Förändringar i sammandragande och passiv lem muskel mekaniska egenskaper är viktiga biomarkörer för muskelsjukdomar. Detta manuskript beskriver fysiologiska analyser för att mäta dessa egenskaper i den murina extensor digitorum longus och tibialis anterior muskler.
Kroppsrörelser är huvudsakligen av mekanisk funktion skelettmuskulaturen. Skelettmuskulatur består av flera buntar av myofibers som mantlade med intramuskulära bindväv. Varje myofiber innehåller många myofibriller som löper i längdriktningen utmed längden av myofiber. Myofibriller är den kontraktila apparaten i muskel och de består av upprepade kontraktila enheter som kallas sarkomerer. En sarcomere enhet innehåller aktin och myosin filament som är åtskilda av Z-skivor och titin protein. Mekanisk funktion av skelettmuskel definieras av de kontraktila och passiva egenskaper muskler. De kontraktila egenskaper används för att karakterisera mängden kraft som genereras under muskelkontraktion, tid för styrkebidrag och tid för muskelavslappning. Varje faktor som påverkar muskelsammandragning (såsom interaktion mellan aktin och myosin filament, homeostas av kalcium, ATP / ADP-förhållandet, etc.) påverkar kontraktila properties. De passiva egenskaperna avser de elastiska och viskösa egenskaper (styvhet och viskositet) av muskeln i frånvaro av kontraktion. Dessa egenskaper bestäms av den extracellulära och de intracellulära strukturella komponenterna (t.ex. titin) och bindväv (huvudsakligen kollagen) 1-2. De sammandragande och passiva egenskaper är två oskiljaktiga aspekter av muskelfunktion. Exempelvis armbåge flexion åstadkommes genom sammandragning av musklerna i den främre avdelningen av den övre armen och passiv sträckning av muskler i den bakre kammaren i överarmen. För att verkligen förstå muskelfunktion bör båda sammandragande och passiva egenskaper studeras.
De sammandragande och / eller passiva mekaniska egenskaper muskler ofta äventyras i muskelsjukdomar. Ett bra exempel är Duchennes muskeldystrofi (DMD), en allvarlig muskelförtvining sjukdom orsakad av dystrofin brist 3. Dystrofin är en cytoskelett protei som stabiliserar muskeln cellmembranet (sarcolemma) under muskelkontraktion 4. I frånvaro av dystrofin, är sarcolemma skadas av skjuvkraften genereras under kraftöverföring. Detta membran rivning initierar en kedjereaktion som leder till muskel celldöd och förlust av kontraktil maskiner. Som en konsekvens av detta muskel kraft minskas och döda myofibers ersätts av fibrotiska vävnader 5. Denna senare förändring ökar muskelstelhet 6. Noggrann mätning av dessa förändringar ger viktig vägledning för att bedöma sjukdomsförloppet och för att bestämma terapeutiska effekten av ny gen / cell / farmakologiska interventioner. Här presenterar vi två metoder för att utvärdera både kontraktila och passiva mekaniska egenskaper extensor digitorum longus (EDL) muskel och de kontraktila egenskaperna hos tibialis anterior (TA) muskel.
I detta protokoll, har vi illustrerat fysiologiska analyser för att mäta de kontraktila och passiva egenskaper EDL muskeln och de kontraktila egenskaperna hos TA-muskeln. Ett stort problem i muskelfysiologi studier är syresättning av den utvalda muskeln. För stora muskler (t.ex. TA muskeln) är på plats strategi att föredra eftersom syre diffusion från Ringers buffert inte kan nå mitten av muskeln i en in vitro-analys. In situ metod inte stör normal blodtillförsel och hypoxi-associerad konstgjorda effekter kan undvikas. EDL muskel är en av de mest använda muskel i fysiologi studie. Syresättning av hela muskeln kan uppnås i ett in vitro-system på grund av den lilla storleken av muskeln. Vidare tillhandahåller in vitro-system en sluten miljö för att manipulera koncentrationerna av joner (Ca 2 +, Na + och K +) och kemiskalier (ATP och glukos) som är nödvändiga för optimal muskel kraft generation. Detta ger en fantastisk möjlighet att studera effekten av dessa variabler på våld produktion.
Noggrann mätning av de kontraktila och passiva egenskaperna hos extremiteten muskeln är avgörande att studera skelettmuskler. Karakteristiska förändringar av dessa egenskaper anses ofta som kännetecken för olika muskelsjukdomar. Förändringar i dessa parametrar är också viktiga indikatorer för att avgöra om en experimentell terapi är effektiv eller inte.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats med bidrag från National Institutes of Health (AR-49.419, DD), muskeldystrofi Association (DD) och NIH utbildningsstipendium T90DK70105 (CH).
Material | Manufacturer | Specifications and comments | |
Tissue-organ bath | Radnoti LLC, CA, USA | Water-jacket tissue bath (Cat #158351-LL), Oxygen disperser tube (Cat #160192), Luer valve (Cat#120722) | |
Circulating water bath | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | ||
Gas mix | Airgas National, Charlotte, NC, USA | 95% O2 and 5% CO2 | |
In vitro muscle function assay apparatus | Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada | The system consists of a stimulator (Model# 701A), a dual-mode lever system (Model#300C or 305C), a signal interface (Model # 604B) and a test apparatus (Model# 800A) to vertically mount tissue organ bath | |
In vitro muscle function assay software | Dynamic muscle control (DMC) software and dynamic muscle control data analysis (DMA) software | ||
Mouse anesthesia cocktail mixed in 0.9% NaCl | Refer to the institutional guidelines | Ketamine (25 mg/ml), xylazine (2.5 mg/ml) and acepromazine (0.5 mg/ml). Throughout the surgical procedure, a supplement of 10 % of the initial dose may be needed to keep animal under anesthesia. | |
Sylgard | World Precision Instrument | Cat#SYLG184 | |
A custom-made Plexiglas dissection board | In house designed | Refer to Figure 1 | |
Heating lamp | Tensor Lighting Company, Boston, MA, USA | 15 Watt lamp to keep the mouse warm during dissection | |
Ringer’s Buffer | Chemicals are purchased from Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Composition in mM: 1.2 NaH2PO4 (Cat#S369) , 1 MgSO4 (Cat# M63), 4.83 KCl (Cat# P217), 137 NaCl (Cat# 217), 24 NaHCO3 (Cat# S233), 2 CaCl2 (Cat #C79) and 10 glucose (Cat# D16). Dissolve chemicals individually and mix in the order listed above. Store at 4 °C. | |
Stereo dissecting microscope | Nikon, Melville, NY, USA | ||
Dissection tools | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | Coarse forceps, coarse scissors, fine forceps (Straight and 45 ° angle) | |
Braided silk suture #4-0 | SofSilk USSC Sutures, Norwalk, CT, USA | Cat # SP116 | |
A custom-made stainless steel hook | Small Parts, Inc. | 2” long S/S 304V (0.18” diameter) for force transducer 305C or 2.5” long S/S 304V (0.012” diameter) for transducer 300C (Cat# ASTM A313) | |
In situ muscle function assay system | Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada | The system (809B, in situ mouse apparatus) consist of a stimulator (Model# 701B), a dual-mode lever system (Model# 305C), a signal interface (Model# 604A) and a thermo controlled footplate apparatus (Model# 809A) | |
In vitro muscle function assay software | Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada | Dynamic muscle control (DMC) software and dynamic muscle control data analysis (DMA) software | |
A custom-made TA assay animal platform | In house designed | Refer to Figure 2 | |
A custom-made stainless steel hook | Small Parts, Inc. | Cat# ASTM A313 | 0.5” long S/S 304V (0.18” diameter) |
Custom-made 25G platinum electrodes | Chalgren Enterprises, Gilroy,CA | Solder two 0.016” thick platinum wires to two 24G electric wires |
Table 1. Materials and equipment.