Los cambios en las extremidades mecánicas propiedades contráctiles del músculo y pasiva son importantes biomarcadores para enfermedades musculares. Este manuscrito describe ensayos fisiológicos para medir estas propiedades en el extensor largo común de los dedos y tibial murino músculos anteriores.
Los movimientos del cuerpo es el principal proveedor de la función mecánica del músculo esquelético. El músculo esquelético se compone de numerosos haces de fibras musculares que están enfundadas por intramusculares tejidos conectivos. Cada miofibra contiene muchas miofibrillas que corren longitudinalmente a lo largo de la longitud de la miofibras. Las miofibrillas son el aparato contráctil de los músculos y que se componen de unidades repetidas contráctiles conocidas como sarcómeros. Una unidad del sarcómero contiene los filamentos de actina y miosina que están espaciados por los discos Z y la proteína titina. Función mecánica del músculo esquelético se define por las propiedades contráctiles y pasiva del músculo. Las propiedades contráctiles se utilizan para caracterizar la cantidad de fuerza generada durante la contracción muscular, el tiempo de generación de la fuerza y el tiempo de relajación muscular. Cualquier factor que afecta la contracción muscular (por ejemplo, la interacción entre filamentos de actina y miosina, la homeostasis de calcio, ATP / ADP ratio, etc) influye en la prope contráctilrties. Las propiedades pasivas se refieren a las propiedades elásticas y viscosas (rigidez y viscosidad) del músculo en ausencia de contracción. Estas propiedades se determinan por el extracelular y los componentes estructurales intracelulares (tales como titin) y los tejidos conectivos (principalmente colágeno) 1-2. Las propiedades contráctiles y pasiva son dos aspectos inseparables de la función muscular. Por ejemplo, la flexión del codo se lleva a cabo por la contracción de los músculos en el compartimiento anterior de la parte superior del brazo y estiramiento pasivo de los músculos en el compartimento posterior de la parte superior del brazo. Para comprender verdaderamente la función muscular, ambas propiedades contráctiles y pasivo deben ser estudiados.
Las propiedades mecánicas contráctiles y / o pasiva de los músculos se ven comprometidas en enfermedades musculares. Un buen ejemplo es la distrofia muscular de Duchenne (DMD), una enfermedad degenerativa muscular severa causada por la deficiencia de distrofina 3. La distrofina es una prote citoesqueletoen que estabiliza la membrana celular del músculo (sarcolema) durante 4 contracción muscular. En la ausencia de distrofina, el sarcolema es dañado por la fuerza de cizalla generada durante la transmisión de la fuerza. Esta membrana desgarro inicia una reacción en cadena que conduce a la muerte de la célula muscular y la pérdida de la maquinaria contráctil. Como consecuencia, la fuerza muscular se reduce y miofibras muertos son reemplazados por tejidos fibróticos 5. Este cambio aumenta la rigidez muscular posterior 6. La medición exacta de estos cambios proporciona guía importante para evaluar la progresión de la enfermedad y para determinar la eficacia terapéutica de nuevo gen / célula / intervenciones farmacológicas. A continuación, se presentan dos métodos para evaluar las propiedades mecánicas contráctiles y pasivo del extensor largo de los dedos (EDL) y las propiedades contráctiles del músculo tibial anterior (TA) muscular.
En este protocolo, se han ilustrado ensayos fisiológicos para medir las propiedades contráctiles y pasiva del músculo EDL y las propiedades contráctiles del músculo TA. Una preocupación importante en los estudios de la fisiología del músculo es la oxigenación del músculo objetivo. Para los músculos grandes (tales como el músculo TA), el en el enfoque situ se prefiere debido a la difusión de oxígeno a partir de tampón de Ringer puede no alcanzar el centro del músculo en un ensayo in vitro. En enfoque situ no perturbe suministro normal de sangre y la hipoxia asociada- efectos artificiales se evitan. El músculo EDL es uno de los músculos más comúnmente utilizado en el estudio de la fisiología. Adecuada oxigenación del músculo entero se puede lograr en un sistema in vitro, debido al tamaño pequeño del músculo. Además, el sistema in vitro proporciona un entorno cerrado para manipular las concentraciones de iones Ca (2 +, Na + y K +) y químicoCALS (ATP y glucosa) que son necesarios para la generación óptima de la fuerza muscular. Esto ofrece una gran oportunidad para estudiar el efecto de estas variables en la producción de fuerza.
La medición exacta de las propiedades contráctiles y pasivo del músculo del miembro es fundamental para estudiar la función del músculo esquelético. Cambios característicos de estas propiedades a menudo se consideran como las características de varias enfermedades musculares. Los cambios en estos parámetros también son indicadores importantes para determinar si una terapia experimental es eficaz o no.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos Nacionales de Salud (AR-49419, DD), Asociación de Distrofia Muscular (DD) y NIH subsidio de capacitación T90DK70105 (CH).
Material | Manufacturer | Specifications and comments | |
Tissue-organ bath | Radnoti LLC, CA, USA | Water-jacket tissue bath (Cat #158351-LL), Oxygen disperser tube (Cat #160192), Luer valve (Cat#120722) | |
Circulating water bath | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | ||
Gas mix | Airgas National, Charlotte, NC, USA | 95% O2 and 5% CO2 | |
In vitro muscle function assay apparatus | Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada | The system consists of a stimulator (Model# 701A), a dual-mode lever system (Model#300C or 305C), a signal interface (Model # 604B) and a test apparatus (Model# 800A) to vertically mount tissue organ bath | |
In vitro muscle function assay software | Dynamic muscle control (DMC) software and dynamic muscle control data analysis (DMA) software | ||
Mouse anesthesia cocktail mixed in 0.9% NaCl | Refer to the institutional guidelines | Ketamine (25 mg/ml), xylazine (2.5 mg/ml) and acepromazine (0.5 mg/ml). Throughout the surgical procedure, a supplement of 10 % of the initial dose may be needed to keep animal under anesthesia. | |
Sylgard | World Precision Instrument | Cat#SYLG184 | |
A custom-made Plexiglas dissection board | In house designed | Refer to Figure 1 | |
Heating lamp | Tensor Lighting Company, Boston, MA, USA | 15 Watt lamp to keep the mouse warm during dissection | |
Ringer’s Buffer | Chemicals are purchased from Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Composition in mM: 1.2 NaH2PO4 (Cat#S369) , 1 MgSO4 (Cat# M63), 4.83 KCl (Cat# P217), 137 NaCl (Cat# 217), 24 NaHCO3 (Cat# S233), 2 CaCl2 (Cat #C79) and 10 glucose (Cat# D16). Dissolve chemicals individually and mix in the order listed above. Store at 4 °C. | |
Stereo dissecting microscope | Nikon, Melville, NY, USA | ||
Dissection tools | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | Coarse forceps, coarse scissors, fine forceps (Straight and 45 ° angle) | |
Braided silk suture #4-0 | SofSilk USSC Sutures, Norwalk, CT, USA | Cat # SP116 | |
A custom-made stainless steel hook | Small Parts, Inc. | 2” long S/S 304V (0.18” diameter) for force transducer 305C or 2.5” long S/S 304V (0.012” diameter) for transducer 300C (Cat# ASTM A313) | |
In situ muscle function assay system | Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada | The system (809B, in situ mouse apparatus) consist of a stimulator (Model# 701B), a dual-mode lever system (Model# 305C), a signal interface (Model# 604A) and a thermo controlled footplate apparatus (Model# 809A) | |
In vitro muscle function assay software | Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada | Dynamic muscle control (DMC) software and dynamic muscle control data analysis (DMA) software | |
A custom-made TA assay animal platform | In house designed | Refer to Figure 2 | |
A custom-made stainless steel hook | Small Parts, Inc. | Cat# ASTM A313 | 0.5” long S/S 304V (0.18” diameter) |
Custom-made 25G platinum electrodes | Chalgren Enterprises, Gilroy,CA | Solder two 0.016” thick platinum wires to two 24G electric wires |
Table 1. Materials and equipment.