Ændringer i lemmer muskel kontraktile og passive mekaniske egenskaber er vigtige biomarkører for muskelsygdomme. Dette håndskrift beskriver fysiologiske assays til at måle disse egenskaber i det murine extensor digitorum longus og tibialis anterior muskler.
Kropsbevægelser er hovedsageligt af mekanisk funktion af skeletmuskulatur. Skeletmuskel er sammensat af mange bundter af myofibre, som er omviklet med intramuskulære bindevæv. Hver myofiber indeholder mange myofibriller, der løber i længderetningen langs længden af myofiber. Myofibriller er det kontraktile apparat af muskler, og de er sammensat af gentagne kontraktile enheder kaldet sarkomerer. En sarkomer enhed indeholder actin og myosin filamenter, der er fordelt som Z skiver og titin protein. Mekaniske funktion af skeletmuskel er defineret af de kontraktile og passive egenskaber af musklen. De kontraktile egenskaber anvendes til at karakterisere mængden af kraft, der frembringes under muskelsammentrækning, når styrkeopbygningsproces og tidspunkt for muskelafslapning. Enhver faktor, der påvirker muskelkontraktion (f.eks interaktion mellem actin og myosin filamenter, homeostase af calcium, ATP / ADP-forhold osv.) påvirker den kontraktile properties. De passive egenskaber henviser til de elastiske og viskøse egenskaber (stivhed og viskositet) af musklen i fravær af kontraktion. Disse egenskaber bestemmes ved den ekstracellulære og intracellulære strukturelle komponenter (såsom titin) og bindevæv (primært collagen) 1-2. De kontraktile og passive egenskaber er to uadskillelige aspekter af muskelfunktion. For eksempel er albue fleksion opnået ved sammentrækning af muskler i den forreste rum af overarmen og passiv strækning af musklerne i det posteriore kammer på overarmen. For virkelig at forstå muskelfunktionen, bør begge kontraktile og passive egenskaber undersøges.
En sammentrækning og / eller passive mekaniske egenskaber af muskel er ofte kompromitteret i muskelsygdomme. Et godt eksempel er Duchennes muskeldystrofi (DMD), en alvorlig muskelsvind sygdom forårsaget af dystrophin deficiency 3. Dystrofin er et cytoskelet-proteidet stabiliserer musklen cellemembranen (sarcolemma) under muskelsammentrækning 4. I fravær af dystrofin er sarcolemma beskadiget af forskydningskraft dannet under kraftoverføring. Denne membran rive initierer en kædereaktion, der fører til muskel celledød og tab af kontraktile maskiner. Som følge heraf er muskelkraft reduceres og døde myofibre erstattes af fibrotiske væv 5. Denne senere ændring øger muskelstivhed 6. Nøjagtig måling af disse ændringer tilvejebringer vigtig rettesnor at evaluere sygdommen og til at bestemme den terapeutiske virkning af hidtil ukendt gen / celle / farmakologiske indgreb. Her præsenteres to metoder til at evaluere både kontraktile og passive mekaniske egenskaber af extensor digitorum longus (EDL) muskel og de kontraktile egenskaber tibialis anterior (TA) muskel.
I denne protokol, har vi illustreret fysiologiske assays til måling af kontraktile og passive egenskaber EDL muskler og de kontraktile egenskaber TA musklen. Et stort problem i muskelfysiologi studier er iltning af målet muskel. For store muskler (såsom TA muskel), er in situ fremgangsmåde foretrækkes, fordi oxygendiffusion fra Ringers puffer ikke kan nå midten af musklen i et in vitro assay. In situ metode ikke forstyrrer normal blodforsyning og hypoksi-associeret kunstige effekter undgås. EDL muskel er en af de mest almindeligt anvendte muskel i fysiologi undersøgelse. Tilstrækkelig iltning af hele musklen kan opnås i et in vitro-system på grund af den lille størrelse af musklen. Yderligere er in vitro-system tilvejebringer et lukket miljø at manipulere koncentrationen af ioner (Ca 2 +, Na + og K +) og Chemikalier (ATP og glucose), der er nødvendige for optimal muskelkraft generation. Dette giver en stor mulighed for at undersøge virkningen af disse variabler på magt produktion.
Nøjagtig måling af de kontraktile og passive egenskaber af led musklen er kritisk at undersøge skeletalmuskelfunktion. Karakteristiske ændringer af disse egenskaber er ofte betragtes som kendetegnende for forskellige muskelsygdomme. Ændringer i disse parametre er også vigtige indikatorer for at afgøre, om en eksperimentel behandling er effektiv eller ej.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (AR-49.419, DD), Muskelsvindfonden Association (DD), og NIH træning tilskud T90DK70105 (CH).
Material | Manufacturer | Specifications and comments | |
Tissue-organ bath | Radnoti LLC, CA, USA | Water-jacket tissue bath (Cat #158351-LL), Oxygen disperser tube (Cat #160192), Luer valve (Cat#120722) | |
Circulating water bath | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | ||
Gas mix | Airgas National, Charlotte, NC, USA | 95% O2 and 5% CO2 | |
In vitro muscle function assay apparatus | Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada | The system consists of a stimulator (Model# 701A), a dual-mode lever system (Model#300C or 305C), a signal interface (Model # 604B) and a test apparatus (Model# 800A) to vertically mount tissue organ bath | |
In vitro muscle function assay software | Dynamic muscle control (DMC) software and dynamic muscle control data analysis (DMA) software | ||
Mouse anesthesia cocktail mixed in 0.9% NaCl | Refer to the institutional guidelines | Ketamine (25 mg/ml), xylazine (2.5 mg/ml) and acepromazine (0.5 mg/ml). Throughout the surgical procedure, a supplement of 10 % of the initial dose may be needed to keep animal under anesthesia. | |
Sylgard | World Precision Instrument | Cat#SYLG184 | |
A custom-made Plexiglas dissection board | In house designed | Refer to Figure 1 | |
Heating lamp | Tensor Lighting Company, Boston, MA, USA | 15 Watt lamp to keep the mouse warm during dissection | |
Ringer’s Buffer | Chemicals are purchased from Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Composition in mM: 1.2 NaH2PO4 (Cat#S369) , 1 MgSO4 (Cat# M63), 4.83 KCl (Cat# P217), 137 NaCl (Cat# 217), 24 NaHCO3 (Cat# S233), 2 CaCl2 (Cat #C79) and 10 glucose (Cat# D16). Dissolve chemicals individually and mix in the order listed above. Store at 4 °C. | |
Stereo dissecting microscope | Nikon, Melville, NY, USA | ||
Dissection tools | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | Coarse forceps, coarse scissors, fine forceps (Straight and 45 ° angle) | |
Braided silk suture #4-0 | SofSilk USSC Sutures, Norwalk, CT, USA | Cat # SP116 | |
A custom-made stainless steel hook | Small Parts, Inc. | 2” long S/S 304V (0.18” diameter) for force transducer 305C or 2.5” long S/S 304V (0.012” diameter) for transducer 300C (Cat# ASTM A313) | |
In situ muscle function assay system | Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada | The system (809B, in situ mouse apparatus) consist of a stimulator (Model# 701B), a dual-mode lever system (Model# 305C), a signal interface (Model# 604A) and a thermo controlled footplate apparatus (Model# 809A) | |
In vitro muscle function assay software | Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada | Dynamic muscle control (DMC) software and dynamic muscle control data analysis (DMA) software | |
A custom-made TA assay animal platform | In house designed | Refer to Figure 2 | |
A custom-made stainless steel hook | Small Parts, Inc. | Cat# ASTM A313 | 0.5” long S/S 304V (0.18” diameter) |
Custom-made 25G platinum electrodes | Chalgren Enterprises, Gilroy,CA | Solder two 0.016” thick platinum wires to two 24G electric wires |
Table 1. Materials and equipment.