Summary
Biz canlı hücre Video mikroskopi yöntemleri açıklamak
Abstract
Fungal patojenler, ve daha genel olarak mikroorganizmaların Fagositik klirensi, dört ayrı aşamadan oluşur kabul edilebilir: patojenler bulunduğu siteye fagositler (i) göç; desen ile patojen ilişkili moleküler şekilleri (PAMPs) (ii) tanıma tanıyan reseptör (PRR); fagosit hücre zarı bağlı mikroorganizmalar (iii) yutulma ve olgunlaşan phagosomes ve yutulur parçacığın sindirimi içinde yuttu hücrelerin (iv) işleme. Kendi bütünlüğü içerisinde fagositoz değerlendirmek çalışmalar, 1, 2, 3, 4, 5, bilgilendirici olmakla birlikte, normal olarak farklı şekilde etkilenebilir göçü, yutulma ve phagosome olgunlaşma, içine işlem bozulmazlar ki içinde sınırlıdır. Ayrıca, bu tür çalışmaların tek bir olay olarak değil, sürekli bir dinamik bir süreç olarak alımını değerlendirmek. Biz son zamanlarda gelişmiş canlı hücre görüntüleme teknolojileri geliştirmiş, hem genetik fonksiyonel analizi ile bu kombine varpatojen ve konak hücreleri doğuştan gelen bağışıklık hücre fonksiyonu ve fungal patogenezi analizi için disiplinler arası bir platform oluşturmak. Bu çalışmalar sadece insan fagositler ve fungal patojenler ve daha genel olarak bulaşıcı mikroorganizmaların arasındaki moleküler ve hücresel etkileşimleri sistematik zamansal analizi kullanılarak gözlenebilir fagositoz romanı yönlerini ortaya koymuştur. Örneğin, aşağıdaki tanımlamak başladı: (a) hücre yüzeyinde bileşenleri tanınması, yutulma ve mantar hücreleri 1, 6, 7, 8 ve öldürme işleminin her bir aşama için gereken, (b) kadar yüzey geometrisini makrofaj alımını ve maya hücreleri ve hifal 7 öldürme etkinliği etkiler, ve (c) yutulma hücre döngüsü ve makrofajlar 9, 10, davranış değişikliği yol açar nasıl.
Tek bir zaman noktasında anlık aksine, canlı hücre görüntü mikroskopi eş olarak incelenmesi için konakçı hücreler ve patojenlerin geniş bir yelpazede sağlarhücre migrasyonu, replikasyonu ve veziküler kaçakçılığı da dahil olmak üzere dinamik süreçleri, geniş bir yelpazede üzerinde mekansal ve zamansal bilgi sağlayarak uzun süreler boyunca ntinuous dizileri. Burada ana ve mantar hücreleri hazırlamak ve video mikroskopi deneyler için nasıl ayrıntılı olarak açıklamaktadır. Bu yöntemler diğer fagositler ve mikroorganizmalar ile ileride yapılacak çalışmalar için bir kullanıcı kılavuzu sağlayabilir.
Protocol
1. C. albicans Büyüme ve Koşullar
- 1 ml 1 M NaOH, 10 ml% 1 (w / v) adenin hemisulphate tuz ve 20 g teknik agar (önceden 11 de ayrıntılı olarak anlatıldığı gibi), amino asitler olmadan 6.9 g maya nitrojen baz ekleyerek, SC-Ura agar plakaları hazırlayın. Distile H 2 O ile 900 ml hacim Makyaj Otoklav, agar soğumasını bekleyin, ama kuvvetlendirmek ve sonra aseptik koşullarda 50 ml steril% 40 D-glukoz ve 50 ml steril% 4 SC-Ura terk eklemek için yeterli değildir. Karıştır, Petri kutularına dökün ve soğumaya ve katılaşmaya agar plakaları bırakın. Mağaza agar plakalar 5 ° C 'de kullanılana dek.
- Streak C. albicans serotip A koloni CAI4 + CIp10 gliserol stoklarından -80 ° C'de depolanan SC-Ura agar plaka üzerine.
- 30 plaka inkübe ° C 'ye kadar 5 koloniler form ve mağaza ° C
- Kültür bir tek C. albicans 5 ml SC-Ura orta (1.1 gibi, ancak teknik agar olmadan reçete) de koloni ve 30 gece inkübeDurağan faz C. oluşturmak için ° C, 200 rpm albicans.
2. C. Floresein izotiyosiyanat kullanma albicans Boyama (FITC)
- 10 ul C. ekle albicans gecede 990 ul PBS (pH 7.4) bir kültür ve haemocytometer kullanarak hücre sayımı gerçekleştirmek.
- C. görselleştirme yardımcı olmak fagositoz deneyleri sırasında albicans, 1 leke × 10 8 C. karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika için 0.05 M karbonat-bikarbonat tampon maddesi (pH 9.6) içinde 1 mg / ml FITC ile albicans.
- Ilişkisiz FITC kaldırmak için, C yıkayın 5 dakika boyunca 3.000 az 1 ml 1 x PBS, santrifüj × g albicans, 1 ml 1 x PBS süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. 3 kez tekrarlayın.
- 1 süspanse pelet × 10 6 hücre / 1 x PBS ul.
3. J774.1 Fare Makrofaj Hücre Hattı hazırlanması
- 75 cm2 doku içinde J774.1 makrofajlar bakımıDMEM ortamı içinde kültür şişeleri% 10 oranında arttırılmıştır (v / v) cenin dana serumu (FCS), 200 U / ml penisilin / streptomisin ve 2 ile 37 ° C de% 5 CO 2 mM L-glutamin. Birincil makrofaj hazırlanması ayrıntı 12, 13 içinde başka bir yerde anlatılmıştır.
- Doku kültürü şişesi J774.1 hücreleri kazıyın ve 50 ml Falcon tüp transfer. Bir hücre pelet elde etmek için 5 dakika süreyle 600 × g'de santrifüjleyin.
- 10 ml önceden ısıtılmış takviye edilmiş DMEM ortamı içinde tekrar süspansiyon topak süpernatantı ve çıkarın. 35 mm cam tabanlı görüntüleme tabak DMEM ortamı ilave 2 ml bir haemocytometer ve plaka 1 × 10 6 J774.1 makrofajlar kullanarak hücreleri saymak. 37 gece boyunca inkübe ° C,% 5 CO2.
- Önceki görüntüleme ile takviye edilmiş DMEM ortamı yerine 2 ml CO 2-bağımsız ortamı (10% (v / v) cenin dana serumu (FCS), 200 U / ml penisilin / streptomisin ve 2 mM L-glutamin ile) ilave ön-ısıtılmış 1 uM LysoTracker Kırmızı DND-99 içeren.
4. Canlı Hücre video Mikroskopi Fagositoz Assay
- Mikroskop seçimi mevcut yerel ne bağlı olacaktır, ancak mikroskop kurulum ters evre, 37 ısıtılmış bir çevre odası dahil etmek gerekir ° C ve seçilen lekeler için uyarma / emisyon filtresi (FITC ve TRITC).
- Deney öncesinde mikroskop ısıtıcı açın ve 37 kadar ısıtmak için çevresel kontrol odası için yeterli süre tanıyın ° C. Stabilize etmek odasının sıcaklığı için alınan zaman farklı mikroskop kurulumları için değişecektir.
- Mikroskop ve bilgisayarı açın ve görüntüleme yazılımı yükleyin. Mikroskop sahnede görüntüleme çanak monte edin ve J774.1 makrofajlar bulmak için odak ayarı. Iletilen ışık, ve etki süreleri yüzdesi ayarlayarak TRITC ve DIC görüntüleri en iyi duruma getirin.
- Görüntüleme çanak çıkarın ve ekleyin 3 × 10 6 FITC-lekeli C. t albicansO çanak. Zaman kaydedin o C albicans çanak eklenir. Sahneye çanak dönün ve FITC görüntülerin görünümünü gerekirse optimize. Gerekirse bir sayı listesini ayarlayın.
- Tüm noktaları odak ve kanalları optimize edildiğinde görüntüleme başlasın. FITC, TRITC ve DIC görüntüler 6 saat boyunca her dakika yakalayın.
Representative Results
Burada C. için temsili sonuçlar 6 saat canlı hücre Video mikroskobu deney sırasında murin makrofaj hücre hattı J774.1 tarafından albicans alımını. Şekil 1 C fagositozu gösteren temsili bir canlı hücre videosu mikroskopi film murin J774.1 makrofajlar tarafından albicans. Canlı hücre Video mikroskopi C. içselleştirilmesini sağlar dış Candida leke gerek kalmadan Görüntülenecek albicans. Bununla birlikte, bu deneyler sırasında, C. albicans makrofaj phagosome asitleştirilmesi sırasında soğutulur pH-duyarlı boya FITC (yeşil) kullanılarak lekelenmektedir, ve Candida (Şekil 1) dahili olarak yürütülür ki teyit kolaylaştırır edildi. Yutulan C. fazla yardım görselleştirme için albicans, makrofajlar kırmızı floresan boya LysoTracker kırmızı DND-99, lekeler asidik bölmeleri ve phagosome olgunlaşma özgül olmayan bir göstergesi olarak hizmet vermektedir kullanılarak boyandı.Şekil 2, bir canlı hücre görüntü mikroskopi deney bir hareketsiz resim ve C sayıda varyasyon gösterilmektedir albicans bireysel J774.1 makrofajlar tarafından yutulur. Bu deneyde, J774.1 makrofajlar% 82 oranında en az bir C yutan 6 saat fagositoz testin sonunda albicans hücre. Şekil 3, içsel C. sayıdaki makrofaj başına albicans hücreleri bildirilmiştir. C. ortalama sayısı makrofaj başına ele albicans 3.4 olduğunu, ancak ilginçtir makrofajlar 16 mantar hücreleri kadar yutmayın olabilir. Şekil 4 makrofaj phagocytosing C. gösteren temsili bir canlı hücre videoyu mikroskopi deney hareketsiz görüntüleri bir dizidir albicans hücreleri, makrofajlar ve sonuçta makrofaj erimesi ile hif büyümesi. Şekil 4, bu video mikroskopi hedef hücrelerin yutulma aşağıdaki olayların analizi sağlayan göstermektedir, yani veri ki için oluşturulabilirC. makrofajların lling Yutulan hedef hücrelerin sayısı ve morfojenezi ile ilgili olarak albicans hif, ve ne kadar makrofaj öldürme gerçek zamanlı olarak ele alınabilir phagosome olgunlaşma ile ilgilidir.
Şekil 1. C. fagositozu gösteren canlı hücre videosu mikroskopi film murin J774.1 makrofajlar tarafından albicans. Makrofajlar kırmızı floresan boya LysoTracker kırmızı DND-99 ve C kullanılarak boyanmış albicans FITC (yeşil) ile lekeli. Makrofajlar ve C. albicans 2-bağımsız orta tam CO içinde 37 ° C 'de 6 saat arasında bir süre için birlikte kültüre edildi. Görüntüler 6 saat için 1 dakika aralıklarla ele geçirildi. Makrofajlar, C ile hücre-hücre temas kurarak görülebilir sonra C. alımını tarafından takip edilir albicans, makrofaj phagosomes içine albicans. Oklar C. işaret albicans önceden J774.1 makrofajlar tarafından yutulma için. Bu video da bu FITC floresans QuEnc olduğunu gösterirC. Aşağıdaki hed yutulma albicans. Ölçek çubuğu, 10 mikron. filmi görmek için buraya tıklayın .
Bireysel makrofajlar tarafından saran C. albicans'ın sayı Şekil 2. Örnek canlı hücre görüntü mikroskopi hareketsiz görüntü gösteren varyasyonu. Makrofajlar (lekeli LysoTracker kırmızı kullanarak DND-99) FITC-lekeli C. ile birlikte kültüre edildi albicans (yeşil). Varyasyon C. sayısında var albicans (bir ok ile bir sonraki numara C. albicans sayısını belirtir içine aldı) saran, ve C. albicans morfolojisi (yani maya ayetler hif). Ölçek çubuğu, 20 mikron.
Şekil 3. C. sayısını gösteren grafik albicans 6 saat fagositoz testlerinin sonunda J774.1 murin makrofaj başına yutulur. Veri 2 bağımsız deneyin temsil eder. 100 makrofaj toplam 600 bireysel makrofaj bir toplam vererek, her bir deney 3 alanlardan sayıldı.
Şekil 4. Temsili bir canlı hücre videoyu mikroskobisi bir makrofaj gösteren deney (M) ve C. görüntüleri bir dizi albicans, (C) önce ve tanıma (A, B) ve, (C, D). C. sırasında ve alımından sonra albicans hifler makrofaj lizis (G) neden olabilir makrofaj (E, F), içerisinde büyümeye devam ediyor. Diğer makrofajlar yırtılması ve serbest C. sindirme girişimi siteye alınırlar albicans (H). Makrofajlar kırmızı floresan boya LysoTrac kullanılarak boyanmışker kırmızı DND-99, ve C. albicans FITC (yeşil) ile lekeli. FITC boyama C. Aşağıdaki söndürülür unutmayın J774.1 makrofajlar (C) tarafından albicans alımını. Ölçek çubuğu, 10 mikron.
Discussion
Burada, makrofaj fagositozu incelemek için canlı hücre görüntü mikroskopi kullanımı için bir yöntem tarif edilmektedir. Video mikroskopi analizi için birden çok bilgi ek katmanlar sunuyor. Bir temel avantajı, verilerin alımını 6 saatlik gözlem süresi boyunca her bir zaman noktası için (tek bir deneyden elde) elde edilebilir olmasıdır. Daha da önemlisi, tarif edilen yöntem fagositozunu, tek aşamaları diferansiyel analizine olanak sağlar. Bu, örneğin, göstermiştir ki, C. toplam alımı değişiklikleri makrofaj hücre hatları ve birincil makrofajlar tarafından albicans glikozilasyon ve morfonogenezi mutantlar hücre-hücre teması kez hedef hücre veya yutulma oranı doğru makrofaj migrasyon değişiklikleri 7 kurulan ya bir sonucu olabilir.
Bu deneyler sırasında önlemek için tuzaklar bir vardır. İlk olarak, bu deney prosedürü boyunca sabit çevre koşulları sağlamak için çok önemlidirDure. Bu, en iyi şekilde bir kaç saat deney başlamadan önce deneysel koşullar için ayarlanmış bir çevresel bölme içinde elde edilir. Video kalite z-pozisyonu ne olursa olsun, böylece manuel odaklama düzeltmeler için ihtiyacı ortadan kaldırarak mekanik veya termal değişikliklerin otomatik numune korumak için kızılötesi lazer kullanır gelişmiş modülleri büyük ölçüde bağımlıdır.
Deneylerin genişletilmiş doğası göz önüne alındığında, düşük pozlama süreleri kolaylaştıracak yüksek floresan belirteçleri, kullanılarak minimize edilebilir lazer ışığına maruz kalınmasına ve ilişkili photobleaching ve photoconversion etkileri sınırlamak için önemlidir. Burada anlatılan FITC boyama protokolü, hızlı ve güvenilir. FITC olduğu gibi çok parlak ve istikrarlı bir leke, düşük pozlama süreleri gereklidir ve bu uzun zaman atlamalı filmleri için FITC idealdir vardır. Bununla birlikte, rutin Calcofluor beyaz PKH ve boyalar gibi etiketlenmiş organizmalar da dahil olmak üzere çeşitli hedef lekeleri çeşitli kullanın.
Bu çalışma sırasında, görüntüleri 6 saat fagositoz tahlil fazla 1 dakika aralıklarla ele geçirildi. Görüntüler arasındaki aralığı soruşturma sürecine bağlı olarak ayarlanabilir. Bu tür veziküler ticareti gibi hızlı süreçlerin araştırılmasına Örneğin, aralık azaltılabilir. Minimum zaman aralığı mikroskop ve kamera özellikleri ile sınırlı olacaktır. Zamanlamaları ayarlarken akılda tutulması gereken bazı hususlar vardır. İlk olarak, anlık arasındaki süreyi azaltarak daha az puan imaged olabilir ve dosya boyutunu önemli ölçüde artmış olacak anlamına gelecektir. Tersine, çok fazla sayıda görüntü aralığını uzatan film süreklilik kaybettirirler.
Bu yaklaşım uygulanabilirilke olarak, diğer patojenler ve konak hücreleri ölüyor alımını çalışma. Örneğin, son zamanlarda sialoadhesin-eksik farelerde kemik iliği kaynaklı makrofajlar büyük sialylated Campylobacter jejuni 8 bağlayıcı ve fagositoz azalır sergilenirken göstermiştir. Görüntü analizi hedef hücre boyutu bir azalma ile giderek zorlaşır Ancak, hedef boyutu, fizibilite için önemli bir belirleyicisidir. Sofistike görüntü analiz yazılımı hızlı Video mikroskop analizi için önemlidir ve bu 7 ayrı hücreleri ve tüm hücre göçlere çalışma algoritmaları nesil kolaylaştırmak için uygun biyoinformatik desteği ile birlikte olmalıdır. Göç ve bireysel makrofaj-C.albicans etkileşimlerin dakika-by dakika analizi için gelişmiş görüntü analizi yazılımı ile birlikte canlı hücre Video mikroskobu, C. karmaşıklığı içine benzersiz bir fikir verir macrophag tarafından albicans fagositozues. Diğer patojenler ve fagositler (dendritik hücreler, nötrofiller) incelemek ve daha detaylı ya da epitel ve endotel hücre katmanları gibi daha fizyolojik yüzeylerde görüntü hücre-hücre etkileşimleri 3B video mikroskobu geliştirmek için bu yöntemleri genişletmek için büyük bir potansiyel var. Bu teknik, konak-patojen etkileşimleri çalışma araçları yeni nesil bir parçasıdır ve dinamik süreçleri geniş bir yelpazede üzerinde ayrıntılı mekansal ve zamansal bilgi üretmek yardımcı olacaktır.
Disclosures
Yazarlar ifşa etmek başka bir şey var. NG Gilead Sciences tarafından temel araştırma için sınırsız ödenekle destek almıştır. LE erken ilaç geliştirme GSK için danışman olarak çalışıyor.
Acknowledgments
LPE bir İskoç Kıdemli Klinik Fellow ve Baş Bilim Ofisi (SCD/03) desteğiyle kabul eder. Bu eser LPE (089930) için Wellcome Trust Projesi Hibe tarafından finanse edildi. NARG Bir Wellcome Trust Programı Hibe (080.088) ve bir ekipman Grant (075.470) (DeltaVision için), tarafından ve FP7-2007-2013 Grant (SAĞLIK-F2-2010-260338-Allfun) tarafından finanse edildi. Biz yardımcı destek ve tavsiye için özellikle Kevin MacKenzie Aberdeen görüntüleme tesisi Üniversitesi, teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0402 | |
| NaOH | Sigma | S5881-500G | |
| Adenine hemisulphate salt | Sigma | A3159-25G | |
| Agar technical (no. 3) | Oxoid | LP0013 | |
| D-glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| SC-Ura dropout | Formedium | DSCK102 | |
| FITC | Sigma | F7250-1G | |
| Sodium carbonate | BDH | 301215M | |
| Sodium bicarbonate | BDH | 102475W | |
| PBS | Gibco | 18912-014 | |
| DMEM | Lonza | BE12-614F | |
| FCS | Life Technologies | 10106169 | |
| Penicillin/streptomycin | PAA | P11-010 | |
| L-glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
| 35 mm glass-dishes | PAA | PAA12305160X |
References
- McKenzie, C. G. J., et al. Contribution of Candida albicans cell wall components to recognition by and escape from murine macrophages. Infect. Immun. 78, 1650-1658 (2010).
- Mora-Montes, H. M., et al. Recognition and blocking of innate immunity cells by Candida albicans chitin. Infect. Immun. 79, 1961-1970 (2011).
- Keppler-Ross, S., et al. Recognition of yeast by murine macrophages requires mannan but not glucan. Eukaryot. Cell. 9, 1776-1787 (2010).
- Vijayan, D., et al. Mincle polarizes human monocyte and neutrophil responses to Candida albicans. Immunol. Cell Biol. , (2012).
- Seider, K., et al. The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation. J. Immunol. 187, 3072-3086 (2011).
- Sheth, C., et al. Glycosylation status of the C. albicans cell wall affects the efficiency of neutrophil phagocytosis and killing but not cytokine signalling. Med. Mycol. (5), 513-524 (2011).
- Lewis, L. E. Stage specific assessment of Candida albicans phagocytosis by macrophages identifies cell wall composition and morphogenesis as key determinants. PLoS Pathog. 8 (3), e1002578 (2012).
- Klaas, M., et al. Sialoadhesin Promotes Rapid Proinflammatory and Type I Interferon Responses to a Sialylated Pathogen, Campylobacter jejuni. J. Immunol. , In Press (2012).
- Lewis, L. E., et al. Candida albicans infection inhibits macrophage cell division and proliferation. Fungal Genet. Biol. , (2012).
- Bain, J. M., et al. Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages. Fungal Genet. Biol. , (2012).
- Mora-Montes, H., et al. Interactions between macrophages and cell wall oligosaccharides of Candida albicans. Methods Mol. Biol. 845, 247-260 (2012).
- McPhillips, K., et al. Assessment of apoptotic cell phagocytosis by macrophages. Methods Mol. Biol. 559, 247-256 (2009).
- Erwig, L. -P., et al. Differential regulation of phagosome maturation in macrophages and dendritic cells mediated by Rho GTPases and ezrin-radixin-moesin (ERM) proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (34), 12825-12830 (2006).
