Summary
אנו מתארים שיטות למיקרוסקופיה וידאו חי מתא
Abstract
אישור Phagocytic של פתוגנים פטרייתי, ומיקרואורגניזמים אופן כללי יותר, עשוי להיחשב מורכב מארבעה שלבים ברורים: הגירה (ט) לphagocytes לאתר שבו נמצאים פתוגנים (ii) זיהוי תבניות מולקולריות הפתוגן הקשורים (PAMPs) באמצעות דפוס קולטנים הכרה (PRRs), (iii) בליעת מיקרואורגניזמים המאוגדים לקרום תא תא בלען ועיבודים (iv) של תאים שרויים בתוך phagosomes ועיכול של חלקיקי בלע התבגרות. מחקרים שהערכת phagocytosis בשלמותו הם אינפורמטיבי 1, 2, 3, 4, 5, אבל הם מוגבלים בכך שהם בדרך כלל לא לשבור את התהליך לתוך הגירה, בליעה והתבגרות phagosome, שעשוי להיות מושפעות באופן דיפרנציאלי. יתר על כן, מחקרים מסוג זה להעריך ספיגה כאירוע בודד, ולא כתהליך דינמי מתמשך. פתחנו לאחרונה טכנולוגיות הדמיה לחיות סלולריות מתקדמות, ושלבנו אותם עם ניתוח פונקציונלי גנטי של שניהםתאי פתוגנים ומארח כדי ליצור פלטפורמת צולבות משמעת לניתוח תפקוד חיסוני מולד תא ופתוגנזה פטרייתי. מחקרים אלו גילו היבטי רומן של phagocytosis שרק יכולים להיבחן באמצעות ניתוח זמני שיטתי של אינטראקציות המולקולריות ותאיות בין phagocytes אדם ומזיקי פטריות ומיקרואורגניזמים מידבקים יותר בדרך כלל. לדוגמה, התחלנו להגדיר את הפעולות הבאות: (א) מרכיבי תא השטח נדרש לכל שלב בתהליך של הכרה, חנק והרג של תאים פטרייתיים 1, 6, 7, 8 (ב) כיצד גיאומטרית משטח משפיע על יעילות קליטת מקרופאג והרג של תאי שמרים וhyphal 7; ו( ג) כיצד היבלעות מובילה לשינוי של מחזור התא וההתנהגות של מקרופאגים 9, 10.
בניגוד לתמונות נקודת זמן בודדות, מיקרוסקופי וידאו חי תאים מאפשר מגוון רחב של תאים פונדקאים ופתוגנים להיחקר כשותףרצפי ntinuous בפרק זמן ממושך, המספקים מידע מרחב ובזמן במגוון רחב של תהליכים דינמיים, כולל נדידת תאים, שכפול וסחר פוחי. כאן אנו מתארים בפירוט כיצד להכין מארח ותאים פטרייתי, וכדי לבצע את ניסויי מיקרוסקופיה וידאו. שיטות אלה יכולים לספק למשתמש מדריך למחקרים עתידיים עם phagocytes ומיקרואורגניזמים אחרים.
Protocol
1. ג צמיחה ותנאי קנדידה
- הכן את הצלחות אגרו SC-URA ידי הוספת בסיס חנקן שמרים גרמו 6.9 ללא חומצות אמינו, 1 מ"ל 1 M NaOH, 10% מ"ל 1 (w / v) מלח hemisulphate אדנין ואגר 20 גרם טכני (שתואר בעבר בהרחבה ב11). הפוך את הנפח עד 900 מ"ל עם H 2 O. המזוקק חיטוי, לאפשר אגר להתקרר, אבל לא מספיק כדי לבסס, ולאחר מכן להוסיף 50 40% D-גלוקוז סטרילית מ"ל ו 50 מיליליטר נשירת 4% סטרילי SC-אורה בתנאים אספטיים. מערבבים, יוצק לצלחות הפטר ולהשאיר את הצלחות אגרו להתקרר ולחזק. צלחות אגרו חנות בשעה 5 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
- הרצף ג קנדידה סרוטיפ מתח CAI4 + CIp10 ממניות גליצרול מאוחסן ב-80 ° C לצלחת אגר SC-אורה.
- דגירת הצלחת ב 30 מעלות צלזיוס עד שצורת מושבות וחנות בשעת 5 ° C.
- תרבות יחיד ג קנדידה מושבה ב5 מ"ל SC-אורה בינוני (כמו במתכון 1.1, אך ללא אגר טכני) ו דגירת הלילה בשעת 30מעלות צלזיוס, 200 סל"ד ליצור שלב ג הנייח קנדידה.
2. ג כתמי קנדידה שימוש Isothiocyanate fluorescein (FITC)
- הוסף 10 ג μl תרבות לילה קנדידה עד 990 PBS μl (pH 7.4) ולבצע ספירת תאים באמצעות haemocytometer.
- כדי לסייע להדמיה של ג קנדידה במהלך מבחני פאגוציטוזיס, כתם 1 × 10 8 ג קנדידה באמצעות 1 מ"ג / המ"ל FITC במאגר 0.05 M-יקרבונט קרבונט (pH 9.6) למשך 10 דקות בטמפרטורת חדר בחושך.
- כדי להסיר FITC המאוגד, לשטוף ג קנדידה ב1 המ"ל PBS x 1, צנטריפוגה ב3000 × גרם במשך 5 דקות, להסיר supernatant ו resuspend גלול ב 1 המ"ל PBS x 1. חזור 3 פעמים.
- Resuspend גלולה ב1 × 10 6 תאים / μl בx PBS 1.
3. הכנה של שורת תאי macrophage עכבר J774.1
- לשמור J774.1 המקרופאגים ברקמות 2 סנטימטר 75צלוחיות תרבות במדיום DMEM בתוספת 10% (v / v) עוברי עגל בסרום (FCS), 200 U / מיליליטר פניצילין / סטרפטומיצין ו2 מ"מ L-גלוטמין על 37 המעלות צלזיוס עם 5% CO 2. ההכנה של מקרופאגים העיקריים מתוארת בפירוט במקום אחר 12, 13.
- לגרד J774.1 תאים מבקבוק תרבית הרקמה ולהעביר לצינור פלקון 50 מ"ל. צנטריפוגה ב 600 × גרם במשך 5 דקות לקבלת תא גלול.
- הסרת supernatant ו resuspend גלול ב 10 מיליליטר מדיום DMEM להשלים מראש מחומם. ספירת תאים באמצעות haemocytometer וצלחת 1 × 10 6 J774.1 מקרופאגים בתוספת 2 מ"ל DMEM בינוני בצלחת זכוכית הדמיה מבוססת 35 מ"מ. דגירת הלילה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- לפני ההדמיה, יחליף מדיום DMEM בתוספת 2 מ"ל מראש חמם בינוני תוספת CO 2-עצמאי (עם 10% (v / v) עוברי עגל בסרום (FCS), 200 U / מיליליטר פניצילין / סטרפטומיצין ו2 מ"מ L-גלוטמין) מכיל 1 מיקרומטר LysoTracker האדום DND-99.
4. Assay החי Cell וידאו המיקרוסקופי phagocytosis
- הבחירה של מיקרוסקופ יהיה תלויה מה זמין באופן מקומי, אבל התקנת מיקרוסקופ תצטרך לכלול שלב הפוך, קאמרי סביבתית מחומם ל 37 מעלות צלזיוס ומסנני עירור / פליטה לכתמים שנבחרו (FITC וTRITC).
- הפעל את תנור מיקרוסקופ לפני הניסוי ולאפשר מספיק זמן לחדר הבקרה הסביבתי לחמם עד 37 מעלות צלזיוס הזמן שלוקח לטמפרטורת חדר כדי לייצב ישתנה עבור setups מיקרוסקופ השונה.
- הפעל את המחשב ומיקרוסקופ, ולטעון את תוכנת ההדמיה. הר צלחת ההדמיה על במת מיקרוסקופ ולהתאים את הפוקוס כדי למצוא את J774.1 מקרופאגים. ייעל את המראה של תמונות TRITC ודסק"ש על ידי התאמת אחוז האור מועבר וזמני חשיפה.
- מוציא את כלי ההדמיה ולהוסיף 3 × 10 6 FITC מוכתם ג קנדידה לtהוא המנה. רשום את הזמן שג קנדידה מתווספת למנה. להחזיר את הצלחת לבמה ולייעל את המראה של תמונות FITC במידת צורך. הגדר את רשימת נקודות במידת צורך.
- תחל הדמיה כאשר כל הנקודות נמצאות בפוקוס ואת הערוצים מותאמים. צלם תמונות FITC, TRITC ודסק"ש בכל דקה במשך 6 שעות.
Representative Results
כאן אנו מראים תוצאות יציגות לג ספיגת קנדידה ידי קו עכברי macrophage תא J774.1 במהלך ניסוי מיקרוסקופיה וידאו חי תאים 6 שעות. איור 1 היא סרט מיקרוסקופיה נציג חי תאי וידאו, מראה phagocytosis של ג קנדידה ידי J774.1 מקרופאגים עכבריים. מיקרוסקופיה וידאו חי תאים מאפשרת הפנמה של ג קנדידה להיות דמיינו ללא צורך להכתים קנדידה החיצונית. עם זאת, במהלך ניסויים אלה, ג קנדידה הייתה מוכתמת באמצעות צבע FITC pH הרגיש (ירוק), שיכבה במהלך ההחמצה של phagosome macrophage, ומקלה על אישור שקנדידה הופנמה (איור 1). עד ראית סיוע נוספת של ג בלע קנדידה, מקרופאגים הוכתמו באמצעות צבע אדום האדום LysoTracker ניאון DND-99, שכתמי מדורים חומציים ומשמש כסמן הלא ספציפי של התבגרות phagosome.איור 2 עדיין תמונה מניסוי מיקרוסקופיה וידאו חי תאים וממחיש את השונות במספר ג קנדידה לקיבה בJ774.1 המקרופאגים בודדים. בניסוי זה, 82% מJ774.1 מקרופאגים אפפו ג לפחות אחד תא קנדידה בסוף assay phagocytosis 6 שעות. באיור 3, המספר המופנם ג תאי קנדידה למקרופאג מדווחים. המספר הממוצע של ג קנדידה שנלקחה למקרופאג היא 3.4, אבל מעניין המקרופאגים יכולים לבלוע עד 16 תאים פטרייתיים. איור 4 הוא רצף של תמונות סטילס מניסוי נציג חי תאים מיקרוסקופי וידאו מראה macrophage phagocytosing ג תאי קנדידה, צמיחת hypha עם macrophage וסופו של דבר תמוגה מקרופאג. איור 4 ממחישים כי מיקרוסקופיה וידאו מאפשרת ניתוח של אירועים שהתרחש לאחר בליעה של תאי המטרה, נתונים כלומר יכולים להיות שנוצרו עבור קיlling של מקרופאגים ידי ג קורי קנדידה ביחס למספר והמורפוגנזה של תאי מטרת נטילתו, וכמה הרג macrophage מתייחסים להבשלת phagosome שניתן ללמוד בזמן אמת.
איור 1. סרט מיקרוסקופיה Live-תא וידאו המראה phagocytosis של ג קנדידה ידי J774.1 מקרופאגים עכבריים. המקרופאגים מוכתמים באמצעות צבע אדום האדום LysoTracker ניאון DND-99, ו-C קנדידה מוכתמת באמצעות FITC (ירוק). מקרופאגים וג קנדידה הייתה שותף בתרבית לתקופה של 6 שעות על 37 מעלות צלזיוס בCO בינוני 2-עצמאי מלא. תמונות שנתפסו ב1 מרווחי דקות עבור 6 שעות. המקרופאגים ניתן לראות יצירת מגע עם תאי תאים ג קנדידה, שלאחר מכן ואחרי הספיגה של ג קנדידה לphagosomes macrophage. חיצים מצביעים על ג קנדידה לפני ההיבלעות על ידי J774.1 מקרופאגים. וידאו זה גם מראה שפלואורסצנטי FITC הוא quencההיבלעות הבאה של הד ג קנדידה. סרגל קנה מידה, 10 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בסרט.
איור 2. עדיין וריאצית מיקרוסקופיה וידאו חי תאי נציג תמונה המציגה במספר C.albicans נבלע על ידי מקרופאגים הבודדים. המקרופאגים (מוכתמים באמצעות LysoTracker האדום DND-99) היו שותף בתרבית עם ג FITC המוכתם קנדידה (ירוק). קיימות שונות במספר ג קנדידה נבלעה (מספר הבא לחץ מצביע על מספר קנדידה ג נבלע), ובג מורפולוגיה קנדידה (פסוקי שמרים כלומר hypha). סרגל קנה מידה, 20 מיקרומטר.
איור 3. גרף מראה את מספר ג קנדידה ingested למקרופאג העכברי J774.1 בתום 6 מבחני פאגוציטוזיס hr. הנתונים מייצגים 2 ניסויים עצמאיים. סך של 100 מקרופאגים נספרו מ3 שדות מכל ניסוי, נותן סך של 600 המקרופאגים בודדים.
איור 4. סדרה של תמונות מניסוי נציג חי תאים מיקרוסקופי וידאו מראה מקרופאג (M) וג קנדידה (ג') לפני ובמהלך ההכרה (A, B), ובמשך ואחרי הספיגה (C, D). ג קנדידה קורים להמשיך לצמוח בתוך מקרופאג (E, F), אשר יכול לגרום לתמס מקרופאג (G). מקרופאגים אחרים מגויסים לאתר של קרע והניסיון להיבלע ג שוחרר קנדידה (H). המקרופאגים מוכתמים באמצעות צבע הניאון האדום LysoTracker אדום DND-99, ו-C קנדידה מוכתמת באמצעות FITC (ירוק). שים לב שהוא מכתים FITC quenched בעקבות ג ספיגת קנדידה ידי J774.1 מקרופאגים (C). סרגל קנה מידה, 10 מיקרומטר.
Discussion
הנה השיטה לשימוש במיקרוסקופ וידאו חי תאים ללמוד phagocytosis macrophage מתוארת. מיקרוסקופיה וידאו מציעה רבדים נוספים רבים של מידע לצורך הניתוח. יתרון בסיסי אחת הוא שנתוני ספיגה יכולים להיות שנוצרו (מניסוי בודד) עבור כל נקודת זמן לאורך התקופה של 6 שעתי התצפית. וחשוב יותר, בשיטה המתוארת מאפשרת ניתוח הפרש של השלבים הפרטניים של phagocytosis. יש לנו, למשל, הראה כי שינויים בספיגה כוללת של ג glycosylation קנדידה ומוטנטים המורפוגנזה ששורות תאים macrophage ומקרופגים העיקריים יכולות להיות כתוצאה משינויים בהגירת macrophage כלפי תאי מטרה או שיעור של בליעה פעם קשר תאי תאים היא הוקמה 7.
ישנן מספר המלכודות להימנע בעת ביצוע ניסויים אלה. ראשית, חשוב מאוד על מנת להבטיח תנאים סביבתיים יציבים לאורך proce הניסיוני דורה. זו מושגת הטובה ביותר בחדר סביבתי שנקבע לתנאי הניסוי כמה שעות לפני תחילת הניסוי. איכות וידאו תלויה מאוד במודולים מתוחכמים המשתמשים בלייזרים אינפרא אדומים כדי לשמור באופן אוטומטי מדגם Z-עמדה ללא קשר לשינויים מכאניים או תרמית ובכך לחסל את הצורך בתיקוני מיקוד ידני.
בהתחשב באופי הארוך של הניסויים, חשוב להגביל את חשיפת אור ליזר ואפקטי photobleaching וphotoconversion קשורים, שניתן למזער על ידי העסקת סמני ניאון גבוה, המאפשרים זמני חשיפה נמוכות. הפרוטוקול המכתים FITC המתואר כאן הוא מהיר ואמין. כFITC הוא פעמים בהירות מאוד ויציבות כתם, נמוכות חשיפה נדרשות וזה הופך אידיאלי FITC לסרטים ארוכים זמן לשגות. עם זאת, אנו משתמשים באופן שגרתי במגוון של כתמי היעד שונים, כולל צבעי PKH Calcofluor לבן וכמו גם אורגניזמים מתויגים.
ילדה = "jove_content"> רוב העבודה שלנו פורסמה מתבצע באמצעות מיקרוסקופ שדה רחב, אך ניתן למזער חשיפה נוספת באמצעות מיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב בידות שלנו וזה חיוני למיקרוסקופיה וידאו 3D זמן לשגות.
במהלך מחקר זה, תמונות שנתפסו במרווחי 1 דקות מעל assay phagocytosis 6 שעות. המרווח בין תמונות יכול להיות מותאם בהתאם לתהליך נחקר. לדוגמה, המרווח יכול להיות ירידה כאשר חוקרים תהליכים מהירים כגון סחר פוחי. מרווח הזמן המינימאלי יהיה מוגבל על ידי מפרטי מיקרוסקופ ומצלמה. יש כמה שיקולים שכדאי לזכור בעת כוונון תזמונים. ראשית, ירידה במרווח בין תמונות תהיה אומרת פחות נקודות יכולות להיות צלמה וגודל קובץ יהיה במידה ניכר. להיפך, להגדיל את מרווח התמונה יותר מדי יעשה את הסרט יאבד את הרצף.
גישה זו יכולה להיות מיושמתבעיקרון ללמוד פתוגנים וספיגה למות תאי מארח אחרים. לדוגמה, שהראינו לאחרונה כי מקרופאגים שמקורם של מח עצם מעכברים sialoadhesin-לקויים להפגין מופחתים מאוד מחייב וphagocytosis של קמפילובקטר jejuni sialylated 8. עם זאת, גודל היעד הוא גורם חשוב להיתכנות, כמו ניתוח תמונה הופך קשה יותר ויותר עם ירידה בגודל תא המטרה. תוכנת ניתוח תמונה מתוחכמת חיונית לניתוח מיקרוסקופי וידאו מהיר, וזה צריך להיות בשילוב עם תמיכה ביואינפורמטיקה המתאימה כדי להקל על הדור של אלגוריתמים ללמוד הגירה של תאים בודדים ואוכלוסיות שלמות של תאים 7. מיקרוסקופיה וידאו חי תאים בשילוב עם תוכנת עיבוד תמונה מתוחכמת לניתוח דקה אחרת דקה של הגירה ואינטראקציות אישיות macrophage-C.albicans, מספקת תובנה ייחודית המורכבות של ג phagocytosis קנדידה ידי macrophages. יש פוטנציאל עצום להרחבה בשיטות אלה כדי ללמוד פתוגנים וphagocytes (תאים דנדריטיים, נויטרופילים) אחרים ולפתח מיקרוסקופיה וידאו 3D לאינטראקציות תא תאי תמונה בפירוט רב יותר, או על משטחים פיסיולוגיים נוספים כגון שכבות תאי אפיתל ואנדותל. טכניקה זו היא חלק מהדור הבא של כלים בחקר אינטראקציות המארח פתוגן ותעזור להפיק מידע מרחב ובזמן מפורט על מגוון רחב של תהליכים דינמיים.
Disclosures
המחברים אין לי מה לחשוף. NG הוא מקבל תמיכת מענק בלתי מוגבלת למחקר בסיסי במדעי הגלעד. LE עובד כיועץ לחברת GSK בפיתוח תרופות בשלב מוקדם.
Acknowledgments
LPE הוא עמית קליני בכיר סקוטי ומודה לתמיכה של לשכת המדען הראשית (SCD/03). עבודה זו מומנה על ידי קרן Wellcome הפרויקט גרנט לLPE (089930). NARG מומן על ידי קרן Wellcome תכנית גרנט (080088) וציוד גרנט (075470) (לDeltaVision), ועל ידי FP7-2007-2013 גרנט (בריאות-F2-2010-260338-ALLFUN). ברצוננו להודות לאוניברסיטה של מתקן הדמית אברדין, בקווין מקנזי בפרט, על תמיכה ועצות מועילות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0402 | |
| NaOH | Sigma | S5881-500G | |
| Adenine hemisulphate salt | Sigma | A3159-25G | |
| Agar technical (no. 3) | Oxoid | LP0013 | |
| D-glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| SC-Ura dropout | Formedium | DSCK102 | |
| FITC | Sigma | F7250-1G | |
| Sodium carbonate | BDH | 301215M | |
| Sodium bicarbonate | BDH | 102475W | |
| PBS | Gibco | 18912-014 | |
| DMEM | Lonza | BE12-614F | |
| FCS | Life Technologies | 10106169 | |
| Penicillin/streptomycin | PAA | P11-010 | |
| L-glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
| 35 mm glass-dishes | PAA | PAA12305160X |
References
- McKenzie, C. G. J., et al. Contribution of Candida albicans cell wall components to recognition by and escape from murine macrophages. Infect. Immun. 78, 1650-1658 (2010).
- Mora-Montes, H. M., et al. Recognition and blocking of innate immunity cells by Candida albicans chitin. Infect. Immun. 79, 1961-1970 (2011).
- Keppler-Ross, S., et al. Recognition of yeast by murine macrophages requires mannan but not glucan. Eukaryot. Cell. 9, 1776-1787 (2010).
- Vijayan, D., et al. Mincle polarizes human monocyte and neutrophil responses to Candida albicans. Immunol. Cell Biol. , (2012).
- Seider, K., et al. The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation. J. Immunol. 187, 3072-3086 (2011).
- Sheth, C., et al. Glycosylation status of the C. albicans cell wall affects the efficiency of neutrophil phagocytosis and killing but not cytokine signalling. Med. Mycol. (5), 513-524 (2011).
- Lewis, L. E. Stage specific assessment of Candida albicans phagocytosis by macrophages identifies cell wall composition and morphogenesis as key determinants. PLoS Pathog. 8 (3), e1002578 (2012).
- Klaas, M., et al. Sialoadhesin Promotes Rapid Proinflammatory and Type I Interferon Responses to a Sialylated Pathogen, Campylobacter jejuni. J. Immunol. , In Press (2012).
- Lewis, L. E., et al. Candida albicans infection inhibits macrophage cell division and proliferation. Fungal Genet. Biol. , (2012).
- Bain, J. M., et al. Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages. Fungal Genet. Biol. , (2012).
- Mora-Montes, H., et al. Interactions between macrophages and cell wall oligosaccharides of Candida albicans. Methods Mol. Biol. 845, 247-260 (2012).
- McPhillips, K., et al. Assessment of apoptotic cell phagocytosis by macrophages. Methods Mol. Biol. 559, 247-256 (2009).
- Erwig, L. -P., et al. Differential regulation of phagosome maturation in macrophages and dendritic cells mediated by Rho GTPases and ezrin-radixin-moesin (ERM) proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (34), 12825-12830 (2006).
