手足の筋肉の収縮とパッシブの機械的性質の変化は筋肉の疾患のための重要なバイオマーカーである。本稿では、ネズミ伸digitorum長指と前脛骨筋、これらの特性を測定するための生理的なアッセイを記載。
身体の動きは、主に骨格筋の機械的機能によって提供されています。骨格筋は、筋肉内結合組織で覆われて筋繊維の多数の束で構成されています。それぞれの筋線維は、筋線維の長さに沿って長手方向に実行する多くの筋原繊維を含んでいます。筋原線維は、筋肉の収縮装置であり、それらはサルコメアとして知ら繰り返し収縮単位で構成されています。サルコメア単位は、Zディスクやタイチン蛋白質の間隔があけられるアクチンとミオシンフィラメントが含まれています。骨格筋の機械的機能は、筋肉の収縮と受動特性によって定義されます。収縮特性は、筋収縮、筋弛緩の力発生と時間の時に生成される力の量を特徴付けるために使用されています。筋収縮(例えば、アクチンとミオシンフィラメントの間の相互作用として、カルシウム、ATP / ADP比などの恒常性)に影響を与えるすべての要因は、収縮propeに影響を与えるrties。受動的な特性は収縮の非存在下での筋肉の弾性と粘性特性(剛性と粘度)を参照してください。これらのプロパティは、細胞外および細胞内の構造部品(例えばタイチンなど)と結合組織(主にコラーゲン)1-2によって決定されます。収縮とパッシブ特性は筋機能の2切り離せない側面である。例えば、肘屈曲は上腕の後部コンパートメントの筋肉の上腕と受動的な伸張の前方コンパートメントの筋肉の収縮によって達成されます。本当に筋肉の機能を理解するために、両方の収縮とパッシブ特性を検討すべきである。
筋肉の収縮および/または受動機械的性質は、多くの場合、筋疾患で侵害されています。良い例は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)、ジストロフィン欠損3によって引き起こされる疾患を無駄にして重度の筋肉です。ジストロフィンは細胞骨格proteですという点で、筋収縮中に4筋細胞膜(鞘)を安定させます。ジストロフィンが存在しない場合には、筋鞘は力伝達の間に生成せん断力によって損傷されています。引き裂くこの膜は、筋肉の細胞死と収縮機械の損失につながる連鎖反応を開始します。その結果、筋肉の力が低減されると死んで筋線維は線維組織5に置き換えられます。この後の変化は筋肉のこわばり6が増加します 。これらの変化の正確な測定は、疾患の進行を評価し、新規遺伝子/細胞/薬理学的介入の治療効果を決定するために重要な指針を提供しています。ここでは、長趾伸筋(EDL)と前脛骨筋(TA)の筋肉の収縮特性の収縮とパッシブの両方の機械的特性を評価するための2つの方法を提示します。
このプロトコルでは、収縮および受動的性質のEDLの筋肉とTA筋の収縮特性を測定するための生理的なアッセイを説明しました。筋肉生理学研究における主要な関心事は、ターゲットの筋肉の酸素です。大きな筋肉(例えばTAの筋肉など)の場合は、 その場でのアプローチでリンゲルバッファからの酸素拡散がin vitroアッセイの筋肉の中心に到達しない可能性があるため好ましい。 現場のアプローチでは 、通常の血液供給と低酸素関連の邪魔にならない人工的な影響は避けられる。 EDLの筋肉は生理学の研究の中で最も一般的に使用される筋肉の一つです。筋肉全体の十分な酸素が あるため、筋肉の小さなサイズのin vitro系で達成することができる。さらに、in vitro系でのイオンの濃度を操作するための密閉環境(のCa 2 +、Na +とK +)を提供し、化学最適な筋肉の力発生のために必要されているCAL(ATPとグルコース)。これは力の生産上のこれらの変数の影響を検討する絶好の機会を提供しています。
手足の筋肉の収縮とパッシブ特性の正確な測定は、骨格筋の機能を研究することが重要です。これらのプロパティの特徴的な変化は、多くの場合、様々な筋疾患の特徴であるとみなされます。これらのパラメータの変化は、実験的治療が有効であるか否かを判断することも重要な指標です。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、米国国立衛生研究所(AR-49419、DD)は、筋ジストロフィー協会(DD)とNIH訓練助成T90DK70105(CH)からの補助金によって支えられている。
Material | Manufacturer | Specifications and comments | |
Tissue-organ bath | Radnoti LLC, CA, USA | Water-jacket tissue bath (Cat #158351-LL), Oxygen disperser tube (Cat #160192), Luer valve (Cat#120722) | |
Circulating water bath | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | ||
Gas mix | Airgas National, Charlotte, NC, USA | 95% O2 and 5% CO2 | |
In vitro muscle function assay apparatus | Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada | The system consists of a stimulator (Model# 701A), a dual-mode lever system (Model#300C or 305C), a signal interface (Model # 604B) and a test apparatus (Model# 800A) to vertically mount tissue organ bath | |
In vitro muscle function assay software | Dynamic muscle control (DMC) software and dynamic muscle control data analysis (DMA) software | ||
Mouse anesthesia cocktail mixed in 0.9% NaCl | Refer to the institutional guidelines | Ketamine (25 mg/ml), xylazine (2.5 mg/ml) and acepromazine (0.5 mg/ml). Throughout the surgical procedure, a supplement of 10 % of the initial dose may be needed to keep animal under anesthesia. | |
Sylgard | World Precision Instrument | Cat#SYLG184 | |
A custom-made Plexiglas dissection board | In house designed | Refer to Figure 1 | |
Heating lamp | Tensor Lighting Company, Boston, MA, USA | 15 Watt lamp to keep the mouse warm during dissection | |
Ringer’s Buffer | Chemicals are purchased from Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Composition in mM: 1.2 NaH2PO4 (Cat#S369) , 1 MgSO4 (Cat# M63), 4.83 KCl (Cat# P217), 137 NaCl (Cat# 217), 24 NaHCO3 (Cat# S233), 2 CaCl2 (Cat #C79) and 10 glucose (Cat# D16). Dissolve chemicals individually and mix in the order listed above. Store at 4 °C. | |
Stereo dissecting microscope | Nikon, Melville, NY, USA | ||
Dissection tools | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | Coarse forceps, coarse scissors, fine forceps (Straight and 45 ° angle) | |
Braided silk suture #4-0 | SofSilk USSC Sutures, Norwalk, CT, USA | Cat # SP116 | |
A custom-made stainless steel hook | Small Parts, Inc. | 2” long S/S 304V (0.18” diameter) for force transducer 305C or 2.5” long S/S 304V (0.012” diameter) for transducer 300C (Cat# ASTM A313) | |
In situ muscle function assay system | Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada | The system (809B, in situ mouse apparatus) consist of a stimulator (Model# 701B), a dual-mode lever system (Model# 305C), a signal interface (Model# 604A) and a thermo controlled footplate apparatus (Model# 809A) | |
In vitro muscle function assay software | Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada | Dynamic muscle control (DMC) software and dynamic muscle control data analysis (DMA) software | |
A custom-made TA assay animal platform | In house designed | Refer to Figure 2 | |
A custom-made stainless steel hook | Small Parts, Inc. | Cat# ASTM A313 | 0.5” long S/S 304V (0.18” diameter) |
Custom-made 25G platinum electrodes | Chalgren Enterprises, Gilroy,CA | Solder two 0.016” thick platinum wires to two 24G electric wires |
Table 1. Materials and equipment.