Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Fat Kütle Biyokimyasal ve Yüksek Verimli Mikroskobik Değerlendirme doi: 10.3791/50180 Published: March 30, 2013

Summary

Biz eğitim için sağlam biyokimyasal ve mikroskobik yöntemler sunmak

Abstract

Nematod C. elegans insan obezite ve ilişkili patolojiler ile ilgilidir olarak yağ metabolizmasını düzenleyen korunmuş genetik yolların çalışması için önemli bir model olarak ortaya çıkmıştır. C. görselleştirme için geliştirilen Birkaç önceki metodolojileri elegans trigliseritten zengin yağ depolar lipid damlacıkları dışındaki hücresel bölümlerin vurgulayarak, hatalı olduğu kanıtlanmıştır. Diğer yöntemler, özel ekipman gerektiren zaman alıcı, ya da tutarsız sonuçlar. Biz C. nötral lipid damlacıklarının doğru ve hızlı tespiti için hızlı, tekrarlanabilir, fiksatif tabanlı Nil kırmızısı boyama yöntemi tanıtmak elegans. % 40 izopropanol içinde bir kısa devre tespit adımı sonra hayvanlar boyama için kullanılır Nil kırmızı, tamamen geçirgen hayvanlar yapar. Bu lipofilik boya spektral özellikleri o güçlü ve seçici sarı-yeşil spektrum floresan izin yalnızca bir lipit açısından zengin bir ortamda, ancak daha fazlapolar ortamlar. Böylece, lipid damlacıkları izopropanol sadece kısa bir Nil kırmızısı boyama aşamasından sonra basit GFP görüntüleme yeteneği ile donatılmış bir floresan mikroskop üzerinde görüntülenebilir. Hız, ekonomiklik ve bu protokolün tekrarlanabilirliği ideal yüksek kapasiteli ekranlar için uygun kılmaktadır. Biz de trigliserid ve gaz kromatografisi kütle spektrometresi kullanarak-fosfolipidlerin biyokimyasal tayini için eşleştirilmiş bir yöntem gösterilmektedir. Bu daha sıkı protokol Nil kırmızı mikroskobik lipit tayini elde sonuçlarının doğrulanması olarak kullanılmalıdır. Biz bu tekniklerin C. alanında yeni standartlar olacağı tahmin elegans metabolik araştırma.

Introduction

Insan ve nematod Caenorhabditis elegans arasındaki metabolik yolların Koruma obezite çalışma için güçlü bir model organizma yapar. Iken C. elegans memeliler gibi yağ depolama adanmış adipositler zorunda değilsiniz, onlar lipid damlacıkları 1 mağaza trigliserid yapmak ve yağ depolama ve enerji kullanımı 2,3 aynı regülatörleri birçok sahiptirler. C. yağ seviyeleri test için elegans, birkaç yöntem kolaylık ve başarı değişen seviyeleri ile öne sürülmüştür. Floresan, hayati boyalar 4-7 kez yaygın kullanımı son zamanlarda sorgulanmaya ve bu reaktifler C. ana yağ depo ayrı bir bölme boyama için ispat edildi elegans 1,8-11. Sudan siyah ve Oil-red-O gibi Sabitleme tabanlı olmayan floresan boyalar, solucan 12-14 lipid damlacıkları vurgulayarak başarılı, floresan gibi ölçümü için geniş bir dinamik aralık olarak yok ikenyüzde boyalar 8,13,15. Ayrıca, floresan ve floresan olmayan hem boyalar için fiksasyon güncel yöntem zaman alıcı ve çok donma-çözülme adımlar ve / veya toksik kimyasalların 1,9,10 ve kullanımını içerir. Belirli bir BODIPY-etiketli lipid analoğu kullanımı kısa süreli etiketlendirme 15 ile canlı solucan ile beslenen zaman lipid damlacıkları gelmek için rapor edilmiştir. Ancak bu boya alımı üzerine dayanır ve bu nedenle C. taraflıdır BODIPY yağ asidi analoglannın elegans kullanım ve metabolizması. Lipid-boyama boyalar An kurulan alternatif yağ depolar 10,16 görselleştirmek için lipid moleküllerin karakteristik titreşim özellikleri yararlanmak etiketi içermeyen, tutarlı anti-Stokes Raman saçılması (CARS) veya uyarılmış Raman saçılması (SRS) mikroskopi, bir 17. Bununla birlikte, pahalı özel ekipman bu yöntem için gerekli olan, ve üretilen en azından düşüktür.

Hızlı, ölçeklenebilir analy için bir ihtiyacını karşılamak içinC. nötral lipid depolarının sis elegans metabolik araştırmalar, biz, fiksatif tabanlı Nil kırmızı lipid boyanma derece tekrarlanabilir bir yöntemdir bir roman tanıtmak. Lipofilik boya Nil kırmızı spektral ve fizikokimyasal özellikleri sadece zaman lipit açısından zengin bir ortamda, ancak daha polar ortamlarda 18 yeşil emisyon spektrumundaki floresan sağlayan, onun eksitasyon-emisyon zirve sarı-altın-spektral kayması neden , 19. Böylece lipid damlacıkları floresan mikroskobu için ayarlanmış bir yeşil floresan protein (GFP) filtre kullanımı ile basit boyama sonra tespit edilebilir. Bu tekniğin kolaylığı ve uygun fiyatta ideal yüksek kapasiteli ekranlar için uygun kılmaktadır. Biz de trigliserid ve katı faz ekstraksiyonu ve gaz kromatografisi-kütle spektrometresi kullanılarak fosfolipidlerin biyokimyasal tayini için eşleştirilmiş, titiz yöntem gösterilmektedir. Biyokimyasal lipit ölçümü C. Nil kırmızı tabanlı mikroskobik tayini ile ilişkilidir elegans fat kütle ve mikroskopik lipid kararlılıkla yapılan bulguların teyidi olarak kullanılmalıdır.

Protocol

1. Dikdörtgen Amp / Tet (A / T) LB Agar Plakalar ve NGM IPTG RNAi Plakalarının Hazırlanması

A / T plakalar 4 ° C'de kullanmak için 1-4 hafta öncesinde hazırlanan ve karanlıkta saklanmalıdır

  1. Ortam sıcaklığında 1 litre için 1 L deiyonize su, 32 g LB ağar, 1.5 ml 2 M NaOH ve 2 g Bacto Agar ekleyin. Sıvı döngüsü 40 dakika otoklav. 60 ° C'a soğutmadan sonra, 3 ml tetrasiklin ve 0.5 ml ampisilin ilave edin. Her plaka içine medya 45 ml dökün.

Önceden en fazla 2 hafta RNAi plakaları 96-3 gün hazırlayın.

  1. 1 L deiyonize su, 3 g NaCl, 17 g agaroz, ve 2.5 g bactopeptone: 25 96-kuyu RNAi levhalar dökmek için, nematod büyüme ortamı (NGM) 1 L hazırlanır. 121 Otoklav sıvı döngüsü ° C bir karıştırma çubuğuna sahip 40 dakika için. 60 ° C'ye kadar sıcak plaka sette karıştırarak, soğumaya bırakın
  2. 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 5 mg / ml kolesterol, 25 ml 1 M KH 2: zaman 60 ° C'ye kadar soğutulur, aşağıdaki stok çözeltileri eklemek 4 (pH 6.0), 1 ml 1 M CaCI2, 1 ml 200 mg / ml karbenisilin ve 5 ml 1 M IPTG (tarifleri için malzemeler tabloya bakınız).
  3. Elektronik kanallı pipet kullanarak bir düz dipli 96-plaka her kuyuya RNAi medya 150 ul dağıtın. Hava kabarcıkları kaçının. Dağıtım sırasında 60 ° C su banyosuna batırılır steril bir paslanmaz çelik kap içinde medya tutun.
  4. Agaroz katılaşır kadar RNAi plakalar düz tutun. Plakalar önceden 2 hafta kadar dökülmüş ve 4 ° C'de saklanır

1. Gün

2. Dikdörtgen Amp / Tet (A / T) LB Agar Plakalar üzerine Dondurulmuş Kütüphane Tabaklar Damga

  1. Karanlık içinde tutulması, oda sıcaklığında, bir A / T plakaları ısıtın.
  2. -80 Transfer 96-sıra RNAi kütüphane plakaları ° C buz kurutun. Bir Bunsen beki yakın alüminyum-mühürlü plaka açın.
  3. % 10 çamaşır suyu (10 sn her) seri işaretçilerine daldırarak bir 96-pin çoğaltıcı sterilize,% 70 E H 2 O deiyonize veToh bir bir alev ile işaretçilerine geçirerek izledi. EtOH ve alev adımı yineleyin.
  4. Her pin kontaklı her çukurun yüzeyine emin, dondurulmuş 96-RNAi gliserol stok çoklayıcıyı uygulayın.
  5. Zarar agar yüzeyinden olmadan her iğne ile küçük bir daire çizerek, A / T plaka üzerine Damga.
  6. -80 Yeniden mühür ve getiri kütüphane plakaları ° C. Inkübe 37 bakteri büyümesi için ° C'da gece boyunca A / T plakaları damgalı.

2. Gün

3. Derin Kuyu Blokları Gecelik RNAi Bakteriyel Klonlar büyütün

  1. 37 ° C A / T plakaları çıkarın ve bakteriyel büyüme onaylayın.
  2. 200 ug / ml karbenisilin ile LB 1.5 ml bir 96-kuyucuklu derin kuyu bloğun her kuyuya doldurun.
  3. 96-pin çoğaltıcı (adım 2.3) sterilize edin.
  4. Emin işaretçilerine Her bakteriyel RNAi klon temas yaparak, A / T plakasının üstüne çoklayıcıyı uygulayın. Derin kuyu bloğa çoğaltıcı ve batırmayın işaretçilerine kaldırın. Girdap, ve yavaş yavaş ce yapım, kaldırmakkomşu kuyuları kontamine etmemek rtain.
  5. Nefes kolay film blok Seal. 37 gece inkübe ° C ajitasyon (MT Infors Microtiteron II tercih shaker, veya 25 mm-throw sallayarak inkübatör içinde 250 rpm 950 rpm).

3. Gün

4. 96-NGM RNAi Plakalar üzerine Tohum RNAi Bakteriyel Klonlar

  1. 4 ila 96 oyuklu plakalar RNAi kaldırma ° C ve oda sıcaklığına ısıtın.
  2. Derin kuyu blokları çıkarın ve 4.000 x g'de 10 dakika santrifüj.
  3. Hızla medya drenaj lavabonun içine blokları ters ve aşırı ortam ortadan kaldırmak için kağıt havlu üzerine ters damga.
  4. Bir laminer akış kaputu altında, steril film ile her iyi ve mühür ile 200 mg / ml karbenisilin ile LB 40 ul ekleyin.
  5. 10 dk pelet tekrar süspansiyon, veya elle dikkatli pipetleme ile pelet tekrar süspansiyon oda sıcaklığında bakteriyel çalkalayıcı blokları dönün.
  6. Laminer akış kaputu, gelen derin-steril filmi ve transfer bakteri kaldırmak96-RNAi plakalar üzerine de bloklar. Diğer tüm satırlar satır 'A' ve 'H' ve 35 ul yeniden süspanse bakterilerin 40 ul ekleyin. Daha fazla sıvı saçınızın aşırı ve agaroz çatlamasını önlemek için, 96-kuyu RNAi levha kenarına oyuklara ilave edilir.
  7. Kuruluk için düzenli teftiş, 4-6 saat için kaputu kurumasını ortaya plakaları bırakın. Kuru bakteriler bulutlu değil, açık görünür. Kapak, plakalar ters ve gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.

5. Worms bir Senkron Nüfus hazırlayın

Birçok gebe kurt ile doldurulmuş iki adet 10 cm tabak her 6 96 oyuklu plakalar RNAi için yumurta hazırlanması için kullanılır. Solucanlar en az iki nesil (7 gün) olmayan düşkünü olduğundan emin olun.

  1. Daha önce 20 açıklandığı gibi L1 senkron bir nüfusa hazırlayın. Ağartıcı çözelti, 20 ml için, 1 ml NaOH (10 M), 5 ml H2O deiyonize su, ve 10 ml tampon M9 4 ml ağartıcı kullanır.
  2. 15 ml steril 10 ml M9 içinde gece boyunca kurt senkronize20 polipropilen tüp dönme ° C

4. Gün

6. RNAi Plaka Worms ekle

  1. 1 dakika için 3000 xg'de yumurta preparatlarıyla santrifüjleyin. L1 yavru pelet uzak durarak, süpernatant aspire. 0.0005% Triton X-100 ile 5 ml M9 tampon süspanse edin. Deterjan küçük bir miktarının eklenmesi pipet yapışmasını önler ve kurt yağ boyama üzerinde hiçbir etkisi yoktur.
  2. Bir mikroskop altında solucanlar sayın. Gerekirse, mikrolitre başına 10-15 solucanlara konsantrasyonunu ayarlayın.
  3. Laminer akış Hood, tohumlanması için her bir 96 kuyulu plaka için, bir sığ-kuyu tahlil bloğun bir sıra her oyuğuna yeniden süspanse solucanların 75 ul ilave edin. Bir kılavuz çok kanallı bir pipet kullanılarak, 96 gözlü levhalar RNAi her oyuğuna 5 ul içinde 50-75 solucanlar ekleyin.
  4. Plakaları 30 ila 60 dakika kaputu kurumasını bekleyin. Kuru, mikroskop altında, solucanlar dayak değil, emekleme gibi görünmelidir.
  5. RNAi plakalar üzerinde solucanlar büyütün20 ° C ~ 64 saat boyunca.

7. Gün

7. Fix ve Nil Kırmızı Worms Leke

  1. Inkübatör RNAi plakaları çıkarın. Bu koşullar yağ kütlesi etkileyecek gibi, mikroskop ve kayıt aç ya dayak (ıslak) daha fazla analiz çıkarmak kuyu altında inceleyin.
  2. Bir elektronik tekrar pipet kullanarak, 150 ul PBS% 0.01 Triton ekleyin bir RNAi plakanın her X-100. 96-derin kuyu PCR plate karşılık gelen satır için solucanlar ile manuel çok kanallı pipet, mix ve transfer sıvı ile. Agar bozan kaçının. Kuyu başına PBS 300 ul solucanlar toplam tekrarlayın.
  3. Dört tabak transfer edildiğinde, 1 dakika boyunca 500 rpm'de plakaları santrifüj.
  4. Kuyunun dibinde ~ 25 ul sıvı ve solucan pelet bırakarak, bir 96-pin vakum aspiratörü kullanarak süpernatant aspire.
  5. Hayvanlar düzeltmek için her bir kuyunun izopropanol 40% 150 ul ekleyin. Solucan karıştırmak için yeterince yüksek bir hızda pipet olduğundan emin olun% 40 izopropanol ile pelet. 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
  6. Santrifüj plakaları 1 dakika için 500 rpm'de ortaya çıkardı.
  7. Kuyunun dibinde sadece 25 ul% 40 izopropanol + solucan pelet bırakarak, bir 96-pin aspiratör veya elle kullanarak süpernatant aspire.
  8. % 40 izopropanol 0.5 mg / aseton ml 1 ml başına 6 ul Nil kırmızı stok solüsyonu: Her iyi için, kullanımdan hemen önce hazırlanan Nil kırmızısı boyama çözeltisi 150 ul ekleyin.
  9. Seal non-steril yapışkan film ile plaka ve en az 2 saat süreyle karanlıkta leke.

8. Yüksek throughput Mikroskop üzerine Yıkama ve Görüntü Worms

  1. 1 dakika boyunca 500 rpm'de santrifüj ve Nil kırmızı boya tüm ama 25 ul aspire.
  2. Ile% 0.01 triton en az 30 dakika boyunca karanlıkta ve her bir kuyu deposu için X-100. PBS içinde 150 ul ekle
  3. 1 dakika boyunca 500 rpm'de santrifüj.
  4. 2 x 7 ul pratik Her kuyunun dibinde bir 12 kanallı pipet, aspirat hayvanları kullanmaBir 96-Teflon baskılı cam slayt üzerine felç ve dağıtmak. Dikkatlice, solucanlar çıkarmadan, slayt her kuyudan PBS 9.5 ul çıkarın. Sizin cam slayt mikroskop monte doğrudan uymuyorsa, özel işlenmiş alüminyum slayt tutucu solucanlar monte etmek için kullanılmalıdır.
  5. 96-slayt üzerine yavaşça alt kapağını slayt. Bu adım kabarcıkları önlemek veya diğer kuyulara solucanlar üzerinde çapraz için bazı pratik alabilir. Yapışkanlı tack ile Güvenli köşeleri.
  6. Bir GFP / FITC filtresi ile parlak alan ve floresans Görüntü slayt otomatik mikroskop ayarlanır. Photobleaching kuyuları arasındaki suni farklılıklar doğuracağını gibi lipid sinyal ağartıcılar kolayca bu yüzden değil, elle, tüm kuyularda sistematik bir şekilde yansıması olmalıdır. Analizi ile ilgili daha fazla bilgi için Temsilcisi Sonuçlar ve Tartışma bakın.

9. Katı Faz Ekstraksiyonu (SPE) ve Gaz Kromatografisi-Kütle Spektrometresi (GC / MS) kullanarak Biyokimyasal Lipid Belirlenmesi

  1. 15 ml konik polipropilen tüp içine 10 ml M9 tamponu ile her 10 cm plaka 2,500-5,000 solucanlar yıkayın. Pelet bir dakika boyunca 500 xg'de solucanlar, ve 10 ml M9 tamponu ile tekrar pelet yıkayın. 500 x g hızında Pelet hayvanlar. Azot fo altında -80 sıvı azot ve mağaza 250 ul toplam hacim, ve ya donma ° C çıkış aspirer daha sonra işleme veya doğrudan devam.
  2. Solucan topak trigliserid kütle fosfolipid kütle 8,13,21 normalize edilmesi için ise 9,3 doğrudan adım alınabilir. Araştırmacı protein içeriği veya DNA içeriği normalleştirme arzu Ancak, solucan pelet 10 dak, 4 az 30 saniye, 30 saniye kapalı ° C bir banyo sonikatör en yüksek yoğunluğa sonike olmalıdır Protein veya DNA normalleştirme arzu edilirse, bir 5 ul alikot kaldırmak ve bir UV spektrofotometre kullanılarak kolon saflaştırmadan sonra, bir Bradford reaktif ya da benzer ya da toplam DNA içeriği kullanarak toplam protein konsantrasyonu belirlenir.
  3. Bir dişli borosilikat cam tüp içinde metanol: 1.5 ml 02:01 kloroform solucanlar ekleyin. Organik çözücülerin Tüm transfer cam pipet kullanılarak yapılması gerekir.
  4. Bir wiretrol 50 ul pipet kullanarak, 50 ul 25 nM fosfolipid standart ve 50 ul 16.7 nM trigliserid standart ekleyin. Her iki standart 02:01 kloroform içinde çözülmüştür edilmelidir: metanol, sıkıca kapatılmışve oksidasyon önlemek için -80 ° C derin dondurucuda ışıktan azot altında saklanır.
  5. Fenolik kap ve vorteks ile Cap. Her 15 dakikada bir vorteks, oda sıcaklığında 1 saat boyunca çıkarın.
  6. 5 dakika boyunca 1000 rpm'de santrifüj. Borosilikat kültür tüpüne leşleri olmadan düşük organik faz aktarın.
  7. 0.3 ml% 0.9 NaCl, 5 dakika boyunca 1000 rpm'de vorteks ve santrifüj ekleyin.
  8. Sulu faz herhangi birinin üzerine aktarmak için değil emin olun, taze bir borosilikat kültürü tüp alt organik tabaka aktarın.
  9. Azot altında kuru organik faz. Başlamak için katı faz ekstraksiyonu (SPE) 1 ml kloroform içinde kurutulmuş lipid tekrar süspansiyon haline getirin. Alternatif olarak, fosfolipid sınıfları, glikolipitler, spingolipitler, diasilgliseroller, triaçilgliserol, serbest yağ asitleri ve kolesterol esterleri gibi farklı lipit sınıfları, detaylı ayrılması ve analizi için, ince tabaka kromatografisi gibi C. Watt laboratuvarı tarafından öncülük elegans 22 SPE yerine kullanılabilir. Lipidler b de olabilirE HPLC ve GCMS analiz kesirler ile ayrılır. Liquid-chromatography/MS (LCMS) ile bütün-lipidome profillerinin gelişmiş yöntemler de 23-26 kullanılabilir.
  10. SPE manifoldu üzerine silika SPE kolonundan birleştirin. 3 ml kloroform ile Pre-muvazene sütun. Yerçekimi ile akmasına çözücü izin verin.
  11. Ilk fraksiyon (TAG fraksiyonu) bir parçası olarak bir dişli borosilikat tüp içinde akış yoluyla toplanması, SPE kolona lipit örneği yerleştirin. En nötral lipidler bu ilk 1 ml akan yoluyla gelecektir. Tam TAG fraksiyonu tüp akan toplama, TAG fraksiyonu Zehir 3 ml kloroform ekleyin.
  12. Çıkarın ve ilk toplama tüpünün kap ve temiz bir toplama tüpüne ile değiştirin. Metanol 9:1, 5 ml aseton ile Glikosifingolipidler Zehir. Biz rutin bu fraksiyonun yağ asidi kompozisyonu analiz etmezler, ancak değerli bilgiler içerebilir ve kullanan daha fazla analiz için metil esterleri ve ücretsiz sphingoid üsleri hazırlanması için kaydedilebilirDaha önce 27 açıklandığı gibi TAG ve PL için bu farklı özel prosedürler.
  13. Ikinci bir dişli borosilikat toplama tüpü ile glycosphingolipid toplama tüpü değiştirin. 3 ml metanol (PL fraksiyonu) ile fosfolipidlere Zehir.
  14. Kesirler -80 ° C de azot altında sıkıca kapatılmış bu noktada saklanabilir. Azot altında lipidler saflaştırılmış Kuru. 33 bir kuru ısıtma bloğu, kurutma hızlandırmak için ° C Bunlar kurutulmuş halde oksidasyon için özellikle duyarlı olduğu gibi, kurutulmuş formda depolamak lipidler asla.
  15. Vorteks ve inkübe tarafından metanol içinde 2 ml% 2 H 2 SO 4 süspanse kurutulmuş lipid fraksiyonları FAME oluşturmak için 55 ° C su banyosunda sıkıca gecede şapkalı. Bakım Bu büyük ölçüde lipit türevlendirme inhibe olacak gibi FAME reaksiyon kesinlikle hiçbir su almak için alınmalıdır. Biz bir gecede inkübasyon daha verimli türevlendirme bulduk ve Literatür az lipid oksidasyonu düşük sıcaklıklarda oluşur During FAME hazırlık 28. Bir alternatif ve daha hızlı bir metod metanol içinde 2 ml% 2.5 H 2 SO 4 ve 70 ya da 80 ° C '21,22,29 azından bir saat için türevlendirmek için.
  16. Ertesi sabah, banyo kaldırmak ve soğumasını bekleyin. Her bir TAG ve PL fraksiyonu daha sonra 1.5 ml H2O (reaksiyon gidermek için) ve 0.3 ml hekzan (FAME elde etmek için) ekleyin. Shake şiddetle ve 5 dakika boyunca 1000 rpm'de santrifüj.
  17. Çok dikkatli bir standart pipet veya Pasteur pipeti kullanarak sadece üst hekzan katmanı kaldırın. Otosampler tüp içine dağıtın. Bu GC sütunu ve MSD yok edecek gibi herhangi asitlendirilmiş metanol dahil değildir emin olun.
  18. GC / MS üzerine Cap ve yük örnekleri. Örnek bir PTFE-silikon-PTFE vidalı kapaklı şapkalı bir mikro-insert Agilent şişeye hekzan aktarılır. Bu Supelcowax-10 (24079), 30 metre, 250 mikron erimiş silis kolonu ile donatılmış Agilent GCMS modeli 6890/5973N aktarılır. Bir mikrolitre enjekte edilir intoa splitless girişinde 250 ° C ve 13.33 PSI Ultrasaf Helyum taşıyıcı gazı kullanılır ayarlayın. Protokol çalışma olarak dakika başına sabit bir 1 ml aşağıdaki gibidir:
Adım Talimat Hedef Sıcaklık
1 2 dakika tutun 150 ° C
2 ° C başına min Rampa 10 200 ° C
3 4 dakika tutun 200 ° C
4 Rampa 5 ° C başına min 240 ° C
5 3 dakika tutun 240 ° C
6 ° C başına min Rampa 10 270 ° C
7 5 dakika tutun 270 ° C

3 dk çözücü gecikme fil üzerinde aşınmasını azaltmak için MSD sırasında kullanılırAment. Bundan sonra, 50 ve 550 dalton arasında kütlelere 270 termal Yardımcı ° C ile 150 ° C ve 230 ° C'de belirlenen ms kaynağında MS dörtlü set ile tespit edilir

Representative Results

Yağ boyama akışı yoluyla alınmıştır resimli bir plaka bir örneği Şekil 1'de gösterilmiştir. Yüksek yağ (Daf-2 insülin reseptör RNAi), düşük yağ (gut RNAi lipid depo granülleri için gerekli lpd-3 protein), küçük ve düşük yağlı (fasn-1 yağ asidi sentaz RNAi), ve boş vektör (için özel kontroller kontrol) hayvanların yağ seviyelerine göre floresan yoğunluğu varyasyonları, ve GC / MS analizi (Şekil 2) göre tespit edilen karşılık gelen lipid gösterirler. Gelişimsel tutuklandı giden gen inactivations, küçük hayvanlar genellikle bakılmaksızın yağ metabolizması için herhangi bir bağlantısı (Şekil 3), erişkin kontrol hayvanlara göre çok daha düşük yağ var görüneceğini unutmayın. Benzer bir gelişim aşamasında vahşi-tip kontrol hayvanların SPE-GCMS ile boyama analizi ve lipid biyokimyası dahil İkincil analiz, doğruluğunu sağlamak için yapılmalıdırKüçük ya da gelişimsel pozitif vurur tutuklandı. Fasn-1 RNAi (Şekil 2), L2 veya L3 larva aşamasında ya hayvanların yakalanması ve erişkin kontrol RNAi daha düşük yağlı boyama var, ama L2-L3 kademe kontrol RNAi hayvanlar (yağlı leke yüzde bolluk benzer olması durumunda 49.9 ± 4.5 fasn-1 RNAi ve 20.2 için% ± L2 kontrol RNAi için% 2.1 ve 64.7 ± L3 kontrol RNAi için 1.3): erişkin kontrol RNAi. Alternatif olarak, biyokimyasal analizler (: 22.5 ± fasn-1 RNAi ve 46.1 için 2.9 ± evre-eşleştirilmiş kontrol RNAi, P ≤ 0.05 için 3.4 TAG / PL) N2 kontrol hayvanları eşleşti L2 aşamasında daha düşük TAG / PL oranı belirtilir. Dolayısıyla bu durumda o fasn-1 yerine yağ kütlesinin sadece bir sahne özgü azaltma dışında lipid depo bir rolü olduğunu biyokimyasal analizi ile teyit edilebilir.

Görüntülü solucan takip analizi kullanılarak örneğin Hücre Profiler gibi bir hesaplama platformu dayanırWormToolbox 30. Görüntülerin daha az sayıda için, bu gibi NIH serbestçe mevcut ImageJ, bir halka açık görüntü analizi platformu kullanılabilir. Bizim analizi için, benzersiz Matlab komut tespit etmek de, ve daha sonra boş bir kuyu veya kabarcıklar olan dışlamak ve solucanlara karşı küçük enkaz ayırt olanlar kullanılmıştır. Manuel kalite kontrol yukarıda belirtilen nedenlerle dışlama bayraklı görüntüler için gerekliydi. Biz genelinde ampirik solucan pikselin 90.persantil yoğunluğu bulunan bir kuyu, solucan gelişimin bütün safhalarında (Şekil 3) yoğunlukta boyanma metrik tutarlı sağlanan iyi genelinde solucan alanı, normalize. , Solucanın alan üzerinde toplam yağ kütlesi entegrasyonu tersine, büyük loş solucanlar ile eşdeğer küçük parlak solucanlar skor eğiliminde olacaktır. Bizim yöntem yoğunluğu yüzde alarak, solucanın alan üzerinde toplam floresan sinyal entegre olmadığından, per se solucan boyutu değişir hiçbir şey işe yaramazt önyargı şiddetini ölçtü. Bunun yerine, piksel yoğunluk dağılımı farklılıklar ölçülür. Ancak, buna rağmen, belirgin farklılıklar farklı gelişim aşamalarında hayvanların arasında piksel yoğunluğu dağılımı boyama görüldüğü, bu nedenle benzer bir gelişim aşamasında (Şekil 3) hayvanlara karşı herhangi bir gen için RNAi etkisini incelemek için önemlidir. Çoğaltır arasındaki ortalama değişkenlik yağ boyama yöntemi, yüksek tekrarlanabilirlik göstermektedir, Şekil 4'te gösterilmiştir. Yöntemin gücü aynı pozlama süreleri kullanarak, düzgün bir aydınlatma koşullarında, her plaka için kaliteli görüntüler elde oldukça bağımlı olduğunu unutmayın, ve minimal kabarcıklar, moloz veya diğer kuyulara solucan crossover ile.

SPE TAG'ler PL (Şekil 5A) ayrılmış olabilir için derecesini belirlemek için standart arıtılmış, ön karışım üzerinde yapıldı. Bu analizde, biz 100% s eldeTAG ve PL, bir Ayırma TAG örnek olarak 17:00 PL türetilen yağ asitleri ve PL örnek olarak TAG (Şekil 5A) dan elde edilen yağ asitleri 13:00 karşılık gelen bir tam olmadığı tam yokluğu olarak gösterilir. Böylece SPE lipit sınıfları ayıran az yüksek verimli olduğunu. Bu analiz farklı zincir uzunluğuna sahip tüm TAG'lar SPE tarafından eşdeğer saflaştırılmış ve benzeri verimlilik ile GCMS tarafından tespit edilecek anlamına gelmez. Sadece bu toplam olarak TAG ve PL lipidler birbirinden tamamen ayrılmış sağlar.

Katı faz ekstraksiyonu ve ün hazırlanması yoluyla alınan N2 vahşi tip hayvanlara bir numune GC-MS iz Şekil 5B 'de gösterilmiştir. TAG ve PL her ikisi için, tepe tutma süresi ve kütle spektrum üzerinde, üst ve kız iyonları, ve söz konusu iç standart alana göre normalize tanımlanan zirveleri altında toplam alanı üzerine göre tespit edilebilir. TAG normalize miktarı, alanı belirlemek içinTAG kromatogramın her zirveleri altında, 13:00 standart hariç, birlikte ilave edildi ve 13:00 ucu altındaki alana bölünür. Aynı şekilde, 17:00 standart dışında normalize PL toplam miktarı, her zirveleri altında kalan alan, belirlemek için, birbirine eklenir ve 17:00 ucu altındaki alan ile ayrıldı. TAG ve PL numuneler için normalize edilmiş değerler, daha sonra numune için nihai TAG / PL oranını hesaplamak için kullanılmıştır:

Denklem 1
Bu, SPE-GCMS verileri PL oranı toplam TAG basit bir hesap göre her bir lipit fraksiyonu içinde mevcut yağ asitlerinin çok daha sofistike bir analiz izin verdiğini not edilmelidir. Örneğin, bir araştırmacı tek bir yağ asidi tekabül eden bir tek tepe noktasının, entegre olabilir ve (örneğin, c örnekleri arasında kendi normalize bolluk karşılaştırmakdaf-2 RNAi PL 17:00 standart pik alanına bölünmesiyle toplam PL kitle normalize 13:00 standart pik,) bölünmesiyle 18:00 tepe entegre alanına karşılık N2 vahşi-tip omparing:

Denklem 1
Araştırmacı seçmek gerekir, bu da yağ asidi toplam miktarının yüzdesi olarak TAG veya PL fraksiyonları içinde herhangi bir yağ asidi yüzdesini belirlemek mümkün olacaktır (N2 solucan TAG fraksiyonu içinde bir örnek olarak 18:00 nicelendirildi )

Denklem 1

"Şekil Şekil 1. Genel deney için tipik iş akışı. Gün 1, dondurulmuş RNAi kütüphane plakaları Amp / Tet LB agar plaklarına damgalanmış ve 37 ° C'de inkübe edilir Gün 2, Amp / Tet tabak derin kuyu bloklar RNAi klonlar tohum sıvı kültürleri için kullanılır. 3. gün, bakteriler santrifüj ile konsantre edildi ve 96 oyuklu plakalar RNAi aktarılır. 4. Gün, L1 yavru C. elegans sıvı içinde RNAi plakalara ilave edildi ve kurumaya bırakılır. 7. gün, hayvan 96-Teflon slaytlar üzerine monte edilmiş,% 40 izopropanol içinde Nil kırmızı ile boyanmış, sıvı toplandı ve bir yüksek verimli mikroskop ile görüntülenmiştir edilir.

Şekil 2,
Şekil 2. Büyük Sabitleme tabanlı Nil kırmızı lekeler fasn-1 (küçük, az yağlı), lpd-3 (düşük yağ) N2 solucanlar beslenen gösterildiği veya daf-2 (yüksek yağ) vardır RNAi klonlar. Örnekler protokolü (Şekil 1 'de şematik) başına edildiği şekilde işlenir. Hayvanlar, sabit Nil kırmızı lekeli ve karşılaştırılabilir lipid düzeylerinde görüntülü sonucunda biyokimyasal lipit ölçümü elde. Biyolojik en az 6 tekrarlı elde İzopropanol-Nil sabit kırmızı flüoresans seviyesi, ilk satırda verilmiştir. Çoğaltır 4 Biyolojik alınan genel fosfolipid düzeyleri (TAG / PL), normalize zaman genel nötral lipid depolarının yansıtıcı Kantitatif trigliserid düzeyleri, ikinci satırda gösterilir. Bu sabitleştirici Nil kırmızısı boyama ve biyokimyasal lipit tayini ulaşılan mutlak miktarının genellikle mükemmel uyuşmuyor dikkat etmek önemlidir. Bu durumda, nitel olsabenzer fasn-1 (RNAi) mikroskopi gösterdiğinden daha biyokimyasal yöntemlerle daha farklı trigliserid kütle vs kontrolü vardır, lpd-3 nispeten farklıdır ve daf-2 (RNAi) tüm farklar istatistiksel olarak anlamlı olmasına rağmen, daha az farklı ve ölçümleri yüksek tekrarlanabilir. Gösterilen veriler ortalama ± SEM (*, P ≤ 0.01; **, P eşit varyans varsayılarak eşleştirilmemiş, iki uçlu t-testi ile belirlenen denetim ≤ 0.0001 göreli).

Şekil 3
Şekil 3,. Yağ kitlesi farklı larva dönemlerinde fiksasyon Nil kırmızısı boyama tarafından belirlenir. Hayvanlar OP50 bakteri yetişen ve L1 toplanmıştır, L2, L3, L4 ve gebe yetişkin gelişim evreleri. Görüntüleri fiksasyon boyama sonrasında yakalanan ve 90 inci persentil o belirlemek için özelleştirilmiş bir Matlab komut dosyası kullanılarak analiz edilditespit solucan alana f piksel yoğunluğu. Hayvanların lipid hayvan L2 L4 aşama geliştirir olarak büyük ölçüde artar ve daha sonra hayvan yetişkin aşamasında germline proliferasyonu kalori doğru yönlendirmek için başlar gibi hafif bir azalma olduğuna dikkat edin. Gösterilen veriler ± ortalamadır 6-8 SEM çoğaltır (** P eşleştirilmemiş, iki uçlu t-testi ile tespit gravid yetişkin ≤ 0.0001 göreli).

Şekil 4,
Şekil 4. Bağımsız biyolojik genelinde Yüksek tekrarlanabilirlik çoğaltır. Gösterildi biyolojik genelinde Nil kırmızı floresans yoğunlukları bir scatter plot olduğunu çoğaltır (n = 6-8). Her çoğaltmak için, tüm değerleri boş vektör kontrollerin ortalama yoğunluk normalize edilmiştir. Gösterilen veriler ortalama ± SEM (** P eşleştirilmemiş, iki uçlu t-testi ile belirlenen denetim ≤ 0,0001 göreli varsayarak ortalama vardıreşit varyans).

Şekil 5,
Şekil 5,. GC-MS SPE kromatogramları standartları ve vahşi tip TAG ve PL bolluğu ayrılır. (A) GC-MS izleri TAG ve PL standartların SPE ayrılığı gösterilir. PL TAG birbirlerinden tamamen ayrılmış (tritridecanoin) (1,2-diheptadecanoyl-sn-glisero gösteren PL izleme 13:00 yağ asidi olmamasıdır ve TAG izleme 17:00 yağ asidi karşılık gelen olmadığına dikkat -3-fosfo-(1'-rac-gliserol)). N2 vahşi tip beslenen hayvanların vektör kontrol RNAi (L4440 boş vektör RNAi ile HT115 bakteriler) bir örneklem TAG ve PL (B) bir temsilci tam spektrum. Örnek bir mikrolitre ile verilen protokole göre bir Agilent 6890/5973N GCMS içine enjekte edildi ve her bir pik rete ile tespit edilmiştirntion zaman ve kendi kütle spektrumları. Kısaltmalar: siklo, siklopropan yağ asidi; iso:. Iso-metil dallı zincirli yağ asidi; GLA, gamma linolenik asit; ALA, alfa linolenik asit; DGLA, dihomo gamma linolenik asit; EPA, eikosapentaenoik asit büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Discussion

Sunulan protokol C. lipid düzeylerinin hızlı, büyük ölçekli tarama sağlar Kolayca yüksek verimlilik ekranlara adapte edilebilir elegans. Birçok donma-çözülme döngüleri 8,10 izledi paraformaldehid uzun bir fiksasyon basamağı içeren önceden kullanılan yöntemler, aksine, bizim protokol izopropanol basit bir 3-min fiksasyon gerektirir. Biz bulduk C. boyanarak % 40 isopropanol elegans, bunlar ek donma-çözülme veya fiksasyon adımları kullanmadan, Nil kırmızı serbestçe geçirgen hale gelir. Nil kırmızı seçici olarak yeşil tayf 18,19,31 hidrofobik bölümlerinde fluoresces olarak da, hiçbir destaining gereklidir. Toplamda, hayvanların biraz üzerinde 2.5 saat lekeli ve hazır görüntü hayvan RNAi plakalar alınabilir. Bu yöntem, nispeten pahalı olmayan ve yüksek bir yeniden üretilebilirlik ile gerçekleştirilebilir. Yöntem C yeteneğine bağlı değildir alımı veya konsantre etmek elegansBu nedenle boya, ve hayati boyalar kullanılarak dayalı yöntemler besleme olarak aynı sınırlama yoktur. Tekrarlanabilirlik ve ölçüm hassasiyeti nedeniyle, yöntem RNAi ile gen inactivations çok sayıda taranması için uygundur. Lipid düzeylerinin kantitatif fiksatif Nil kırmızısı boyama dayalı isteniyorsa, biz biyolojik uygun kontrolleri ve uygulamalı istatistik testi ile çoğaltır 4-6 kullanılmasını öneririz.

Küçük hayvanlar götüren birçok gen inactivations (gecikmiş veya tutuklanan oluşumuna yol RNAi klonları nedeniyle) ne olursa olsun yağ metabolizması için herhangi bir bağlantı, yağ düzenleyiciler için bir ekran çıkması olasıdır. Biz solucan alana floresans yoğunluğu normalize ederek farklı boyutlarda solucanlar hesapları kullanılan görüntü analiz programı, bireysel araştırmacılar da benzer bir gelişim aşamasının vahşi hayvanlara küçük hayvanların yağ boyama düzeylerinin karşılaştı düşünebilirsiniz. Inbelirgin düşük yağ kütlesi ile küçük ya da gelişimsel tutuklandı hayvanlar durumunda, biz tek bir modalite değişmiş lipid metabolizması göstermek için yeterli olduğunu göstermektedir. SPE-GCMS dahil birçok takip deneyler, bu genlerin lipit düzenleyici fonksiyonunu belirlemek için gerekli olabilir. Bilinen metabolik regülatör için fasn-1, SPE-GCMS analiz gelişimsel olarak uyumlu N2 L2 kontrol hayvanları ile karşılaştırıldığında, yetişkin kontrol hayvanları ile karşılaştırıldığında belirgin bir yararlı düşük yağlı fenotip onaylamak için gerekli idi. Nil kırmızı yağlı boyama aşamasında eşleştirilmiş L2 kontrol RNAi hayvanlara kıyasla yetişkin RNAi, kontrol grubuna göre daha düşük yağ seviyelerini ifade ederken, hiçbir belirgin fark görülmedi. Buna göre, fasn-1 RNAi sahne eşleştirilmiş L2 kontrol RNAi hayvanlardan biyokimyasal ayırt olduğu gibi fasn-1, yağ kütlesi gerçek bir regülatör olduğunu belirlemek için, ikinci bir yöntemin gerekli TAG / PL oranı yani biyokimyasal ölçümü yapıldı kullanın.

20 veya teflon yazdırılmış geleneksel büyüklükteki monte solucanlar görüntüleri yakalamak için kullanılabilir 8 ila 12 sıra mikroskop slaytlar . Tek sınırlama hızlı Nil kırmızı ağartıcılar ile boyanmış lipid damlacıklarının yeşil floresans olarak, sistematik, üniform pozlama şartlarına görüntüleri arasında karşılaştırılabilirliği sağlamak için kullanılmak üzere ihtiyaç vardır. Biz düzgün görüntü elde etme koşulları ile tam otomatik bir mikroskop bu etkiyi en iyi işe yaradığını bulabilirsiniz.

Bu protokolün en büyük güçlerinden biri görüntüleri tahsil edildikten sonra yeniden analiz geleceği için kaydedilmiş olabilir olmasıdır. Aynı görüntüler yağ içeriğine ek olarak vücut büyüklüğünü belirlemek için kullanılabilir. Hesaplamalı programları daha gelişmiş hale geldikçe Ayrıca, istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar üreten, tek solucan analiz için umudu vartek bir kuyudan. Böylece high-throughput mikroskopi kullanır bizim yöntem floresan sinyalleri 32,33 ölçmek için bir Copas Biosort kullanmak yayınlanan ekran metodolojileri göre bazı üstünlüklere sahiptir. Bununla birlikte, yöntem kesinlikle ücretsiz.

SPE ve GC / MS ile lipit içeriğinin hassas, biyokimyasal tayini C. büyük yağ depolarının Nil kırmızısı boyama doğruladı elegans. Sabitleştirici Nil kırmızısı boyama ve biyokimyasal lipit tayini ulaşılan mutlak miktarının genellikle mükemmel uyuşmuyor olsa da, her iki yöntem de niteliksel katılıyorum yüksek oranda tekrarlanabilir, istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar üretebilir. Buna ek olarak, bu yöntem Glikosifingolipidler, fosfolipidler, ya da çeşitli örneklerinde trigliserit mevcut ayrı sınıflar daha fazla analiz gerektiren bireysel araştırmacılar belirli ihtiyaçlarını karşılamak için tasarlanmış olabilir. Bu, diğer gruplar teknoloji diğer tha kullanılmış olduğunu belirtmek gerekirN SPE GC / MS 22. önce lipit sınıfları ayırmak için. İnce tabaka kromatografisi (TLC) ve yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) onlar (fosfatidilkolin, polar lipidler daha iyi ayrı ayrı nötral lipitler (örneğin TAG, diasilgliseroller, serbest yağ asitleri ve kolesterol esterleri) mümkün olabilir bunda SPE fazla avantajlara sahiptir fosfatidiletanolamin) ve glikol spingolipitler. Bu malzeme (2,500-5,000 solucanlar) başlayarak en az gerektirir çünkü SPE seçin, bu nötral lipid fraksiyonu 4 çoğunu oluşturan önemli uzun vadeli enerji depolar, TAG, vurgular, ve hızlıdır, hiçbir özel ekipman gerektiren veya plakalar. Bu standart karışımlar dayalı olduğu vurgulanmalıdır, SPE tamamen PL gelen TAG'lar ayırır, ve (Şekil 5A bakın) son derece güvenilir ve tekrarlanabilir olduğunu. Yağ asidi metil esterleri miktarının ve analizi GC / MS gerektiriyorsa, bu cihaz yaygın olarak kullanılabilir ve eğer yerel olarak, örnekler olabilirYukarıdaki gibi oluşturulan ve bir ortak çalışan ya da ticari GC / MS ile analiz servis düzenlenmiştir gününe kadar -80 ° C de azot altında saklanır.

GCMS Çıktı, her lipit türün içindeki her bir yağ asidi yüksek çözünürlüklü verileri içerir. Bu kıyasla örnekleri arasındaki detaylı farklılıkların belirlenmesi izin verir. Bir örnek olarak, bazı araştırmacı yağ asitlerinin düzeylerinin daf-2, LPD-3 ya da fasn-1 RNAi karşı vektör kontrol olarak diğerlerine göre daha belirgin olarak bol miktarda değiştirilmiş olup olmadığını belirleyebilir. Bu son derece güçlü bir araç nedenle lipid türlerinin herhangi bir deneysel manipülasyon ile bolca değişmiş olduğu hakkında ayrıntılı bilgi sağlayabilir.

Bizim analizi için, biz en sık PL kitle TAG kitle normalleştirmek. Protein veya DNA ayrıca sonicated solucan pelet bir kısım arasından tespitini müteakip lipid kitle normalleştirmek için kullanılan olabilir, biz bu yöntemleri int tabi olduğunu bulmakTüm pipetleme aşamaları boyunca ve her çıkarma numune kurtarma roduced insan hatası. Biz yerine bizim normalizasyon faktörü olarak PL kitle kullanmayı seçti bu nedenle içindir. Unnatural standartları protokolünün başlama (TAG tritridecanoin, 1,2-diheptadecanoyl-sn-glisero-3-fosfo-(1'-rac-gliserol) PL) tanıtıldı katı faz ekstraksiyon tüm adımlarda gerçekleştirilir ve FAME hazırlanması ve TAG ve PL fraksiyonlarının hem nicel ve temsili kurtarma garanti. Araştırmacılar TAG kitle normalleştirmek için protein veya DNA kullanırsanız aynı garanti yapılamaz. Biz PL örnekleri karşısında TAG düzeylerini karşılaştırmak için hangi en güçlü göstergesi olduğuna inanıyorum, daha önce PL sadece inceden TAG seviyeleri, örneğin uzun açlık büyük kitle vardiya etkileyen aynı uyaran tarafından değiştirilmiş veya egzersiz 34 arttığı gösterilmiştir gibi - 36. PL membran akışkanlığı ve hücresel inte sağlanması, yapısal bir rol oynadığı düşünülmektedirgrity ve oldukça enerji depolama 37-39 gibi daha sinyalizasyon rolleri. Bizim ellerde, TAG / PL oranı en yakından Nil kırmızı fiksatif tabanlı lipid boyama ile elde ne eşleşir, ve diğer gruplar 21 tarafından bulunan ifade eder. Alternatif bir strateji lipid TAG yüzdesi toplam lipid 9,22,29 karşı hesaplanır Watt laboratuarı tarafından kullanılır.

TAG ve PL standart yerli olmayan tiplerin kullanılması hiçbir yerli yağ asitleri normalleşme hesaplamasına dahil edilecektir sağlar. Zincir uzunluğunun seçim sadece doğal yağ asitleri ve kütle spektrumları ile karışmaması için bu standartlar ihtiyaç dayanır. Biz, 13:00 ve 17:00 arasında yağ asitleri bu amaca hizmet için en iyi olduğunu bulduk. Bu bizim doğal olmayan yağ asidi standartları tüm zincir uzunluğu yağ asitleri veya fark ile zincir kurtarma temsili olmayabilir, kısa zincirli yağ asitleri farklı kimyasal özellikleri göz önüne alındığında, mümkünerent doygunluk indeksleri. Böylece SPE veya GCMS sırasında biz saflaştırma veya farklı zincir uzunluklarının lipidleri arasındaki algılama verimlilik farklılıkları görebilirsiniz mümkündür. Bu ve GCMS farklı yağ asitlerinin çeşitli iyon dayanarak, herhangi bir belirli yağ asidi bolluğu ile ilgili kesin bir ifade yapmak mümkün değildir. Bu nedenle, sadece herhangi bir yağ asidi tek bir deney bollukları ilk örnekler arasında karşılaştırma. Bir kesinlikle bir şekilde, bir yağlı asit miktarının belirlenmesi için isterse bu olabilir, böylece, yukarıda o ya da benzer bir yağ asidinin bir stabil bir şekilde izotopik olarak etiketlenmiş 13 C versiyon bilinen bir miktar ile çivili hazırlanmış bir örnek çalıştırmak için olacaktır elde edilebilir örneğin MSD ana iyonu, seri bağlı olarak ortaya çıkarmıştır. Biz sadece, maliyet en az lipid sınıflarının göreceli miktarları veya herhangi bir yağ asidi, bizim 13:00 TAG ve 17:00 PL standartları yeterince bu amaca hizmet, karşılaştırma dikkate alındığındaHer lipid sınıfı yeterli ve temsili kurtarma sağlamak.

Bu noktaya kadar, çeşitli yöntemler ile elde edilen bazı sonuçların yorumlanması ve mevcut metodolojileri ne olması gerektiği konusunda fikir birliği eksikliği olmuştur. Genel olarak bu izolasyon içinde hiç bir yöntem ideal olarak C'de yağ metabolizmasını incelemek için uygun olduğunu belirtmek gerekir elegans. Ancak, birden çok tarama ve doğrulama yöntemleri kullanarak, tek bir lipit düzenleyici genler üzerinde elde edilen veriler güven elde edebilirsiniz. Bizim protokol C. alanında gelecekte yapılacak çalışmalar için bir kriter olarak hizmet etmek için Böylece, biz niyetinde elegans yağ araştırma.

Disclosures

Yazarlar ifşa etmek çakışan çıkarları var.

Acknowledgments

Biz tartışmalar ve yazının okunması için teknik yardım ve Lianfeng Wu Michael Kacergis teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma NIH / NIDDK (AAS için K08DK087941), bir NIH / NIDDK eğitim bursu (ECP 5T32DK007028), Yaşlanma Ödülü (AAS için) Ellison Tıp Vakfı Yeni Scholar ve Charles H bir kariyer geliştirme ödülü tarafından desteklenmiştir . Hood Vakfı Çocuk Sağlığı Araştırma Ödülü (AAS için).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-pin replicator Nunc 250520
LB Agar US Biologicals L1500
Agarose Invitrogen 16500500
Mechanical Pipettors Biohit M Line M10, M100, M300
Electronic Pipettor Biohit E Line E1200
1 M KH2PO4 Sigma P0662 pH 6.0 Sterilized by Autoclaving
1 M MgSO4 Sigma M2643 Sterilized by Autoclaving
1 M CaCl2 Sigma C2661 Sterilized by Autoclaving
NaCl Sigma S5886
5 mg/ml Cholesterol Sigma C8667 In 100% Ethanol
200 mg/ml Carbenicillin US Biologicals C1100 Filter Sterilized 0.2 μ
1 M IPTG US Biologicals I8500 Filter Sterilized 0.2 μ
100 mg/ml Ampicillin Filter Sterilized 0.2 μ
5 mg/ml Tetracycline In 100% Ethanol
Bacto Agar BD 214040
96-well TC Plates BD-Falcon 353072 For 96-well RNAi
Rectangular A/T Plates Thermo Scientific 242811 For stamping RNAi
LB Media US Biologicals L1530 Prepared as per manufacturer instructions
96-well Deep Well Assay Blocks Corning Costar 3960 Rectangular V-bottom assay block
96-well Shallow Well Assay Block Corning Costar 3956 Round V-bottom assay block
Sterile Sealing Film VWR 89134-432
Aluminum Sealing Film Corning Costar 6570 Thermowell Sealing tape for 96-well plates
M9 Buffer See Hope et al.20 See recipe below
Triton X-100 Bio-Rad 161-0407
Nile red Invitrogen N-1142
Isopropanol Fisher BP2632-4
96-pin aspirator VP Scientific VP177A-1
96-well Teflon Masked Microscope Slides Thermo Scientific Custom Can also order Trevigen 96-well Cometslide
96-well Gold-Seal Coverslides Thermo Scientific Custom Can also use second 96-well Cometslide
Deep-well PCR plate VWR 89049-178
Non-sterile adhesive film VWR 60941-070
High-Throughput Microscope Leica DM6000 fully automated with Prior 96-well stage With Chroma 49002 GFP filter set and 2x objective
Bath Sonicator Diagenode Bioruptor XL
Chloroform Sigma 366927-4L
Methanol Fisher Optima F456-4
Phospholipid Standard Avanti Polar Lipids 830456P 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol)
Triglyceride Standard NuChek Prep T-135 tritridecanoin
Wiretrol 50 μl Pipet Fisher 21-176-3A Drummond Scientfic
Acetone Sigma 320110-4L
Sulfuric Acid Fisher A300-500
Hexane Fisher Optima H306-1
SPE Silica Column Thermo Scientific 60108-317 Hypersep SI, 100 mg resin bed
Solid Phase Chromatography Manifold Sigma 57265 Supelco Visiprep 24-DL
Borosilicate Pipets Fisher 13-678-27F 10 ml size
Borosilicate Pasteur Pipets Fisher 13-678-8B
Borosilicate Culture Tubes Fisher 14-961-27
Threaded Borosilicate Tubes VWR 14235-460 8 ml capacity
Phenolic Caps for Culture Tubes Fisher 14-823-211
GC/MS Autosampler Vials Agilent 5188-6592
Caps for Autosampler Vials Agilent 5185-5861
GC/MS Agilent 6890 GC / 5973 MSD Outfitted with a Supelcowax-10 column

Nematode Growth Media (NGM): for 25 96-well RNAi plates, prepare 1 L of NGM:

Reagent Amount
Deionized water 1 L
NaCl 3 g
Agarose 17 g
Bacto peptone 2.5 g
Autoclave liquid cycle 121 °C for 40 min with a stir bar. Allow to cool to 60 °C stirring on a hot plate set at 60 °C. Then add the following:
1 M MgSO4 1 ml
5 mg/ml cholesterol 1 ml
1 M KH2PO4 (pH 6.0) 25 ml
1 M CaCl2 1 ml
200 mg/ml carbenicillin 1 ml
1 M IPTG 5 ml
Dispense into 96-well RNAi plates. Store at 4 °C until use, up to 2 weeks.

Rectangular Ampicillin/Tetracycline LB Agar Plates (A/T): for 20 A/T plates, prepare 1 L of media:

Reagent Amount
Deionized water 1 L
LB agar (US Biologicals) 32 g
2 M NaOH 1.5 ml
Bacto agar 2.5 g
Autoclave liquid cycle 121 °C for 40 min with a stir bar. Allow to cool to 60 °C stirring on a hot plate set at 60 °C. Then add the following:
Tetracycline 3 ml
100 mg/ml Ampicillin 0.5 ml
Dispense 45 ml into each plate. Store in dark at 4 °C until use, up to 4 weeks.

LB bacterial growth media: for 4 L, sufficient for growing and resuspending 25 96-well blocks

Mix 62 g LB powder (US Biologicals), 4 L distilled water, and 4.8 ml 2 M NaOH. Autoclave in 1 L or 0.5 L aliquots, liquid cycle, 40 min. Can be stored up to 1 year in airtight bottles at room temperature. Discard if cloudy.

100 mg/ml Ampicillin

Mix 5 g ampicillin powder and deionized water to a total volume of 50 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use.

5 mg/ml Tetracycline

Add 1.25 g tetracycline powder to 250 ml 100% ethanol. Mix well until fully dissolved and store at -20 °C in a light-tight container.

200 mg/ml Carbenicillin

Mix 10 g carbenicillin powder and deionized water to a total volume of 50 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use.

5 mg/ml Cholesterol

Add 1.25 g cholesterol to 250 ml 100% ethanol. Mix well and store at 4 °C for up to 6 months.

1 M MgSO4

Dissolve 120.37 g MgSO4 in 800 ml deionized water. Bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature.

1 M CaCl2

Dissolve 110.98 g CaCl2 in 800 ml deionized water. Bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature.

1 M KH2PO4, pH 6.0

Dissolve 136.09 g KH2PO4 in 800 ml deionized water. pH to 6.0 and bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature.

M9 Buffer: for 1 L—we routinely make 8-10 L batches

Dissolve 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4 in 900 ml. Bring final volume to 1 L. Aliquot in 100-500 ml bottles and autoclave 40 min on liquid cycle and store at room temperature.

10 N NaOH

Dissolve 400 g NaOH in 800 ml deionized water, allow to cool and bring to a final volume of 1 L. Store in 50 ml tubes at room temperature.

1 M IPTG

Add 23.81 g IPTG to deionized water and bring total volume to 100 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use.

Egg Preparation Bleach/NaOH Solution: 20 ml sufficient for one egg preparation

Add 4 ml bleach, 1 ml 10 N NaOH, 5 ml H2O, and 10 ml M9 buffer to a 50 ml polypropylene conical tube. Make immediately before use.

Nile red stock solution

Add 50 ml 100% Acetone to 25 mg Nile red powder. Mix well and store at room temperature in light-tight parafilmed container. Can be stored for months in this manner.

Nile red staining solution: for 500 ml, sufficient for staining 30 x 96-well plates

Add 3 ml Nile red stock solution to 500 ml 40% v/v isopropanol. Store at room temperature in foil-wrapped glass bottle. Prepare immediately before use.

Phospholipid Standard

Weigh 7.6 mg phospholipid standard, 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol), in a glass beaker. Dissolve in 20 ml 2:1 chloroform:methanol (25 nanomoles per 50 μl). Keep covered with aluminum foil until use. Standard can also be kept at -80 °C in an airtight glass vial with phenolic cap for 1 year.

Triglyceride Standard

Weigh 6.8 mg triglyceride standard, tritridecanoin, into a glass beaker. Dissolve in 30 ml 2:1 chloroform:methanol (16.7 nanomoles per 50 μl). Keep covered with aluminum foil until use. Standard can also be kept at -80 °C in an airtight glass vial with phenolic cap for 1 year.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, S. O., Trimble, R., Guo, F., Mak, H. Y. Lipid droplets as ubiquitous fat storage organelles in C. elegans. BMC Cell. 11, 96 (2010).
  2. Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nature Reviews. Drug Discovery. 5, 387-398 (2006).
  3. Leung, M. C., et al. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Sciences: An Official. Journal of the Society of Toxicology. 106, 5-28 (2008).
  4. Ashrafi, K., et al. Genome-wide RNAi analysis of Caenorhabditis elegans fat regulatory genes. Nature. 421, 268-272 (2003).
  5. Arda, H. E., et al. Functional modularity of nuclear hormone receptors in a Caenorhabditis elegans metabolic gene regulatory network. Mol. Syst. Biol. 6, 367 (2010).
  6. Mak, H. Y., Nelson, L. S., Basson, M., Johnson, C. D., Ruvkun, G. Polygenic control of Caenorhabditis elegans fat storage. Nature Genetics. 38, 363-368 (2006).
  7. Wang, M. C., O'Rourke, E. J., Ruvkun, G. Fat metabolism links germline stem cells and longevity in C. elegans. Science. 322, 957-960 (2008).
  8. O'Rourke, E. J., Soukas, A. A., Carr, C. E., Ruvkun, G. C. elegans major fats are stored in vesicles distinct from lysosome-related organelles. Cell Metab. 10, 430-435 (2009).
  9. Brooks, K. K., Liang, B., Watts, J. L. The influence of bacterial diet on fat storage in C. elegans. PLoS ONE. 4, e7545 (2009).
  10. Yen, K., et al. A comparative study of fat storage quantitation in nematode Caenorhabditis elegans using label and label-free methods. PLoS ONE. 5, (2010).
  11. Rabbitts, B. M., et al. glo-3, a novel Caenorhabditis elegans gene, is required for lysosome-related organelle biogenesis. Genetics. 180, 857-871 (2008).
  12. Kimura, K. D., Tissenbaum, H. A., Liu, Y., Ruvkun, G. daf-2, an insulin receptor-like gene that regulates longevity and diapause in Caenorhabditis elegans. Science. 277, 942-946 (1997).
  13. Soukas, A. A., Kane, E. A., Carr, C. E., Melo, J. A., Ruvkun, G. Rictor/TORC2 regulates fat metabolism, feeding, growth, and life span in Caenorhabditis elegans. Genes Dev. 23, 496-511 (2009).
  14. McKay, R. M., McKay, J. P., Avery, L., Graff, J. M. C elegans: a model for exploring the genetics of fat storage. Dev. Cell. 4, 131-142 (2003).
  15. Klapper, M., et al. Fluorescence-based fixative and vital staining of lipid droplets in Caenorhabditis elegans reveal fat stores using microscopy and flow cytometry approaches. J. Lipid Res. 52, 1281-1293 (2011).
  16. Hellerer, T., et al. Monitoring of lipid storage in Caenorhabditis elegans using coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 14658-14663 (2007).
  17. Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nat. Methods. 8, 135-138 (2011).
  18. Fowler, S. D., Greenspan, P. Application of Nile red, a fluorescent hydrophobic probe, for the detection of neutral lipid deposits in tissue sections: comparison with oil red. 33, 833-836 (1985).
  19. Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J. Cell Biol. 100, 965-973 (1985).
  20. Hope, I. L. C. elegans: A Practical Approach. Oxford University Press. New York. 304 (1999).
  21. Perez, C. L., Van Gilst, M. R. A 13C isotope labeling strategy reveals the influence of insulin signaling on lipogenesis in C. elegans. Cell Metab. 8, 266-274 (2008).
  22. Watts, J. L., Browse, J. Dietary manipulation implicates lipid signaling in the regulation of germ cell maintenance in C. elegans. Developmental Biology. 292, 381-392 (2006).
  23. Wang, T. J., et al. Metabolite profiles and the risk of developing diabetes. Nature medicine. 17, 448-453 (2011).
  24. Rhee, E. P., et al. Lipid profiling identifies a triacylglycerol signature of insulin resistance and improves diabetes prediction in humans. The Journal of Clinical Investigation. 121, 1402-1411 (2011).
  25. Lewis, G. D., et al. Metabolic signatures of exercise in human plasma. Science translational medicine. 2, 33-37 (2010).
  26. Rhee, E. P., et al. Metabolite profiling identifies markers of uremia. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 21, 1041-1051 (2010).
  27. Gerdt, S., Lochnit, G., Dennis, R. D., Geyer, R. Isolation and structural analysis of three neutral glycosphingolipids from a mixed population of Caenorhabditis elegans (Nematoda:Rhabditida). Glycobiology. 7, 265-275 (1997).
  28. Christie, W. W. Advances in Lipid Methodology - Two. Oily Press. 69-111 (1993).
  29. Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).
  30. Wahlby, C., et al. An image analysis toolbox for high-throughput C. elegans assays. Nat. Methods. (2012).
  31. Fowler, S. D., Brown, W. J., Warfel, J., Greenspan, P. Use of nile red for the rapid in situ quantitation of lipids on thin-layer chromatograms. J. Lipid Res. 28, 1225-1232 (1987).
  32. Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans. J. Vis. Exp. (60), e3448 (2012).
  33. Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains. J. Vis. Exp. (51), e2745 (2011).
  34. Comizio, R., et al. Total body lipid and triglyceride response to energy deficit: relevance to body composition models. The American journal of physiology. 274, E860-E866 (1998).
  35. Lee, R. F., Paffenhofer, G. A., Nevenzel, J. C., Benson, A. A. The metabolism of wax ters and other lipids by the marine copepod, Calanus helgolandicus. J. Lipid Res. 11, 237-240 (1970).
  36. Lee, S. S., et al. Requirement of PPARalpha in maintaining phospholipid and triacylglycerol homeostasis during energy deprivation. J. Lipid Res. 45, 2025-2037 (2004).
  37. Singer, S. J. A fluid lipid-globular protein mosaic model of membrane structure. Annals of the New York Academy of Sciences. 195, 16-23 (1972).
  38. Singer, S. J., Nicolson, G. L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 175, 720-731 (1972).
  39. Turkish, A. R., Sturley, S. L. The genetics of neutral lipid biosynthesis: an evolutionary perspective. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297, E19-E27 (2009).
Fat Kütle Biyokimyasal ve Yüksek Verimli Mikroskobik Değerlendirme<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pino, E. C., Webster, C. M., Carr, C. E., Soukas, A. A. Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans. J. Vis. Exp. (73), e50180, doi:10.3791/50180 (2013).More

Pino, E. C., Webster, C. M., Carr, C. E., Soukas, A. A. Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans. J. Vis. Exp. (73), e50180, doi:10.3791/50180 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter