Summary
نقدم قوية أساليب الكيمياء الحيوية والمجهرية لدراسة
Abstract
والديدان الخيطية C. كما برز ايليجانس نموذجا هاما لدراسة مسارات الوراثية الحفظ تنظيم التمثيل الغذائي للدهون من حيث صلته السمنة والأمراض البشرية المرتبطة به. المنهجيات السابقة عدة وضعت لتصور C. وقد أثبتت ايليجانس الدهون الثلاثية الغنية مخازن الدهون لتكون خاطئة، وتسليط الضوء مقصورات الخلوية الأخرى من قطرات الدهون. أساليب أخرى تتطلب معدات متخصصة، تستغرق وقتا طويلا، أو تسفر عن نتائج غير متسقة. ونحن نقدم ل، استنساخه السريع، مثبت على أساس تلطيخ حمراء النيل طريقة للكشف السريع والدقيق من قطرات الدهون محايدة في C. ايليجانس. خطوة قصيرة في تثبيت الأيزوبروبانول 40٪ يجعل الحيوانات قابلة للاختراق تماما إلى اللون الأحمر النيل، والذي يستخدم بعد ذلك لوصمة عار الحيوانات. الخواص الطيفية لهذه الصبغة محبة للدهون يسمح لها بقوة وبشكل انتقائي يتألق في الطيف الأصفر والأخضر عند فقط في بيئة غنية بالدهون يمكن، ولكن ليس في أكثرالقطبية البيئات. وهكذا، يمكن أن قطرات الدهون يمكن تصور على المجهر الفلورسنت مجهزة بسيطة GFP قدرة التصوير إلا بعد خطوة قصيرة النيل تلطيخ حمراء في الأيزوبروبانول. السرعة، القدرة على تحمل التكاليف، واستنساخ هذا البروتوكول جعلها مناسبة بشكل مثالي لشاشات إنتاجية عالية. علينا أن نبرهن أيضا وسيلة لتحديد الاقتران البيوكيميائية من الدهون الثلاثية والدهون الفوسفاتية باستخدام الغاز اللوني الطيفي الشامل. وينبغي استخدام هذا البروتوكول أكثر صرامة وتأكيد النتائج التي تم الحصول عليها من الدهون تقرير الأحمر النيل المجهرية. ونحن نتوقع أن هذه التقنيات سوف تصبح معايير جديدة في مجال C. ايليجانس البحث الأيض.
Introduction
حفظ المسارات الأيضية بين البشر والديدان الخيطية Caenorhabditis ايليجانس يجعل من كائن نموذج قوي لدراسة السمنة. بينما C. ايليجانس لم يكن لديك الخلايا الشحمية مخصصة لتخزين الدهون في الثدييات مثل، فإنها مخزن الدهون الثلاثية في قطرات الدهون (1) وتملك العديد من المنظمين من نفس تخزين الدهون واستخدام الطاقة 2،3. لفحص لمستويات الدهون في C. ايليجانس، تم اقتراح عدة أساليب مع مستويات مختلفة من سهولة ونجاح. وقد دعا مؤخرا استخدام مرة واحدة مشتركة من الأصباغ، فلوري الحيوية 4-7 في السؤال، وهذه الكواشف ثبت أن تلطيخ مقصورة متميزة من مستودع تخزين الدهون الرئيسية للC. ايليجانس 1،8-11. مثبت على أساس غير الفلورية الأصباغ، مثل الأسود والنفط السودان الحمراء O-، في حين نجحت في تسليط الضوء على قطرات الدهون في الدودة 12-14، كما لم يكن لديك مجموعة كبيرة ديناميكية لتحديد الكميات وfluoresالأصباغ 8،13،15 المائة. وعلاوة على ذلك، الأساليب المتبعة حاليا في تثبيت الأصباغ لكلا الفلورية وغير الفلورسنت، تستغرق وقتا طويلا وتنطوي على عدة خطوات تجميد ذوبان الجليد و / أو استخدام المواد الكيميائية السامة 1،9،10. تم إبلاغ الإدارة عن استخدام الدهون BODIPY محددة النظير التي تحمل علامات لتسليط الضوء على قطرات الدهون عند تغذية الديدان تعيش مع وضع العلامات على المدى القصير 15. ولكن هذا يعتمد على امتصاص الصبغة ومنحازة لذلك من قبل C. ايليجانس المناولة والتمثيل الغذائي للBODIPY النظير الأحماض الدهنية. بديل للدهون، التي أنشئت لتلطيخ الأصباغ هي التسمية خالية ومتماسكة لمكافحة ستوكس نثر رامان (CARS) أو نثر رامان حفز (SRS) المجهري، والتي تستفيد من خصائص مميزة الذبذبات من الجزيئات الدهنية لتصور مخازن الدهون 10،16، 17. ومع ذلك، المعدات المتخصصة مكلفة ضروري لهذا الأسلوب، والإنتاجية منخفضة في أحسن الأحوال.
لتلبية حاجة للanaly وسريعة قابلة للتطويرالهيئة العامة للاستعلامات من مخازن الدهون محايدة في C. ايليجانس البحث الأيضية، ونحن نقدم رواية وطريقة استنساخه للغاية من مثبت القائم على النيل تلطيخ الدهون الحمراء. الخواص الطيفية والفيزيائية والكيميائية للدهون الأحمر صبغ النيل لحث على التحول الأصفر والذهب الأطياف في ذروة الإثارة في الانبعاثات، والسماح لها يتألق في الطيف الأخضر عند الانبعاثات فقط في بيئة غنية بالدهون يمكن، ولكن ليس في البيئات القطبية أكثر 18 ، 19. بالتالي يمكن الكشف عن قطرات الدهون بعد تلطيخ بسيطة عن طريق استخدام فلتر الفلورية الخضراء (GFP) تعيين البروتين للفحص المجهري مضان. سهولة والقدرة على تحمل تكاليف هذه التقنية تجعل من مناسبة بشكل مثالي لشاشات إنتاجية عالية. علينا أن نبرهن أيضا مقترن، طريقة دقيقة جدا لتحديد البيوكيميائية من الدهون الثلاثية والدهون الفوسفاتية باستخدام الصلبة استخراج الغاز والمرحلة الطيف اللوني الشامل. البيوكيميائية قياس الدهون يرتبط بتصميم المجهرية النيل الأحمر القائم على C. ايليجانس كرة القدموينبغي أن تستخدم ر الشامل، وتأكيدا للنتائج التي بعزم الدهون المجهرية.
Protocol
1. إعداد الأمبير مستطيلة / تيت (A T /) لوحات أجار LB وNGM لوحات IPTG رني
وينبغي إعداد لوحات / T 1-4 أسابيع قبل استخدامها وتخزينها في الظلام في C. ° 4
- ل1 L من وسائل الإعلام إضافة 1 L منزوع الأيونات الماء، 32 أجار LB غرام، 1.5 مل 2 M هيدروكسيد الصوديوم، و 2 أجار Bacto ز. الأوتوكلاف 40 دقيقة على دورة السائل. بعد التبريد إلى 60 درجة مئوية، إضافة التتراسيكلين 3 مل و 0.5 مل الأمبيسلين. صب 45 مل من وسائل الإعلام في كل لوحة.
إعداد 96-وحات جيدة رني 3 أيام لتصل إلى 2 أسابيع مقدما.
- صب 25 96 لوحات جيدة رني، وإعداد 1 L من الديدان الخيطية نمو وسائل الإعلام (NGM): 1 L منزوع الأيونات الماء، 3 غرام كلوريد الصوديوم، 17 ز الاغاروز، و 2.5 bactopeptone ز. دورة السائل الأوتوكلاف في 121 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة مع قضيب تحريك. السماح لتبرد، واثارة على مجموعة صفيحة ساخنة إلى 60 ° C.
- عندما تبرد إلى 60 درجة مئوية، إضافة الأسهم الحلول التالية: 1 1 مل M MgSO 4، 1 مل 5 ملغ / مل الكولسترول، 25 1 مل M KH 2 4 (الرقم الهيدروجيني 6.0)، 1 مل 1 M CaCl 2، 1 مل 200 ملغ / مل كربنيسيلين، و 5 مل 1 M IPTG (انظر الجدول عن وصفات المواد).
- الاستغناء 150 ميكرولتر من وسائل الإعلام في كل رني جيدا لوحة 96-مسطحة القاع جيدا باستخدام pipettor متعددة القنوات الإلكترونية. تجنب فقاعات الهواء. إبقاء وسائل الإعلام في وعاء الفولاذ المقاوم للصدأ يغطس في حمام مائي 60 ° C بينما الاستغناء.
- الحفاظ على مستوى لوحات رني حتى يتصلب الاغاروز. يمكن سكب لوحات لتصل إلى 2 أسابيع مقدما وتخزينها في C. ° 4
يوم 1
2. القضاء على لوحات المكتبة مجمدة الأمبير مستطيلة / تيت (A / T) لوحات أجار LB
- لوحات الحارة A / T إلى درجة حرارة الغرفة، وحفظ لهم في الظلام.
- نقل مكتبة رني 96-وحات جيدة من -80 درجة مئوية حتى يجف الجليد. فتح لوحة الألمنيوم مختومة بالقرب من الموقد بنسن.
- منزوع الأيونات H 2 O وتعقيم دبوس المكرر 96-بغمر دبابيس متسلسل (10 ثانية لكل منهما) في التبييض 10٪، 70٪ وEيتبع توه عن طريق تمرير من خلال الدبابيس الموجودة في لهب. كرر الخطوة EtOH واللهب.
- تطبيق النسخ المتماثل ل96-المجمدة جيدا الأسهم الجلسرين رني، والتأكد من كل دبوس اتصالات سطح كل بئر.
- القضاء على صفيحة / T، رسم دائرة صغيرة مع كل دبوس دون سطح أجار الضارة.
- إعادة الختم ومكتبة العودة إلى لوحات -80 درجة مئوية. يختم احتضان لوحات A / T عند 37 درجة مئوية خلال الليل لنمو البكتيريا.
يوم 2
3. تنمو بين عشية وضحاها النسخ رني الجرثومي في أعماق كتل جيدا
- إزالة لوحات / T من 37 ° C وتأكيد نمو البكتيريا.
- ملء كل بئر من كتلة 96-جيدا في آبار عميقة مع 1.5 مل من LB مع 200 ميكروغرام / مل كربنيسيلين.
- تعقيم دبوس 96-المكرر (راجع الخطوة 2.3).
- تطبيق النسخ المتماثل إلى الأعلى من لوحة A / T، مما يجعل متأكد من دبابيس اجراء اتصالات مع كل استنساخ رني البكتيرية. رفع المكرر ودبابيس تزج في كتلة في آبار عميقة. دوامة، وإزالة ببطء، مما يجعل مrtain عدم تلوث الآبار المجاورة.
- ختم كتلة مع التنفس سهلة الفيلم. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع الإثارة (950 دورة في الدقيقة في Infors MT شاكر II Microtiteron، المفضل، أو 250 دورة في الدقيقة في حاضنة MM-25 تهز رمي).
اليوم 3
4. البذور النسخ رني البكتيرية على 96-وحات جيدة رني NGM
- إزالة 96-وحات جيدة رني من 4 ° C والحارة إلى درجة حرارة الغرفة.
- إزالة كتل في آبار عميقة وأجهزة الطرد المركزي في 10 دقيقة ز X 4،000.
- عكس الكتل بسرعة في بالوعة لتصريف سائل الإعلام، والقضاء على منشفة ورقية مقلوب للقضاء على وسائل الاعلام الزائدة.
- الصفحي تحت غطاء محرك السيارة التدفق، اضافة 40 ميكرولتر من LB مع 200 ميكروغرام / مل كربنيسيلين إلى كل بئر وختم مع فيلم العقيمة.
- العودة إلى كتل درجة حرارة الغرفة شاكر البكتيرية لمدة 10 دقيقة ل resuspend الكريات، أو إعادة تعليق يدويا بواسطة الكريات pipetting حذرا.
- الصفحي هود في التدفق، وإزالة البكتيريا وفيلم معقمة نقل من أعماقكذلك الكتل على لوحات رني 96-أيضا. اضافة 40 ميكرولتر من البكتيريا معلق إلى 'A' الصفوف و 'H'، وميكرولتر 35 من جميع الصفوف الأخرى. يضاف إلى الآبار أكثر سيولة حافة لوحة رني 96-overdrying جيدا لمنع تشقق والاغاروز.
- ترك لوحات كشفت ليجف في غطاء محرك السيارة لمدة 4-6 ساعة، وتفتيش منتظمة للجفاف. البكتيريا الجافة تظهر واضحة، وليس غائما. تغطية، عكس لوحات واحتضان في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
5. إعداد السكان متزامن من الديدان
وتستخدم صفيحتين 10 سم مليئة الديدان حامل كثيرة لإعداد البيض لوحات كل 6 رني 96-أيضا. تأكد الديدان غير المتعطشة لجيلين على الأقل (7 أيام).
- إعداد وقت واحد من السكان L1 كما هو موضح سابقا 20. لمدة 20 مل من محلول التبييض، التبييض استخدام 4 مل، 1 مل هيدروكسيد الصوديوم (10 M)، 5 مل منزوع الأيونات H 2 O، و 10 مل العازلة M9.
- مزامنة بين عشية وضحاها في الديدان M9 10 مل في 15 مل العقيمةأنبوب البولي بروبلين مع التناوب في 20 ° C.
يوم 4
6. إضافة إلى لوحات الديدان رني
- أجهزة الطرد المركزي محضرات البيض عند 3،000 x ج لمدة 1 دقيقة. نضح طاف، والبقاء بعيدا عن بيليه من L1 سلحفاة صغيرة. resuspend في 5 مل العازلة M9 مع تريتون X 0.0005٪-100. إضافة كمية صغيرة من المنظفات يمنع الديدان من الالتصاق إلى ماصة وليس له تأثير على تلوين الدهون.
- عد الديدان تحت المجهر. إذا لزم الأمر، وضبط تركيز الديدان إلى 10-15 لكل ميكروليتر.
- الصفحي هود في التدفق، ولكل لوحة 96-فعلا إلى أن يكون المصنف، إضافة 75 ميكرولتر من الديدان معلق في كل بئر من صف واحد من كتلة مقايسة الضحلة جيدا. باستخدام ماصة الأقنية اليدوية، إضافة 50-75 الديدان في 5 ميكرولتر في كل بئر من لوحات رني 96-أيضا.
- السماح لوحات ليجف في غطاء محرك السيارة لمدة 30 إلى 60 دقيقة. عندما تجف، تحت المجهر، يجب الديدان يبدو أن الزحف، وليس سحق.
- تنمو الديدان على لوحات رنيفي 20 درجة مئوية لمدة ساعة 64 ~.
يوم 7
7. إصلاح وصمة عار في الديدان الأحمر النيل
- إزالة لوحات رني من الحاضنة. دراسة تحت المجهر وسجل المتعطشة أو سحق (الرطب) بئرا لاستبعاد من مزيد من التحليل، إذ أن هذه الظروف تؤثر على كتلة الدهون.
- باستخدام pipettor تكرار الإلكترونية، إضافة PBS 150 ميكرولتر مع تريتون 0.01٪ X-100 إلى كل بئر من لوحة رني. مع دليل مزيج متعدد القنوات، وسائل نقل pipettor مع الديدان إلى الصف المقابل في لوحة PCR-96-العميق أيضا. تجنب تعطيل أجار. تكرار لما مجموعه 300 ميكرولتر الديدان في PBS لكل بئر.
- عندما يتم تحويل لوحات الأربعة، لوحات أجهزة الطرد المركزي في 500 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة.
- نضح طاف باستخدام الشافطة فراغ 96-PIN، وترك ~ 25 ميكرولتر السائل ودودة بيليه في أسفل البئر.
- إضافة 150 ميكرولتر من 40٪ الأيزوبروبانول إلى كل بئر لإصلاح الحيوانات. تأكد من أن pipettor على سرعة عالية بما فيه الكفاية لخلط دودةبيليه مع 40٪ الأيزوبروبانول. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
- لوحات أجهزة الطرد المركزي في 500 دورة في الدقيقة كشفت عن 1 دقيقة.
- نضح طاف باستخدام الشافطة 96-PIN أو يدويا، ولم يتبق سوى سعة 25 ميكرولتر 40٪ الأيزوبروبانول + بيليه دودة في أسفل البئر.
- إلى كل بئر، إضافة 150 ميكرولتر من محلول النيل تلطيخ حمراء مباشرة قبل إعداد استخدام: 6 ميكرولتر الأسهم الحمراء النيل حل من 0.5 ملغ / مل في الأسيتون لكل 1 مل من 40٪ الأيزوبروبانول.
- لوحة الختم مع فيلم لاصق غير معقمة وصمة عار في الظلام لمدة ساعة على الأقل 2.
8. غسل والديدان على صورة مجهر عالي الإنتاجية
- أجهزة الطرد المركزي في 500 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة ونضح جميع لكن 25 ميكرولتر من النيل الأحمر صباغة.
- إضافة 150 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني مع تريتون 0.01٪ X-100 إلى كل بئر ومخزن في الظلام لمدة لا تقل عن 30 دقيقة.
- أجهزة الطرد المركزي في 500 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة.
- باستخدام pipettor 12-قناة والحيوانات الرشفة من أسفل كل بئر مع 2 ميكرولتر 7 × السريع السكتات الدماغية والاستغناء على شريحة زجاجية جيدا 96-تفلون المطبوعة. بعناية، دون إزالة الديدان، وإزالة 9،5 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني من كل جانب من الشريحة. إذا الشريحة الزجاجية لا يتناسب مباشرة في جبل المجهر الخاص بك، يجب استخدام مخصص الشريحة الألومنيوم تشكيله حامل لتركيب الديدان.
- انخفاض ببطء غطاء قابل للانزلاق على الشريحة 96-أيضا. قد تستغرق هذه الخطوة بعض الممارسات لتجنب فقاعات أو عبر أكثر من الديدان في آبار أخرى. آمنة مع زوايا تك لاصقة.
- الشريحة الصورة في الحقل مشرق ومضان GFP مع فلتر / FITC تعيين على مجهر الآلي. وphotobleaches إشارة الدهون بسهولة لذا يجب تصويرها بطريقة منهجية في جميع الآبار، وليس يدويا، وسوف photobleaching تؤدي إلى اختلافات مصطنعة بين الآبار. لمزيد من التفاصيل حول التحليل، يرجى الاطلاع على النتائج ومناقشة الممثل.
9. البيوكيميائية تقدير الدهون الصلبة عن طريق استخراج المرحلة (SPE) والغاز الطيف اللوني الكتلة (GC / MS)
لا يمكن أن يؤديها "jove_content"> للتأكد من صحة مستويات الدهون يعتمد على النيل الأحمر مضان، الغاز اللوني تليها تحليل الطيف الكتلي (GC / MS) على حمض الدهنية استرات الميثيل (FAME) المستمدة من زعت عشوائيا (TAG) والدهون الفوسفاتية (PL) من دودة الكريات. يجب أن يتم تنفيذ الخطوات التي تنطوي تحت غطاء العضوية الدخان. وينبغي الحرص على أن يتم الاحتفاظ الدهون تحت النيتروجين محمية من الضوء أثناء التخزين الموسعة أو الحضانة الخطوات كما هي عرضة للأكسدة. وتستخدم الكريات دودة من الحيوانات 2،500-5،000 كمدخل متزامن، أعدت بالضبط على النحو الوارد أعلاه باستثناء تزرع أن الحيوانات في 10 لوحات رني سم.
- 2،500-5،000 من الديدان غسل كل لوحة 10 سم مع 10 مل العازلة M9 في أنبوب 15 مل المخروطية البولي بروبلين. بيليه في 500 XG الديدان لدقيقة واحدة، وغسل بيليه مرة أخرى مع 10 مل العازلة M9. الحيوانات بيليه في ز × 500. نضح ترك 250 الحجم الإجمالي ميكرولتر، وتجميد إما على النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية تحت النيتروجين FOR تجهيز في وقت لاحق أو الانتقال مباشرة.
- يمكن أن تؤخذ على دودة بيليه مباشرة إلى الخطوة 9.3 إذا الشامل الدهون الثلاثية هي أن تطبيع الشامل لفسفوليبيد 8،13،21. ومع ذلك، إذا رغب المحقق التطبيع إلى المضمون أو المحتوى البروتين DNA، ينبغي sonicated بيليه دودة على أعلى كثافة في sonicator حمام لمدة 10 دقيقة، 30 ثانية على، 30 ثانية باتجاه آخر، في 4 درجات مئوية. إذا هو المطلوب البروتين DNA أو التطبيع، وإزالة 5 ميكرولتر وتحديد تركيز البروتين الكلي باستخدام كاشف برادفورد أو ما شابه ذلك أو الكلي محتوى DNA بعد تنقيتها باستخدام عمود الطيف فوق البنفسجية.
- إضافة إلى 1.5 الديدان كلوروفورم 02:01 مل: الميثانول في أنبوبة زجاجية البورسليكات مترابطة. وينبغي أن يتم نقل جميع المذيبات العضوية باستخدام ماصات زجاجية.
- باستخدام ماصة 50 ميكرولتر wiretrol، إضافة 25 نانومتر في مستوى فسفوليبيد 50 ميكرولتر، و 16.7 نانومتر في مستوى الدهون الثلاثية 50 ميكرولتر. توج الميثانول، بإحكام،: يجب حل كل المعايير في 02:01 الكلوروفورموتخزينها تحت النيتروجين محمية من الضوء في الفريزر -80 ° C لتجنب الأكسدة.
- كاب مع غطاء الفينولية ودوامة. استخراج لمدة 1 ساعة عند RT، vortexing كل 15 دقيقة.
- أجهزة الطرد المركزي في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. نقل المرحلة العضوية دون أدنى جثث لأنبوب الثقافة البورسليكات.
- إضافة 0.3 مل 0.9٪ كلوريد الصوديوم، وأجهزة الطرد المركزي في دوامة 1،000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
- نقل الطبقة السفلية العضوية لأنبوب الثقافة البورسليكات الطازجة، والتأكد من عدم نقل أي من أكثر من المرحلة المائية.
- المرحلة العضوية الجافة تحت النيتروجين. إعادة تعليق لبدء استخراج الطور الصلب (SPE) الدهون المجففة في 1 مل كلوروفورم. بدلا من ذلك، لفصل مفصلة وتحليل الطبقات الدهنية متميزة، بما في ذلك الطبقات فسفوليبيد، السكرية، الدهون الإسفنجية، diacylglycerols، زعت عشوائيا، والأحماض الدهنية الحرة، واسترات الكولسترول، رقيقة اللوني طبقة رائدة كما المختبر واتس في C. ويمكن استخدام ايليجانس 22 في مكان SPE. قد الدهون أيضا به مفصولة HPLC والكسور تحليلها من قبل GCMS. ويمكن أيضا أساليب متطورة من كامل lipidome التنميط بواسطة liquid-chromatography/MS (LCMS) يمكن أن تستخدم 23-26.
- تجميع السيليكا العمود SPE على SPE متعددة. قبل تتوازن مع العمود كلوروفورم مل 3. السماح لتدفق المذيبات عن طريق الجاذبية.
- تحميل عينة الدهون على العمود SPE، وجمع في التدفق من خلال أنبوب البورسليكات الخيوط كجزء من الكسر الأول (TAG جزء). ومعظم الدهون محايدة تأتي من خلال في هذا مل 1 أولا التدفق من خلال. إضافة إلى 3 مل كلوروفورم أزل بالكامل جزء TAG، وجمع التدفق من خلال أنبوب في TAG الكسر.
- إزالة الأنبوب وكاب جمع الأولى، واستبدالها مع أنبوب جمع نظيفة. أزل الشحميات السفنغولية السكرية مع 5 مل من الاسيتون 09:01: الميثانول. نحن لا نحلل بشكل روتيني تكوين الأحماض الدهنية من هذا الكسر، ومع ذلك، فإنه قد تحتوي على معلومات قيمة ويمكن حفظ لإعداد استرات الميثيل وقواعد sphingoid مجانا لمزيد من التحليل باستخدامالمتخصصة إجراءات مختلفة عن تلك الخاصة TAG وPL كما هو موضح سابقا 27.
- استبدال أنبوب جمع glycosphingolipid مع الخيوط ثانية أنبوب جمع البورسليكات. أزل الفوسفورية مع الميثانول مل 3 (PL آسر).
- ويمكن تخزين الكسور في -80 ° C في هذه المرحلة توج بإحكام تحت النيتروجين. تنقية جافة الدهون تحت النيتروجين. لتسريع التجفيف، في كتلة التدفئة الجافة في 33 ° C. أبدا تخزين الدهون في شكل المجففة، لأنها معرضة بصفة خاصة للأكسدة في حالة الجفاف.
- توج الكسور إعادة تعليق الدهون المجففة في 2 H 2٪ 2 SO 4 مل في الميثانول من vortexing واحتضان بين عشية وضحاها بإحكام في حمام مائي 55 ° C لإنشاء جوع. يجب الحرص على الحصول على اي رد فعل المياه في FAME حيث سيؤدي ذلك إلى حد كبير منع الاشتقاق من الدهون. الاشتقاق وجدنا أكثر كفاءة من خلال الحضانة بين عشية وضحاها، وتقترح الأدبيات أكسدة الدهون أقل يحدث في درجات حرارة منخفضة الدورينانوغرام FAME إعداد 28. أسلوب بديل وسريع أكثر هو استخدام 2 مل 2.5٪ H 2 SO 4 في الميثانول وderivatize لمدة ساعة في 70 أو 80 ° C 21،22،29.
- في صباح اليوم التالي، وإزالة من الحمام، والسماح لتبرد. إضافة 1.5 مل H 2 O (لإرواء رد الفعل)، ثم 0.3 مل هكسان (لاستخراج جوع) إلى كل جزء وTAG PL. ويهز بقوة الطرد المركزي في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
- إزالة بعناية جدا فقط طبقة الهكسان الأعلى باستخدام ماصة باستور القياسية أو ماصة. الاستغناء في أنبوب الاوتوماتيكى. التأكد من عدم إدراج أي الميثانول المحمض حيث سيؤدي ذلك إلى تدمير العمود وMSD GC.
- غطاء وعينات تحميل على GC / MS. يتم نقل العينة في الهكسان إلى قارورة صغيرة اجيلنت إدراج توج مع وضع حد أقصى المسمار PTFE-سيليكون PTFE. يتم نقله إلى نموذج اجيلنت 6890/5973N GCMS تجهيزه مع Supelcowax-10 (24079) 30 متر، 250 ميكرون العمود الشعري السيليكا تنصهر. يتم حقن أحد ميكروليتر الباحثالزراعة العضوية مدخل إنعدام التقسيم تعيين في 250 ° C ويستخدم و13،33 PSI الهيليوم غاز النقاوة الناقل. على المدى البروتوكول هو على النحو التالي في 1 مل المستمر في الحد الأدنى:
| خطوة | تعليمات | الهدف الحرارة |
| 1 | عقد 2 دقيقة | 150 درجة C |
| 2 | منحدر 10 ° C لكل دقيقة | 200 درجة C |
| 3 | عقد 4 دقائق | 200 درجة C |
| 4 | منحدر 5 ° C لكل دقيقة | 240 ° C |
| 5 | عقد 3 دقائق | 240 ° C |
| 6 | منحدر 10 ° C لكل دقيقة | 270 ° C |
| 7 | عقد 5 دقائق | 270 ° C |
ويستخدم حد أدنى 3 المذيبات تأخير في MSD للحد من ارتداء على فيلأهبل. بعد ذلك، يتم الكشف عن الجماهير ما بين 50 و 550 دالتون مع مجموعة MS الرباعي في C ° 150 و مصدر مللي وضعت في C ° 230، مع درجة حرارة مساعدة الحرارية من 270 ° C.
Representative Results
ويرد مثال لوحة المصورة التي تم اتخاذها خلال سير العمل تلطيخ الدهون في الشكل 1. الضوابط الخاصة للدهون عالية (DAF مستقبلات الأنسولين-2 رني)، والدهون منخفضة (LPD-3 البروتين المطلوبة لتخزين الدهون حبيبات في الأمعاء رني)، والدهون الصغيرة ومنخفضة (fasn-1 سينسيز الأحماض الدهنية رني)، وناقلات الفارغة ( التحكم) تظهر الاختلافات في كثافة مضان وفقا لمستويات الدهون من الحيوانات، والمبالغ التي يحددها الدهون المقابلة GC / MS تحليل (الشكل 2). نلاحظ أن الجين يؤدي إلى inactivations القبض تنمويا والحيوانات الصغيرة سوف تظهر في كثير من الأحيان أن يكون أقل بكثير من الدهون السيطرة الحيوانات الكبار، بغض النظر عن أي اتصال التمثيل الغذائي للدهون (الشكل 3). ويجب أن يتم تحليل الثانوي، بما في ذلك تحليل الدهون والكيمياء الحيوية تلطيخ مع SPE-GCMS من الحيوانات البرية من نوع السيطرة من مرحلة تنموية مماثلة لضمان صحةصغيرة أو القبض تنمويا مشاهدات إيجابية. في حالة fasn 1-رني (الشكل 2)، L2 الحيوانات في اعتقال وأو L3 مرحلة اليرقات، ويكون أقل من الدهون تلطيخ رني تحكم الكبار، ولكن مماثلة في وفرة لL2-L3 الحيوانات المرحلة رني التحكم (وصمة عار في المئة من الدهون من رني تحكم الكبار: 49.9 ± 4.5٪ لfasn 1-رني و 20.2 ± 2.1٪ لL2 التحكم رني، و 64.7 ± 1.3 لمراقبة رني L3). بدلا من ذلك، أشار التحليل الكيميائية الحيوية أقل TAG / PL نسبة من المرحلة L2 مطابقة الحيوانات السيطرة N2 (TAG / PL: 22.5 ± 2.9 لfasn 1-رني و 46.1 ± 3.4 لمرحلة المطابقة رني السيطرة، P ≤ 0.05). وبالتالي يمكن في هذه الحالة أن يقر ذلك عن طريق تحليل البيوكيميائية التي fasn-1 له دور في تخزين الدهون بدلا من الحد فقط لمرحلة محددة في كتلة الدهون.
تحليل متابعة الديدان المصورة تعتمد اعتمادا كبيرا على منصة الحسابية مثل خلية باستخدام التعريفوWormToolbox 30. بالنسبة للأعداد الصغيرة من الصور، قد يتم استخدام تحليل الصور متاحة للجمهور منصة مثل يماغيج، متاحة بحرية من المعاهد الوطنية للصحة. لتحليلنا، استخدمت البرامج النصية فريدة مطلب أول من تحديد البئر، وبعد ذلك لاستبعاد تلك الآبار فارغة أو مع فقاعات، والتمييز بين الحطام صغيرة من الديدان. وكان دليل مراقبة الجودة اللازمة لوضع علامة الصور للاستبعاد وذلك للأسباب المذكورة أعلاه. وجدنا أن كثافة تجريبيا المئين 90 بكسل دودة عبر حسنا، لتطبيع منطقة الدودة عبر حسنا، قدمت متسقة متري من تلطيخ كثافة في جميع مراحل التنمية دودة (الشكل 3). دمج كتلة الدهون الإجمالية فوق منطقة الدودة، على العكس من ذلك، من شأنه أن يحرز الديدان الصغيرة مكافئ مشرق مع الديدان قاتمة كبيرة. لأن أسلوبنا لا دمج إشارة الفلورسنت الكاملة على منطقة دودة، في اتخاذ المئوية كثافة، والتغيرات في حجم الدودة في حد ذاتها لا تفعلر التحيز قياس كثافة. بدلا من ذلك، يتم قياس الفروق في توزيع كثافة بكسل. ومع ذلك، على الرغم من هذا، وينظر الفروق وضوحا في تلطيخ بكسل توزيع كثافة بين الحيوانات من مراحل نمو مختلفة، لذلك من المهم أن دراسة تأثير الجينات على أي رني ضد الحيوانات من مرحلة تنموية قابلة للمقارنة (الشكل 3). ويظهر التباين بين متوسط مكررات في الشكل 4 تشير إلى استنساخ عالية من التلوين بطريقة الدهون. نلاحظ أن قوة هذه الطريقة تعتمد بشكل كبير على الحصول على صور ذات جودة لكل لوحة، في ظل ظروف الإضاءة موحدة، وذلك باستخدام مرات التعرض متطابقة، والحد الأدنى مع فقاعات، والحطام، أو الانتقال من الديدان في آبار أخرى.
تم إجراء SPE على مختلط مسبقا، تنقية معايير لتحديد الدرجة التي يمكن أن الكلمات لا يمكن فصلها عن PLS (الشكل 5A). في هذا التحليل، حققنا ق 100٪وأشار eparation من TAG وPL، وغياب كامل من الأحماض الدهنية المستمدة من 17:00 PL في العينة TAG وغياب المقابلة كاملة من الأحماض الدهنية المستمدة من 13:00 TAG في العينة PL (الشكل 5A). هكذا هو SPE كفاءة عالية في فصل الطبقات الدهنية. هذا التحليل لا يشير إلى أنه سيتم تنقية كافة العلامات ذات أطوال مختلفة سلسلة من مكافئ SPE والكشف عنها بواسطة GCMS بكفاءة مماثلة. فإنه يؤكد فقط أن يتم فصل تماما والدهون TAG PL في المجموع عن بعضها البعض.
يظهر نموذج GC-MS أثر للحيوانات البرية N2 نوع تؤخذ عن طريق استخراج المرحلة الصلبة وإعداد FAME في الشكل 5B. ولكل من TAG PL، يمكن تحديد قمم على أساس الوقت الاحتفاظ الأم وابنتها والأيونات على الطيف الشامل، والمساحة الكلية تحت القمم التي تم تحديدها لتطبيع مجال المعايير الداخلية لكل منها. لتحديد مقدار تطبيع من TAG، ومنطقةفي جميع قمم كروماتوغرام TAG، باستثناء معيار 13:00، أضيفت معا ومقسوما على مساحة تحت الذروة 13:00. وبالمثل، لتحديد المبلغ تطبيع PL إجمالي المساحة تحت كل القمم، باستثناء معيار 17:00، أضيفت معا ومقسوما على مساحة تحت الذروة 17:00. ثم يتم استخدام القيم تطبيع للTAG وعينات PL لحساب النهائي TAG / PL نسبة للعينة:
تجدر الإشارة إلى أن البيانات من SPE-GCMS تسمح بإجراء تحليل أكثر تعقيدا بكثير من الأحماض الدهنية الموجودة في كل جزء من الدهون حسابية بسيطة من مجموع نسبة TAG PL. على سبيل المثال، يمكن دمج المحقق ذروة واحدة الموافق الحمض الدهني واحد وفرة مقارنة تطبيع عبر عينات (مثل جomparing في N2 البرية من نوع DAF-2 مقابل رني منطقة متكاملة من ذروة الذروة 18:00 مقسوما على مستوى 13:00، تطبيع الشامل لPL الإجمالية مقسومة 17:00 PL منطقة ذروة قياسية):
يتعين على المحقق اختيار، سيكون من الممكن أيضا لتحديد النسبة المئوية للحمض الدهني أي المعطى في كسور أو PL TAG كنسبة مئوية من المبلغ الإجمالي من الأحماض الدهنية quantitated (18:00 باعتبارها المثال في جزء TAG الديدان في N2 ):
الشكل 1. سير العمل النموذجي للتجربة بشكل عام. يوم 1، وختمها لوحات المجمدة رني على مكتبة أمبير / تيت لوحات أجار والمحتضنة في LB C. ° 37 يوم 2، وتستخدم الأمبير / تيت لوحات على الثقافات البذور السائل من الحيوانات المستنسخة رني في كتل الآبار العميقة. اليوم 3، تتركز البكتيريا عن طريق الطرد المركزي وتحويلها إلى لوحات رني 96-أيضا. اليوم 4، L1 فقس البيض C. وأضاف ايليجانس لوحات رني في السائل ويترك ليجف. اليوم 7، يتم جمع الحيوانات في السائل، وصبغت بألوان حمراء النيل في الأيزوبروبانول 40٪، التي شنت على الشرائح تفلون 96-حسنا، وتصويرها باستخدام المجهر عالية الإنتاجية.
الشكل 2. مثبت القائم على النيل بقع حمراء كبيرة
الشكل 3. كتلة الدهون التي يحددها تلطيخ تثبيت أحمر النيل في مراحل اليرقات مختلفة. الحيوانات كانت تزرع على OP50 البكتيريا والتي تجمع على L1، L2، L3، L4 ومراحل النمو حامل الكبار. تم التقاط الصور بعد تثبيت تلطيخ وتحليلها باستخدام برنامج نصي مطلب مخصصة لتحديد المئين ال 90 سو كثافة بكسل فوق منطقة الدودة التي تم تحديدها. لاحظ أن مستويات الدهون من الحيوانات ويزيد إلى حد كبير من هذا الحيوان يتطور إلى L2 L4 المرحلة، ومن ثم انخفاضا طفيفا حيث يبدأ الحيوان لتحويل السعرات الحرارية نحو انتشار للسلالة الجرثومية في المرحلة الكبار. البيانات المعروضة هي متوسط ± SEM ليعيد 6-8 (**، P ≤ 0.0001 نسبة إلى حامل الكبار، والتي تحددها المفردة، واثنين من الذيل اختبار-T).
الشكل 4. استنساخ عالية عبر البيولوجية مستقلة مكررات. أظهرت هو مؤامرة مبعثر من شدة مضان أحمر النيل عبر البيولوجية مكررات (ن = 6-8). لكل تكرار، وتطبيع جميع القيم إلى كثافة متوسط الضوابط ناقلات الفارغة. البيانات المعروضة هي متوسط ± SEM (**، P ≤ 0.0001 النسبي للسيطرة، والتي تحددها المفردة، واثنين من الذيل اختبار افتراض-Tالفرق متساوية).
الشكل 5. GC-MS chromatograms من SPE فصل المعايير والبرية وفرة TAG نوع PL. (A) وترد GC-MS آثار الانفصال SPE من TAG والمعايير PL. لاحظ غياب كامل من الأحماض الدهنية في تتبع 13:00 PL وعدم وجود المقابل للحامض الدهني 17:00 في تتبع TAG، مشيرا الى الفصل التام بين TAG (tritridecanoin) من PL (1،2-diheptadecanoyl-SN-glycero -3-الفوسفات-(1'-RAC-الجلسرين)). (B) A الطيف الكامل للممثل TAG وPL من عينة من نوع البرية N2 الحيوانات التي تتغذى رني مكافحة ناقلات (HT115 البكتيريا مع L4440 رني ناقلات الفارغة). تم حقن عينة واحدة من ميكروليتر إلى GCMS 6890/5973N اجيلنت وفقا للبروتوكول، وحددت قمم الفردية عن طريق شبكة شعيريةالوقت ntion وطيف الكتلة منها. الاختصارات: حمض سيكلو الحلقي، الدسمة، ISO: ISO-الميثيل حمض سلسلة متفرعة الدهنية؛ GLA، وحمض غاما اللينولينيك. ALA، حمض اللينولينيك ألفا؛ DGLA، dihomo حمض اللينولينيك غاما؛ EPA، وحمض الدهني اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
Discussion
بروتوكول يسمح لتقديم السريع، وفحص نطاق واسع من مستويات الدهون في C. ايليجانس، والتي يمكن تكييفها بسهولة إلى شاشات إنتاجية عالية. على عكس الأساليب المستخدمة سابقا، والتي تنطوي على خطوة تثبيت مطولة في بارافورمالدهيد تليها دورات تجميد ذوبان الجليد العديد من 8،10، لدينا بروتوكول يتطلب بسيطة دقيقة 3-التثبيت في الأيزوبروبانول. وقد وجدنا أن من تلطيخ C. ايليجانس في الأيزوبروبانول 40٪، فإنها تصبح قابلة للاختراق بحرية إلى الأحمر النيل، دون استخدام خطوات إضافية تجميد ذوبان الجليد أو التثبيت. أيضا، والنيل الأحمر fluoresces انتقائي في حجرات مسعور في الطيف الأخضر 18،19،31، لا destaining ضروري. في المجموع، يمكن أن تؤخذ من الحيوانات لوحات للحيوانات رني صورة الملون وعلى استعداد لفي يزيد قليلا عن 2.5 ساعة. لا يمكن أن يؤديها غير مكلفة نسبيا هذا الأسلوب مع واستنساخ عالية. الأسلوب لا يعتمد على قدرة C. ايليجانس لامتصاص أو التركيزالصبغة، وبالتالي ليس لديها نفس القيود القائمة على استخدام أساليب التغذية الحيوية الأصباغ. نظرا للتكرار ودقة القياسات، وطريقة مناسبة لفحص أعداد كبيرة من الجينات inactivations بواسطة رني. إذا تم تحديد الكميات المطلوبة من مستويات الدهون استنادا إلى تلطيخ مثبت الأحمر النيل، من المستحسن استخدام مكررات من 4-6 البيولوجية مع الضوابط المناسبة واختبار الإحصائية المطبقة.
فمن المرجح أن الجين inactivations مما يؤدي إلى العديد من الحيوانات الصغيرة (بسبب استنساخ رني تسبب تأخر التنمية أو ألقي القبض عليهم) وتخرج من شاشة للمنظمين الدهون، بغض النظر عن أي اتصال التمثيل الغذائي للدهون. في حين أن برنامج تحليل الصور المستخدمة أننا حسابات للديدان من مختلف الأحجام من تطبيع كثافة مضان إلى منطقة دودة، قد الباحثين الفردية تحتاج أيضا إلى النظر في المقارنة بين مستويات الدهون تلطيخ من الحيوانات الصغيرة للحيوانات البرية من نوع المرحلة التنموية مماثلة. في حالة الحيوانات الصغيرة أو القبض تنمويا مع كتلة واضحة منخفض الدهون، فإننا نقترح أن لا طريقة واحدة هي كافية لإثبات تغيير استقلاب الشحوم. يمكن أن يطلب عدة تجارب المتابعة، بما في ذلك SPE-GCMS، للتأكد من وظيفة الدهون التنظيم من هذه الجينات. لمنظم التمثيل الغذائي المعروفة fasn-1، SPE-GCMS تحليل مقارنة المتطابقة تنمويا الحيوانات N2 تحكم L2 كان ضروريا لتأكيد واضح النمط الظاهري قليل الدسم وجدت بالمقارنة مع الحيوانات مراقبة الكبار. بينما الدهون النيل تلطيخ حمراء أشارت انخفاض مستويات الدهون النسبي للسيطرة الكبار رني، بالمقارنة مع مرحلة المطابقة الحيوانات L2 رني السيطرة، ولم يحدث فارق واضح. وفقا لذلك، واستخدام أسلوب الثاني، أي الكمي البيوكيميائية لنسبة TAG / PL كان من الضروري تحديد ذلك fasn-1 هو المنظم الحقيقي لكتلة الدهون، كما fasn-1 رني تكون مميزة كيميائيا من مرحلة المطابقة الحيوانات L2 رني السيطرة.
معشوقة = "jove_content"> وفي حين نقدم التصوير وتجهيز منصة عالية الإنتاجية، ويمكن بسهولة المجهر تستقيم التقليدية يمكن استخدامها لالتقاط الصور من الديدان التي شنت على منصات الاغاروز 20 أو على الحجم تفلون التقليدية المطبوعة 8 حتي 12 الشرائح المجهر بشكل جيد . والقيد الوحيد هو أنه مع مضان أخضر من قطرات الدهون ملطخة photobleaches الأحمر النيل بسرعة ومنهجية وظروف التعرض موحدة تحتاج إلى استخدامها لضمان إمكانية المقارنة بين الصور. نجد أن المجهر مؤتمتة بالكامل مع شروط الحصول على الصور موحد يعمل على نحو أفضل في هذا الصدد.
واحدة من نقاط القوة العظيمة من هذا البروتوكول هو أن يتم جمع الصور بعد يمكن حفظها لمستقبل إعادة التحليل. ويمكن استخدام نفس الصور لتحديد حجم الجسم، بالإضافة إلى محتوى الدهون. علاوة على ذلك، برامج الحاسوبية أصبحت أكثر تقدما، وهناك احتمال واحد للتحليل الدودة، وتوليد نتائج ذات دلالة إحصائيةمن بئر واحد. وبالتالي لدينا طريقة التي تستخدم عالية الإنتاجية المجهري لديها بعض المزايا على الشاشة المنهجيات التي تستخدم نشرت Biosort Copas لتحديد إشارات الفلورسنت 32،33. ومع ذلك، فإن المنهجيات مجانية بالتأكيد.
دقيقة، الكيمياء الحيوية من تقرير المحتوى الدهني بواسطة SPE وGC / MS يؤكد تلطيخ حمراء النيل من مخازن الدهون الرئيسية في C. ايليجانس. على الرغم من أن الكميات المطلقة من تحقيق مثبت تلطيخ الأحمر والنيل البيوكيميائية تقرير الدهون غالبا ما لا تتطابق تماما، وكلاهما الأساليب إنتاج استنساخه للغاية، والنتائج ذات دلالة إحصائية التي توافق نوعيا. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تكون مصممة هذه الطريقة لتلبية الاحتياجات المحددة من الباحثين الفرد الذي قد يتطلب مزيدا من التحليل لفئات منفصلة من الشحميات السفنغولية السكرية، الدهون الفوسفاتية، أو الدهون الثلاثية الموجودة في عينات مختلفة. تجدر الإشارة إلى أن مجموعات أخرى استخدمت تقنية أخرى ثان SPE لفصل الطبقات الدهنية قبل GC / MS 22. طبقة رقيقة اللوني (TLC) وارتفاع ضغط اللوني السائل (HPLC) والمزايا على SPE في أنها قد تكون قادرة على تحسين نسبة الدهون في منفصلة متميزة محايدة (على سبيل المثال TAG، diacylglycerols، والأحماض الدهنية الحرة، واسترات الكولسترول) من الدهون القطبية (فسفاتيديل، فسفاتيديل إيثانولامين) والدهون الإسفنجية جليكول. نختار SPE لأنه يتطلب حدا أدنى من بدء المواد (2،500-5،000 الديدان)، فإنه يؤكد على مخازن كبيرة للطاقة على المدى الطويل، والعلامات، والتي تشكل أكثر من جزء الدهون محايدة 4، وسريع، لا تتطلب معدات متخصصة أو لوحات. وينبغي التأكيد على أن تستند إلى خليط القياسية، SPE يفصل تماما من الكلمات الثابتة والمتنقلة، واستنساخه للغاية ويمكن الاعتماد عليها (انظر الشكل 5A). بينما الكميات وتحليل حمض الدهنية استرات الميثيل يتطلب GC / MS، هذا الجهاز يتوفر عادة، وإذا لم يكن محليا، قد عيناتأن تتولد على النحو الوارد أعلاه وتخزينها في -80 درجة مئوية تحت النيتروجين حتى يتم ترتيب تحليلها من قبل متعاون أو خدمات تجارية GC / MS.
الإخراج GCMS يحتوي على بيانات عالية الدقة على كل الأحماض الدهنية داخل كل نوع الدهون. هذا يسمح بتحديد الاختلافات بين العينات مقارنة مفصلة. وكمثال على ذلك، يمكن للمحقق تحديد ما إذا تم تغيير مستويات معينة من الأحماض الدهنية في وفرة أكبر بكثير من غيرها في DAF-2، LPD-3-1 أو fasn رني مقابل مكافحة النواقل. وهذا يمكن أن توفر أداة قوية جدا لذلك معلومات مفصلة عن الأنواع التي يتم تغيير في وفرة الدهون مع أي تلاعب التجريبية.
لتحليلنا، ونحن في معظم الأحيان إلى تطبيع الشامل TAG الشامل PL. بينما يمكن أيضا البروتين DNA أو استخدامها لتطبيع الشامل الدهون بعد أن تقرر من قسامة من بيليه دودة sonicated، نجد أن هذه الأساليب تخضع إلى intالإنسان الخطأ roduced خلال جميع الخطوات pipetting والانتعاش في كل عينة من الاستخراج. ولهذا السبب اخترنا لاستخدام بدلا PL الشامل، وعامل تطبيع لدينا. معايير غير طبيعية قدم في بداية البروتوكول (tritridecanoin لTAG، 1،2-diheptadecanoyl-SN-glycero-3-الفوسفات-(1'-RAC-الجلسرين) لPL) وتنفذ من خلال جميع الخطوات لاستخراج الطور الصلب و FAME إعداد، وضمان الانتعاش الكمي وممثل لكل من والكسور TAG PL. لا يمكن ضمان نفس بذل المحققون إذا استخدام البروتين أو الحمض النووي لتطبيع الشامل TAG. نعتقد PL أن تكون أقوى مقياس يمكن من خلالها مقارنة مستويات TAG عبر عينات، كما هو موضح في وقت سابق ان وبدقة فقط تغيير PL من قبل نفس الحوافز إحداث تحولات كبيرة في مستويات الشامل TAG والتجويع الموسعة على سبيل المثال أو زيادة ممارسة 34 - 36. ويعتقد PL أن تلعب دورا الهيكلية، وضمان سيولة الغشاء الخلوي والأسواق العالمية ضغطهاgrity والأدوار يشير بدلا من تخزين الطاقة 37-39. في أيدينا، فإن نسبة TAG / PL الأكثر تطابقا يطابق ما يتم الحصول على تلطيخ من الدهون مثبت القائم مع أحمر النيل، وتتفق مع تلك التي وجدت من قبل الجماعات الأخرى 21. ويستخدم استراتيجية بديلة من قبل المختبر واتس، حيث يتم حساب النسبة المئوية للدهن TAG مقابل الدهون الكلية 9،22،29.
استخدام أنواع غير أصلية من وTAG القياسية PL يضمن أنه سيتم إدراج أي الأحماض الدهنية الأصلية في حساب التطبيع. ويستند بحتة اختيار طول السلسلة على ضرورة هذه المعايير لعدم التدخل في أطياف الشامل من الأحماض الدهنية الأصلية. لقد وجدنا أن الأحماض الدهنية من 13:00 17:00 وخدمة أفضل لهذا الغرض. فمن الممكن، وبالنظر إلى خصائص كيميائية مختلفة من الأحماض الدهنية سلسلة أقصر، أن لدينا معايير الأحماض الدهنية غير طبيعية قد لا تكون ممثلة لاسترداد جميع الأحماض الدهنية سلسلة ذات طول أو سلاسل مع فرقمؤشرات التشبع erent. وبالتالي فمن الممكن أنه خلال SPE أو GCMS أننا قد نرى الاختلافات في كفاءة تنقية أو الكشف الدهون من بين أطوال السلسلة مختلفة. بناء على هذا، والتأين مختلفة من الأحماض الدهنية المختلفة في GCMS، فإنه ليس من الممكن لجعل عبارة عن وفرة مطلقة من الحمض الدهني أي معين. لذلك، ما قارنا بين عينات فقط ضمن الكميات المتوفرة تجربة واحدة من الحمض الدهني أي معين. يمكن إذا كان أحد يريد أن quantitate على الاطلاق الأحماض الدهنية، واحدة بطريقة يمكن تحقيق هذا من شأنه أن يكون لتشغيل عينة أعدت على النحو الوارد أعلاه ارتفعت مع كمية معروفة من إصدار ثابت المسمى isotopically C 13 من ذلك أو الأحماض الدهنية مماثلة، بحيث يمكن أن يكون تميز على أساس كتلة أيون الأصل في MSD، على سبيل المثال. نظرا لأننا تقارن سوى كميات النسبية للفئات الدهون أو أي حمض الدهنية نظرا، لدينا TAG 13:00 17:00 والمعايير PL تخدم هذا الغرض على نحو كاف، على الأقل من حيث التكلفة، إلىأؤكد التأهيل وممثل عن كل فئة الدهون.
حتى هذه النقطة، كان هناك عدم وجود توافق في الآراء حول تفسير بعض النتائج التي حصل عليها مختلف المنهجيات، وإلى أي المنهجيات السائدة ينبغي أن يكون. وينبغي أن يلاحظ عموما أن يعتبر مثاليا لا أسلوب واحد في عزلة لدراسة التمثيل الغذائي للدهون في C. ايليجانس. ومع ذلك، باستخدام الفحص متعددة وطرائق التحقق من الصحة، يمكن للمرء أن تحقيق الثقة في البيانات التي تم الحصول عليها على الجينات التنظيمية الدهون. وبالتالي، فإننا نعتزم لبروتوكول لدينا لتكون بمثابة مؤشر للعمل في المستقبل في مجال C. ايليجانس البحث الدهون.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم مصالح متضاربة الكشف.
Acknowledgments
نود أن نشكر Kacergis مايكل للمساعدة التقنية ووو Lianfeng للمناقشات وقراءة المخطوط. وأيد هذا العمل من قبل مهنة جائزة التنمية من المعاهد الوطنية للصحة / NIDDK (K08DK087941 لAAS)، والمعاهد الوطنية للصحة / NIDDK التدريب منحة (5T32DK007028 لECP)، واليسون الباحث الطبي الجديد في مؤسسة جائزة الشيخوخة (لAAS)، وتشارلز H . هود صحة الطفل مؤسسة جائزة بحوث (لAAS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-pin replicator | Nunc | 250520 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| LB Agar | US Biologicals | L1500 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Mechanical Pipettors | Biohit M Line | M10, M100, M300 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Electronic Pipettor | Biohit E Line | E1200 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1 M KH2PO4 | Sigma | P0662 | pH 6.0 Sterilized by Autoclaving | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1 M MgSO4 | Sigma | M2643 | Sterilized by Autoclaving | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1 M CaCl2 | Sigma | C2661 | Sterilized by Autoclaving | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| NaCl | Sigma | S5886 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 5 mg/ml Cholesterol | Sigma | C8667 | In 100% Ethanol | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 200 mg/ml Carbenicillin | US Biologicals | C1100 | Filter Sterilized 0.2 μ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1 M IPTG | US Biologicals | I8500 | Filter Sterilized 0.2 μ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 100 mg/ml Ampicillin | Filter Sterilized 0.2 μ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 5 mg/ml Tetracycline | In 100% Ethanol | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bacto Agar | BD | 214040 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-well TC Plates | BD-Falcon | 353072 | For 96-well RNAi | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Rectangular A/T Plates | Thermo Scientific | 242811 | For stamping RNAi | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| LB Media | US Biologicals | L1530 | Prepared as per manufacturer instructions | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-well Deep Well Assay Blocks | Corning | Costar 3960 | Rectangular V-bottom assay block | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-well Shallow Well Assay Block | Corning | Costar 3956 | Round V-bottom assay block | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sterile Sealing Film | VWR | 89134-432 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Aluminum Sealing Film | Corning | Costar 6570 | Thermowell Sealing tape for 96-well plates | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| M9 Buffer | See Hope et al.20 | See recipe below | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Triton X-100 | Bio-Rad | 161-0407 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Nile red | Invitrogen | N-1142 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Isopropanol | Fisher | BP2632-4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-pin aspirator | VP Scientific | VP177A-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-well Teflon Masked Microscope Slides | Thermo Scientific | Custom | Can also order Trevigen 96-well Cometslide | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-well Gold-Seal Coverslides | Thermo Scientific | Custom | Can also use second 96-well Cometslide | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Deep-well PCR plate | VWR | 89049-178 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Non-sterile adhesive film | VWR | 60941-070 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| High-Throughput Microscope | Leica | DM6000 fully automated with Prior 96-well stage | With Chroma 49002 GFP filter set and 2x objective | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bath Sonicator | Diagenode | Bioruptor XL | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Chloroform | Sigma | 366927-4L | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Methanol | Fisher | Optima F456-4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Phospholipid Standard | Avanti Polar Lipids | 830456P | 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Triglyceride Standard | NuChek Prep | T-135 | tritridecanoin | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Wiretrol 50 μl Pipet | Fisher | 21-176-3A | Drummond Scientfic | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Acetone | Sigma | 320110-4L | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sulfuric Acid | Fisher | A300-500 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Hexane | Fisher | Optima H306-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| SPE Silica Column | Thermo Scientific | 60108-317 | Hypersep SI, 100 mg resin bed | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Solid Phase Chromatography Manifold | Sigma | 57265 | Supelco Visiprep 24-DL | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Borosilicate Pipets | Fisher | 13-678-27F | 10 ml size | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Borosilicate Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-8B | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Borosilicate Culture Tubes | Fisher | 14-961-27 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Threaded Borosilicate Tubes | VWR | 14235-460 | 8 ml capacity | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Phenolic Caps for Culture Tubes | Fisher | 14-823-211 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| GC/MS Autosampler Vials | Agilent | 5188-6592 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Caps for Autosampler Vials | Agilent | 5185-5861 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| GC/MS | Agilent | 6890 GC / 5973 MSD | Outfitted with a Supelcowax-10 column | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Nematode Growth Media (NGM): for 25 96-well RNAi plates, prepare 1 L of NGM:
Rectangular Ampicillin/Tetracycline LB Agar Plates (A/T): for 20 A/T plates, prepare 1 L of media:
LB bacterial growth media: for 4 L, sufficient for growing and resuspending 25 96-well blocks Mix 62 g LB powder (US Biologicals), 4 L distilled water, and 4.8 ml 2 M NaOH. Autoclave in 1 L or 0.5 L aliquots, liquid cycle, 40 min. Can be stored up to 1 year in airtight bottles at room temperature. Discard if cloudy. 100 mg/ml Ampicillin Mix 5 g ampicillin powder and deionized water to a total volume of 50 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use. 5 mg/ml Tetracycline Add 1.25 g tetracycline powder to 250 ml 100% ethanol. Mix well until fully dissolved and store at -20 °C in a light-tight container. 200 mg/ml Carbenicillin Mix 10 g carbenicillin powder and deionized water to a total volume of 50 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use. 5 mg/ml Cholesterol Add 1.25 g cholesterol to 250 ml 100% ethanol. Mix well and store at 4 °C for up to 6 months. 1 M MgSO4 Dissolve 120.37 g MgSO4 in 800 ml deionized water. Bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature. 1 M CaCl2 Dissolve 110.98 g CaCl2 in 800 ml deionized water. Bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature. 1 M KH2PO4, pH 6.0 Dissolve 136.09 g KH2PO4 in 800 ml deionized water. pH to 6.0 and bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature. M9 Buffer: for 1 L—we routinely make 8-10 L batches Dissolve 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4 in 900 ml. Bring final volume to 1 L. Aliquot in 100-500 ml bottles and autoclave 40 min on liquid cycle and store at room temperature. 10 N NaOH Dissolve 400 g NaOH in 800 ml deionized water, allow to cool and bring to a final volume of 1 L. Store in 50 ml tubes at room temperature. 1 M IPTG Add 23.81 g IPTG to deionized water and bring total volume to 100 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use. Egg Preparation Bleach/NaOH Solution: 20 ml sufficient for one egg preparation Add 4 ml bleach, 1 ml 10 N NaOH, 5 ml H2O, and 10 ml M9 buffer to a 50 ml polypropylene conical tube. Make immediately before use. Nile red stock solution Add 50 ml 100% Acetone to 25 mg Nile red powder. Mix well and store at room temperature in light-tight parafilmed container. Can be stored for months in this manner. Nile red staining solution: for 500 ml, sufficient for staining 30 x 96-well plates Add 3 ml Nile red stock solution to 500 ml 40% v/v isopropanol. Store at room temperature in foil-wrapped glass bottle. Prepare immediately before use. Phospholipid Standard Weigh 7.6 mg phospholipid standard, 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol), in a glass beaker. Dissolve in 20 ml 2:1 chloroform:methanol (25 nanomoles per 50 μl). Keep covered with aluminum foil until use. Standard can also be kept at -80 °C in an airtight glass vial with phenolic cap for 1 year. Triglyceride Standard Weigh 6.8 mg triglyceride standard, tritridecanoin, into a glass beaker. Dissolve in 30 ml 2:1 chloroform:methanol (16.7 nanomoles per 50 μl). Keep covered with aluminum foil until use. Standard can also be kept at -80 °C in an airtight glass vial with phenolic cap for 1 year. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Zhang, S. O., Trimble, R., Guo, F., Mak, H. Y. Lipid droplets as ubiquitous fat storage organelles in C. elegans. BMC Cell. 11, 96 (2010).
- Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nature Reviews. Drug Discovery. 5, 387-398 (2006).
- Leung, M. C., et al. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Sciences: An Official. Journal of the Society of Toxicology. 106, 5-28 (2008).
- Ashrafi, K., et al. Genome-wide RNAi analysis of Caenorhabditis elegans fat regulatory genes. Nature. 421, 268-272 (2003).
- Arda, H. E., et al. Functional modularity of nuclear hormone receptors in a Caenorhabditis elegans metabolic gene regulatory network. Mol. Syst. Biol. 6, 367 (2010).
- Mak, H. Y., Nelson, L. S., Basson, M., Johnson, C. D., Ruvkun, G. Polygenic control of Caenorhabditis elegans fat storage. Nature Genetics. 38, 363-368 (2006).
- Wang, M. C., O'Rourke, E. J., Ruvkun, G. Fat metabolism links germline stem cells and longevity in C. elegans. Science. 322, 957-960 (2008).
- O'Rourke, E. J., Soukas, A. A., Carr, C. E., Ruvkun, G. C. elegans major fats are stored in vesicles distinct from lysosome-related organelles. Cell Metab. 10, 430-435 (2009).
- Brooks, K. K., Liang, B., Watts, J. L. The influence of bacterial diet on fat storage in C. elegans. PLoS ONE. 4, e7545 (2009).
- Yen, K., et al. A comparative study of fat storage quantitation in nematode Caenorhabditis elegans using label and label-free methods. PLoS ONE. 5, (2010).
- Rabbitts, B. M., et al. glo-3, a novel Caenorhabditis elegans gene, is required for lysosome-related organelle biogenesis. Genetics. 180, 857-871 (2008).
- Kimura, K. D., Tissenbaum, H. A., Liu, Y., Ruvkun, G. daf-2, an insulin receptor-like gene that regulates longevity and diapause in Caenorhabditis elegans. Science. 277, 942-946 (1997).
- Soukas, A. A., Kane, E. A., Carr, C. E., Melo, J. A., Ruvkun, G. Rictor/TORC2 regulates fat metabolism, feeding, growth, and life span in Caenorhabditis elegans. Genes Dev. 23, 496-511 (2009).
- McKay, R. M., McKay, J. P., Avery, L., Graff, J. M. C elegans: a model for exploring the genetics of fat storage. Dev. Cell. 4, 131-142 (2003).
- Klapper, M., et al. Fluorescence-based fixative and vital staining of lipid droplets in Caenorhabditis elegans reveal fat stores using microscopy and flow cytometry approaches. J. Lipid Res. 52, 1281-1293 (2011).
- Hellerer, T., et al. Monitoring of lipid storage in Caenorhabditis elegans using coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 14658-14663 (2007).
- Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nat. Methods. 8, 135-138 (2011).
- Fowler, S. D., Greenspan, P. Application of Nile red, a fluorescent hydrophobic probe, for the detection of neutral lipid deposits in tissue sections: comparison with oil red. 33, 833-836 (1985).
- Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J. Cell Biol. 100, 965-973 (1985).
- Hope, I. L. C. elegans: A Practical Approach. , Oxford University Press. New York. 304 (1999).
- Perez, C. L., Van Gilst, M. R. A 13C isotope labeling strategy reveals the influence of insulin signaling on lipogenesis in C. elegans. Cell Metab. 8, 266-274 (2008).
- Watts, J. L., Browse, J. Dietary manipulation implicates lipid signaling in the regulation of germ cell maintenance in C. elegans. Developmental Biology. 292, 381-392 (2006).
- Wang, T. J., et al. Metabolite profiles and the risk of developing diabetes. Nature medicine. 17, 448-453 (2011).
- Rhee, E. P., et al. Lipid profiling identifies a triacylglycerol signature of insulin resistance and improves diabetes prediction in humans. The Journal of Clinical Investigation. 121, 1402-1411 (2011).
- Lewis, G. D., et al. Metabolic signatures of exercise in human plasma. Science translational medicine. 2, 33-37 (2010).
- Rhee, E. P., et al. Metabolite profiling identifies markers of uremia. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 21, 1041-1051 (2010).
- Gerdt, S., Lochnit, G., Dennis, R. D., Geyer, R. Isolation and structural analysis of three neutral glycosphingolipids from a mixed population of Caenorhabditis elegans (Nematoda:Rhabditida). Glycobiology. 7, 265-275 (1997).
- Christie, W. W. Advances in Lipid Methodology - Two. , Oily Press. 69-111 (1993).
- Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).
- Wahlby, C., et al. An image analysis toolbox for high-throughput C. elegans assays. Nat. Methods. , (2012).
- Fowler, S. D., Brown, W. J., Warfel, J., Greenspan, P. Use of nile red for the rapid in situ quantitation of lipids on thin-layer chromatograms. J. Lipid Res. 28, 1225-1232 (1987).
- Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans. J. Vis. Exp. (60), e3448 (2012).
- Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains. J. Vis. Exp. (51), e2745 (2011).
- Comizio, R., et al. Total body lipid and triglyceride response to energy deficit: relevance to body composition models. The American journal of physiology. 274, E860-E866 (1998).
- Lee, R. F., Paffenhofer, G. A., Nevenzel, J. C., Benson, A. A. The metabolism of wax ters and other lipids by the marine copepod, Calanus helgolandicus. J. Lipid Res. 11, 237-240 (1970).
- Lee, S. S., et al. Requirement of PPARalpha in maintaining phospholipid and triacylglycerol homeostasis during energy deprivation. J. Lipid Res. 45, 2025-2037 (2004).
- Singer, S. J. A fluid lipid-globular protein mosaic model of membrane structure. Annals of the New York Academy of Sciences. 195, 16-23 (1972).
- Singer, S. J., Nicolson, G. L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 175, 720-731 (1972).
- Turkish, A. R., Sturley, S. L. The genetics of neutral lipid biosynthesis: an evolutionary perspective. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297, E19-E27 (2009).
