Endringer i lem muskel kontraktile og passiv mekaniske egenskaper er viktige biomarkører for muskelsykdommer. Dette manuskriptet beskriver fysiologiske analyser for å måle disse egenskapene i murine extensor digitorum longus og tibialis fremre muskler.
Kroppsbevegelser er hovedsakelig levert av mekanisk funksjon av skjelettmuskulatur. Skjelettmuskulatur består av mange bunter av myofibers som er skjermet av intramuskulære bindevev. Hver myofiber inneholder mange myofibrils som kjører lengderetningen langs lengden av myofiber. Myofibrils er kontraktile apparatet av muskel og de er sammensatt av gjentatte kontraktile enheter kjent som sarcomeres. En sarcomere enheten inneholder aktin og myosin filamenter som fordeles av Z plater og titin protein. Mekanisk funksjon av skjelettmuskulatur defineres av kontraktile og passive egenskaper muskel. Kontraktile egenskaper blir brukt til å karakterisere mengden av kraft som genereres under muskelkontraksjon, tid av makt generasjon og tidspunkt for muskelavslapping. En annen faktor som påvirker muskel sammentrekning (som samspill mellom aktin og myosin filamenter, homeostasis av kalsium, ATP / ADP ratio, etc.) påvirker kontraktile properties. De passive egenskaper refererer til de elastiske og viskøse egenskaper (stivhet og viskositet) av muskelen i fravær av sammentrekning. Disse egenskapene bestemmes av ekstracellulære og intracellulære strukturelle komponenter (for eksempel titin) og bindevev (hovedsakelig kollagen) 1-2. Kontraktile og passive egenskaper er to uatskillelige aspekter muskelfunksjon. For eksempel, er albue fleksjon oppnås ved sammentrekning av musklene i fremre kammer av den øvre arm og passiv strekning av muskler i bakre kammer av den øvre armen. For virkelig å forstå muskelfunksjon, bør begge kontraktile og passive egenskaper bli studert.
Kontraktile og / eller passive mekaniske egenskaper av muskel er ofte utsatt i muskelsykdommer. Et godt eksempel er Duchenne muskeldystrofi (DMD), en alvorlig muskelsvinn sykdom forårsaket av dystrophin mangel tre. Dystrophin er en cytoskeletal protei som stabiliserer muskel cellemembranen (sarcolemma) under muskel sammentrekning 4. I fravær av dystrophin blir sarcolemma skadet av skjærkraft generert under kraftoverføring. Denne membranen rive starter en kjedereaksjon som fører til muskel celledød og tap av kontraktile maskineri. Som en konsekvens, er muskel kraft reduseres og døde myofibers erstattes av fibrotiske vev 5. Dette senere endringen øker muskelstivhet 6. Nøyaktig måling av disse endringene gir viktige guide til å vurdere sykdomsutvikling og for å bestemme terapeutisk effekt av romanen genet / celle / farmakologiske tiltak. Her presenterer vi to metoder for å evaluere både kontraktile og passiv mekaniske egenskaper extensor digitorum longus (EDL) muskel og kontraktile egenskaper tibialis anterior (TA) muskel.
I denne protokollen, har vi illustrert fysiologiske analyser for å måle kontraktile og passive egenskaper EDL muskel og kontraktile egenskaper med muskelen. En stor bekymring i muskelfysiologi studier er oksygenopptaket i mål muskel. For store muskler (eksempel med muskelen) er in situ tilnærmingen foretrekkes fordi oksygendiffusjon fra Ringers buffer ikke kan nå midten av muskelen i en in vitro-analysen. In situ tilnærming ikke forstyrrer normal blodtilførsel og hypoksi-assosiert kunstige effekter unngås. EDL muskelen er en av de mest brukte muskler i fysiologi studie. Tilstrekkelig oksygenering av hele muskelen kan oppnås i en in vitro-system på grunn av den lille størrelsen av muskelen. Videre gir in vitro-system et lukket miljø å manipulere konsentrasjonen av ioner (Ca2 +, Na + og K +) og kjekalier (ATP og glukose) som er nødvendig for optimal muskel kraft generasjon. Dette gir en flott mulighet til å studere effekten av disse variablene på kraft produksjon.
Nøyaktig måling av de kontraktile og passive egenskaper lem muskelen er kritisk å studere skjelettmuskelfunksjon. Karakteristiske forandringer av disse egenskapene er ofte betraktet som kjennetegner ulike muskelsykdommer. Endringer i disse parameterne er også viktige indikatorer for å avgjøre om en eksperimentell terapi er effektiv eller ikke.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Institutes of Health (AR-49419, DD), muskeldystrofi Association (DD), og NIH trening stipend T90DK70105 (CH).
Material | Manufacturer | Specifications and comments | |
Tissue-organ bath | Radnoti LLC, CA, USA | Water-jacket tissue bath (Cat #158351-LL), Oxygen disperser tube (Cat #160192), Luer valve (Cat#120722) | |
Circulating water bath | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | ||
Gas mix | Airgas National, Charlotte, NC, USA | 95% O2 and 5% CO2 | |
In vitro muscle function assay apparatus | Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada | The system consists of a stimulator (Model# 701A), a dual-mode lever system (Model#300C or 305C), a signal interface (Model # 604B) and a test apparatus (Model# 800A) to vertically mount tissue organ bath | |
In vitro muscle function assay software | Dynamic muscle control (DMC) software and dynamic muscle control data analysis (DMA) software | ||
Mouse anesthesia cocktail mixed in 0.9% NaCl | Refer to the institutional guidelines | Ketamine (25 mg/ml), xylazine (2.5 mg/ml) and acepromazine (0.5 mg/ml). Throughout the surgical procedure, a supplement of 10 % of the initial dose may be needed to keep animal under anesthesia. | |
Sylgard | World Precision Instrument | Cat#SYLG184 | |
A custom-made Plexiglas dissection board | In house designed | Refer to Figure 1 | |
Heating lamp | Tensor Lighting Company, Boston, MA, USA | 15 Watt lamp to keep the mouse warm during dissection | |
Ringer’s Buffer | Chemicals are purchased from Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Composition in mM: 1.2 NaH2PO4 (Cat#S369) , 1 MgSO4 (Cat# M63), 4.83 KCl (Cat# P217), 137 NaCl (Cat# 217), 24 NaHCO3 (Cat# S233), 2 CaCl2 (Cat #C79) and 10 glucose (Cat# D16). Dissolve chemicals individually and mix in the order listed above. Store at 4 °C. | |
Stereo dissecting microscope | Nikon, Melville, NY, USA | ||
Dissection tools | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | Coarse forceps, coarse scissors, fine forceps (Straight and 45 ° angle) | |
Braided silk suture #4-0 | SofSilk USSC Sutures, Norwalk, CT, USA | Cat # SP116 | |
A custom-made stainless steel hook | Small Parts, Inc. | 2” long S/S 304V (0.18” diameter) for force transducer 305C or 2.5” long S/S 304V (0.012” diameter) for transducer 300C (Cat# ASTM A313) | |
In situ muscle function assay system | Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada | The system (809B, in situ mouse apparatus) consist of a stimulator (Model# 701B), a dual-mode lever system (Model# 305C), a signal interface (Model# 604A) and a thermo controlled footplate apparatus (Model# 809A) | |
In vitro muscle function assay software | Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada | Dynamic muscle control (DMC) software and dynamic muscle control data analysis (DMA) software | |
A custom-made TA assay animal platform | In house designed | Refer to Figure 2 | |
A custom-made stainless steel hook | Small Parts, Inc. | Cat# ASTM A313 | 0.5” long S/S 304V (0.18” diameter) |
Custom-made 25G platinum electrodes | Chalgren Enterprises, Gilroy,CA | Solder two 0.016” thick platinum wires to two 24G electric wires |
Table 1. Materials and equipment.