Mudanças nos membros musculares contráteis e passiva propriedades mecânicas são biomarcadores importantes para doenças musculares. Este manuscrito descreve ensaios fisiológicos para medir estas propriedades no longus murino extensores dos dedos e tibial anterior.
Os movimentos do corpo são fornecidos principalmente por função mecânica do músculo esquelético. O músculo esquelético é composta de feixes de numerosos miofibras que são revestidos por tecidos conjuntivos intramusculares. Cada fibra muscular contém muitas miofibrilas que correm longitudinalmente ao longo do comprimento da fibra muscular. Miofibrilas são o aparato contrátil do músculo e que são compostos de unidades repetidas contrácteis conhecidos como sarcômeros. Uma unidade sarcômero contém filamentos de actina e miosina que estão espaçados pelos discos Z e proteína titina. A função mecânica do músculo esquelético é definido pelas propriedades contrácteis e passiva do músculo. As propriedades contrácteis são utilizadas para caracterizar a quantidade de força gerada durante a contracção do músculo, o tempo de geração de força e do tempo de relaxamento muscular. Qualquer fator que afeta a contração muscular (como a interação entre filamentos de actina e miosina, homeostase do cálcio, ATP / ADP relação, etc) influencia a prope contrátilrties. As propriedades passivas referem-se às propriedades elásticas e viscosas (rigidez e viscosidade) do músculo, na ausência de contracção. Estas propriedades são determinadas pela extracelular e os componentes estruturais intracelulares (tais como titina) e tecido conjuntivo (principalmente colagénio) 1-2. As propriedades contráteis e passiva são dois aspectos inseparáveis da função muscular. Por exemplo, a flexão do cotovelo é conseguida pela contracção dos músculos do compartimento anterior do braço superior e estiramento passivo dos músculos no compartimento posterior da parte superior do braço. Para compreender verdadeiramente a função muscular, ambas as propriedades contráteis e passiva deve ser estudado.
As propriedades contráteis e / ou passiva mecânicas do músculo são muitas vezes comprometida em doenças musculares. Um bom exemplo é distrofia muscular de Duchenne (DMD), um músculo desperdiçando grave doença causada por deficiência de distrofina 3. Distrofina é uma prote cytoskeletalna medida em que estabiliza a membrana celular do músculo (sarcolema) durante 4 contracção muscular. Na ausência de distrofina, o sarcolema é danificado pela força de corte geradas durante a transmissão da força. Esta membrana rasgando inicia uma reacção em cadeia que leva à morte da célula muscular e perda de maquinaria contráctil. Como consequência, a força muscular é reduzida e miofibras mortas são substituídos pelos tecidos fibróticos 5. Esta alteração posterior aumenta rigidez muscular 6. A medição precisa destas mudanças fornece guia importante para avaliar a progressão da doença e para determinar a eficácia terapêutica do novo gene / célula / intervenções farmacológicas. Aqui, apresentamos dois métodos para avaliar as propriedades contráteis e passiva mecânicas do extensor longo dos dedos (EDL) muscular e as propriedades contráteis do músculo tibial anterior (TA).
Neste protocolo, que ilustramos ensaios fisiológicos para medir as propriedades contráteis e passiva músculo EDL e as propriedades contráteis do músculo TA. Uma grande preocupação em estudos de fisiologia do músculo é a oxigenação do músculo alvo. Para grandes músculos (tais como o músculo TA), o na abordagem in situ é a preferida porque a difusão de oxigénio a partir de tampão de Ringer não pode atingir o centro do músculo em um ensaio in vitro. Na abordagem situ não perturbe suprimento de sangue normal e hipóxia associada efeitos artificiais são evitados. O músculo EDL é um dos músculos mais comumente utilizado no estudo da fisiologia. Oxigenação adequada do músculo inteiro pode ser conseguida em um sistema in vitro devido à pequena dimensão do músculo. Além disso, o sistema in vitro fornece um ambiente fechado para manipular a concentração de iões (Ca 2 +, Na + e K +) e chemicals (ATP e glicose), que são necessárias para a produção óptima força muscular. Isto oferece uma grande oportunidade para estudar o efeito dessas variáveis na produção de força.
Uma medição precisa das propriedades contrácteis e passiva do músculo do membro é crítica para estudar a função do músculo esquelético. Alterações características dessas propriedades são muitas vezes consideradas como as características de várias doenças musculares. As mudanças nestes parâmetros também são indicadores importantes para determinar se uma terapia experimental é eficaz ou não.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde (AR-49419, DD), Associação de Distrofia Muscular (DD), e treinamento NIH concessão T90DK70105 (CH).
Material | Manufacturer | Specifications and comments | |
Tissue-organ bath | Radnoti LLC, CA, USA | Water-jacket tissue bath (Cat #158351-LL), Oxygen disperser tube (Cat #160192), Luer valve (Cat#120722) | |
Circulating water bath | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | ||
Gas mix | Airgas National, Charlotte, NC, USA | 95% O2 and 5% CO2 | |
In vitro muscle function assay apparatus | Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada | The system consists of a stimulator (Model# 701A), a dual-mode lever system (Model#300C or 305C), a signal interface (Model # 604B) and a test apparatus (Model# 800A) to vertically mount tissue organ bath | |
In vitro muscle function assay software | Dynamic muscle control (DMC) software and dynamic muscle control data analysis (DMA) software | ||
Mouse anesthesia cocktail mixed in 0.9% NaCl | Refer to the institutional guidelines | Ketamine (25 mg/ml), xylazine (2.5 mg/ml) and acepromazine (0.5 mg/ml). Throughout the surgical procedure, a supplement of 10 % of the initial dose may be needed to keep animal under anesthesia. | |
Sylgard | World Precision Instrument | Cat#SYLG184 | |
A custom-made Plexiglas dissection board | In house designed | Refer to Figure 1 | |
Heating lamp | Tensor Lighting Company, Boston, MA, USA | 15 Watt lamp to keep the mouse warm during dissection | |
Ringer’s Buffer | Chemicals are purchased from Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Composition in mM: 1.2 NaH2PO4 (Cat#S369) , 1 MgSO4 (Cat# M63), 4.83 KCl (Cat# P217), 137 NaCl (Cat# 217), 24 NaHCO3 (Cat# S233), 2 CaCl2 (Cat #C79) and 10 glucose (Cat# D16). Dissolve chemicals individually and mix in the order listed above. Store at 4 °C. | |
Stereo dissecting microscope | Nikon, Melville, NY, USA | ||
Dissection tools | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | Coarse forceps, coarse scissors, fine forceps (Straight and 45 ° angle) | |
Braided silk suture #4-0 | SofSilk USSC Sutures, Norwalk, CT, USA | Cat # SP116 | |
A custom-made stainless steel hook | Small Parts, Inc. | 2” long S/S 304V (0.18” diameter) for force transducer 305C or 2.5” long S/S 304V (0.012” diameter) for transducer 300C (Cat# ASTM A313) | |
In situ muscle function assay system | Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada | The system (809B, in situ mouse apparatus) consist of a stimulator (Model# 701B), a dual-mode lever system (Model# 305C), a signal interface (Model# 604A) and a thermo controlled footplate apparatus (Model# 809A) | |
In vitro muscle function assay software | Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada | Dynamic muscle control (DMC) software and dynamic muscle control data analysis (DMA) software | |
A custom-made TA assay animal platform | In house designed | Refer to Figure 2 | |
A custom-made stainless steel hook | Small Parts, Inc. | Cat# ASTM A313 | 0.5” long S/S 304V (0.18” diameter) |
Custom-made 25G platinum electrodes | Chalgren Enterprises, Gilroy,CA | Solder two 0.016” thick platinum wires to two 24G electric wires |
Table 1. Materials and equipment.