit M Line | M10, M100, M300 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Electronic Pipettor | Biohit E Line | E1200 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1 M KH2PO4 | Sigma | P0662 | pH 6.0 Sterilized by Autoclaving | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1 M MgSO4 | Sigma | M2643 | Sterilized by Autoclaving | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1 M CaCl2 | Sigma | C2661 | Sterilized by Autoclaving | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| NaCl | Sigma | S5886 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 5 mg/ml Cholesterol | Sigma | C8667 | In 100% Ethanol | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 200 mg/ml Carbenicillin | US Biologicals | C1100 | Filter Sterilized 0.2 μ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1 M IPTG | US Biologicals | I8500 | Filter Sterilized 0.2 μ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 100 mg/ml Ampicillin | Filter Sterilized 0.2 μ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 5 mg/ml Tetracycline | In 100% Ethanol | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bacto Agar | BD | 214040 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-well TC Plates | BD-Falcon | 353072 | For 96-well RNAi | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Rectangular A/T Plates | Thermo Scientific | 242811 | For stamping RNAi | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| LB Media | US Biologicals | L1530 | Prepared as per manufacturer instructions | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-well Deep Well Assay Blocks | Corning | Costar 3960 | Rectangular V-bottom assay block | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-well Shallow Well Assay Block | Corning | Costar 3956 | Round V-bottom assay block | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sterile Sealing Film | VWR | 89134-432 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Aluminum Sealing Film | Corning | Costar 6570 | Thermowell Sealing tape for 96-well plates | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| M9 Buffer | See Hope et al.20 | See recipe below | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Triton X-100 | Bio-Rad | 161-0407 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Nile red | Invitrogen | N-1142 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Isopropanol | Fisher | BP2632-4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-pin aspirator | VP Scientific | VP177A-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-well Teflon Masked Microscope Slides | Thermo Scientific | Custom | Can also order Trevigen 96-well Cometslide | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-well Gold-Seal Coverslides | Thermo Scientific | Custom | Can also use second 96-well Cometslide | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Deep-well PCR plate | VWR | 89049-178 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Non-sterile adhesive film | VWR | 60941-070 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| High-Throughput Microscope | Leica | DM6000 fully automated with Prior 96-well stage | With Chroma 49002 GFP filter set and 2x objective | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bath Sonicator | Diagenode | Bioruptor XL | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Chloroform | Sigma | 366927-4L | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Methanol | Fisher | Optima F456-4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Phospholipid Standard | Avanti Polar Lipids | 830456P | 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Triglyceride Standard | NuChek Prep | T-135 | tritridecanoin | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Wiretrol 50 μl Pipet | Fisher | 21-176-3A | Drummond Scientfic | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Acetone | Sigma | 320110-4L | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sulfuric Acid | Fisher | A300-500 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Hexane | Fisher | Optima H306-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| SPE Silica Column | Thermo Scientific | 60108-317 | Hypersep SI, 100 mg resin bed | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Solid Phase Chromatography Manifold | Sigma | 57265 | Supelco Visiprep 24-DL | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Borosilicate Pipets | Fisher | 13-678-27F | 10 ml size | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Borosilicate Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-8B | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Borosilicate Culture Tubes | Fisher | 14-961-27 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Threaded Borosilicate Tubes | VWR | 14235-460 | 8 ml capacity | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Phenolic Caps for Culture Tubes | Fisher | 14-823-211 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| GC/MS Autosampler Vials | Agilent | 5188-6592 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Caps for Autosampler Vials | Agilent | 5185-5861 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| GC/MS | Agilent | 6890 GC / 5973 MSD | Outfitted with a Supelcowax-10 column | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Nematode Growth Media (NGM): for 25 96-well RNAi plates, prepare 1 L of NGM:
Rectangular Ampicillin/Tetracycline LB Agar Plates (A/T): for 20 A/T plates, prepare 1 L of media:
LB bacterial growth media: for 4 L, sufficient for growing and resuspending 25 96-well blocks Mix 62 g LB powder (US Biologicals), 4 L distilled water, and 4.8 ml 2 M NaOH. Autoclave in 1 L or 0.5 L aliquots, liquid cycle, 40 min. Can be stored up to 1 year in airtight bottles at room temperature. Discard if cloudy. 100 mg/ml Ampicillin Mix 5 g ampicillin powder and deionized water to a total volume of 50 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use. 5 mg/ml Tetracycline Add 1.25 g tetracycline powder to 250 ml 100% ethanol. Mix well until fully dissolved and store at -20 °C in a light-tight container. 200 mg/ml Carbenicillin Mix 10 g carbenicillin powder and deionized water to a total volume of 50 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use. 5 mg/ml Cholesterol Add 1.25 g cholesterol to 250 ml 100% ethanol. Mix well and store at 4 °C for up to 6 months. 1 M MgSO4 Dissolve 120.37 g MgSO4 in 800 ml deionized water. Bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature. 1 M CaCl2 Dissolve 110.98 g CaCl2 in 800 ml deionized water. Bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature. 1 M KH2PO4, pH 6.0 Dissolve 136.09 g KH2PO4 in 800 ml deionized water. pH to 6.0 and bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature. M9 Buffer: for 1 L—we routinely make 8-10 L batches Dissolve 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4 in 900 ml. Bring final volume to 1 L. Aliquot in 100-500 ml bottles and autoclave 40 min on liquid cycle and store at room temperature. 10 N NaOH Dissolve 400 g NaOH in 800 ml deionized water, allow to cool and bring to a final volume of 1 L. Store in 50 ml tubes at room temperature. 1 M IPTG Add 23.81 g IPTG to deionized water and bring total volume to 100 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use. Egg Preparation Bleach/NaOH Solution: 20 ml sufficient for one egg preparation Add 4 ml bleach, 1 ml 10 N NaOH, 5 ml H2O, and 10 ml M9 buffer to a 50 ml polypropylene conical tube. Make immediately before use. Nile red stock solution Add 50 ml 100% Acetone to 25 mg Nile red powder. Mix well and store at room temperature in light-tight parafilmed container. Can be stored for months in this manner. Nile red staining solution: for 500 ml, sufficient for staining 30 x 96-well plates Add 3 ml Nile red stock solution to 500 ml 40% v/v isopropanol. Store at room temperature in foil-wrapped glass bottle. Prepare immediately before use. Phospholipid Standard Weigh 7.6 mg phospholipid standard, 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol), in a glass beaker. Dissolve in 20 ml 2:1 chloroform:methanol (25 nanomoles per 50 μl). Keep covered with aluminum foil until use. Standard can also be kept at -80 °C in an airtight glass vial with phenolic cap for 1 year. Triglyceride Standard Weigh 6.8 mg triglyceride standard, tritridecanoin, into a glass beaker. Dissolve in 30 ml 2:1 chloroform:methanol (16.7 nanomoles per 50 μl). Keep covered with aluminum foil until use. Standard can also be kept at -80 °C in an airtight glass vial with phenolic cap for 1 year. |
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References
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