Summary
우리는 라이브 세포 영상 현미경에 대한 방법을 설명
Abstract
곰팡이 병원균 등 일반적으로 미생물의 Phagocytic 간격은 4 개의 독특한 스테이지로 구성되어 고려 될 수있다 : 병원균이있는 사이트에 phagocytes의은 (i) 이전, 패턴을 통해 병원체 - 관련 분자 패턴 (PAMPs)의 (II) 인식 인식 수용체 (PRRs), 식세포 세포막에 바인딩 된 미생물의 (III) engulfment, 그리고 성숙 phagosomes 및 섭취 입자의 소화에서 빨아 세포 (IV) 처리. 전체 phagocytosis를 평가 연구 1, 2, 3, 4, 5 유익한이다, 그러나 일반적으로 differentially에 영향을 줄 수 있습니다 마이그레이션, engulfment 및 phagosome 성숙로 과정을 파괴하지 않는 점에서 제한됩니다. 또한, 이러한 연구는 단일 이벤트로,보다 지속적으로 동적 과정으로 이해를 신고 할 수 있습니다. 우리는 최근 고급 라이브 세포 이미징 기술을 개발하고, 모두의 유전자 기능 분석과 이들을 통합 한병원체와 호스트 세포는 타고난 면역 세포 기능과 곰팡이 pathogenesis의 분석을위한 크로스 징계 플랫폼을 만들 수 있습니다. 이 연구는 인간의 phagocytes과 곰팡이 병원균에 더 일반적으로 전염성 미생물의 분자와 세포의 상호 작용 체계 시간적 분석을 사용하여 관찰 할 수 phagocytosis의 소설 측면을 공개했습니다. 예를 들어, 우리는 다음을 정의하기 시작했습니다 (A) 세포 표면의 구성 요소는 인식, engulfment 및 곰팡이 세포 1, 6, 7, 8, 9, 10의 살해 과정의 각 단계에 필요한, (b)는 얼마나 표면 형상 대 식세포의 이해와 효모와 hyphal 세포 7 살해의 효율성에 영향을 미친다, 그리고 (c) engulfment는 세포주기와 대 식세포 9, 10의 행동의 변화로 연결하는 방법.
하나의 시점 스냅 샷 대조적으로, 라이브 셀 비디오 현미경은 공동으로 연구 할 호스트 세포와 병원균의 다양한 수셀 마이그레이션, 복제 및 기공을 갖는 거래 등의 동적 프로세스의 넓은 범위에 공간과 시간적 정보를 제공 긴 기간 동안 ntinuous 시퀀스. 여기 호스트 및 곰팡이 세포를 준비하는, 비디오 현미경 실험을 수행하는 방법에 대해 자세히 설명합니다. 이 방법은 다른 phagocytes 및 미생물과 미래 연구를위한 사용자 가이드를 제공 할 수 있습니다.
Protocol
1. C. 알비 칸스 성장과 조건
- 1 ML 1 M NaOH, 10 ML 1퍼센트 (w / V) 아데닌 hemisulphate의 소금과 20g 기술 한천 (이전 11에 자세히 설명), 아미노산없이 6.9 g 효모 질소베이스를 추가하여 SC-우라 한천 플레이트를 준비합니다. 소주 H 2 O.으로 900 ML에 볼륨을 확인 압력솥, 한천은 냉각 할 수 있지만, 고체화 한 후 무균 조건 하에서 50 ML 멸균 40 % D-포도당 50 ML 멸균 4% SC-우라 중퇴를 추가하는 것만으로는 충분하지. 믹스, 페트리 접시에 부어과 시원하고 더욱 강화하기 위해 한천 플레이트를 두십시오. 저장 한천 플레이트 5시 ° C 사용까지.
- 승리 C. 알비 칸스 혈청 형 변형 CAI4 + CIp10 글리세롤 주식에서 -80에 저장 ° C SC-우라 한천 플레이트로.
- 30에서 판을 길러 ° C까지 5시에 식민지 양식 및 매장 ° C.
- 문화 단일 C. 알비 칸스 5 ML SC-우라 미디어 (1.1에서와 같이하지만, 기술적 인 한천이없는 제조법)에서 식민지와 30에서 하루 아침에 품다고정 단계 C.를 생성하는 ° C, 200 RPM 알비 칸스.
2. C. Fluorescein의 Isothiocyanate을 사용하여 알비 칸스의 착색 (FITC)
- 10 μl C. 추가하기 알비 칸스 하루 아침에 990 μl PBS (산도 7.4)에 대한 문화와는 혈구를 사용하여 셀 카운트를 수행합니다.
- C.의 시각화를 돕기 위해 phagocytosis의 assays 중 알비 칸스은 1 얼룩 × 10 8 C.를 어둠 속에서 실온에서 10 분 동안 0.05 M 탄산 - 중탄산염 버퍼 (산도 9.6)에 1 MG / ML FITC를 사용하여 알비 칸스.
- 언 바운드 FITC를 제거하려면, C.을 씻어 5 분 3,000 1 ML 1 개 PBS, 원심 분리기 × g에서 알비 칸스, 1 ML 1 개 PBS에서 표면에 뜨는 및 resuspend 펠렛을 제거합니다. 3 회 반복합니다.
- 1에 Resuspend 펠릿 × 10 6 세포 / 1 개 PBS에서 μl.
3. J774.1 마우스 대 식세포 셀 라인의 작성
- 75cm 두 조직의 J774.1 대 식세포를 유지DMEM 매체의 문화 플라스크이 10 %로 보충 (V / V) 태아 송아지 혈청 (FCS), 200 U / ML 페니실린 / 스트렙토 마이신과 2 37 ° C와 5 % CO 2에서 MM L-글루타민. 주요 식세포의 준비는 세부 12, 13의 다른 곳에서 설명되어 있습니다.
- 조직 배양 플라스크에서 J774.1 세포를 긁어 50 ML 팔콘 튜브에 전송할 수 있습니다. 세포 펠렛을 구하는 5 분에 600 × g에서 원심 분리기.
- 10 ML 미리 따뜻하게 보충 DMEM 매체에 표면에 뜨는 및 resuspend 펠렛을 제거합니다. 35mm 유리 기반의 영상 접시에 DMEM 매체 보충이 ML에 혈구와 플레이트 1 × 10 6 J774.1 대 식세포를 사용하여 셀을 계산합니다. 37 박 품다 ° C, 5 % CO 2.
- 이전 이미지에와 보충 DMEM 매체를 대체이 ML CO 2 독립적 인 매체 (10 % (V / V) 태아 송아지 혈청 (FCS), 200 U / ML 페니실린 / 스트렙토 마이신, 2 MM L-글루타민 포함) 보충 사전 따뜻하게 1 μM LysoTracker 레드 DND-99을 포함.
4. 라이브 셀 비디오 현미경 Phagocytosis 분석
- 현미경의 선택은 로컬 사용할 수있는 의존되지만, 현미경 설치가 역 단계, 37에 가열 환경 챔버를 포함해야합니다 ° C와 선택한 얼룩에 여기 / 방출 필터 (FITC와 TRITC).
- 실험하기 전에 현미경 히터의 전원을 켜고 37 따뜻하게 환경 제어 챔버에 대한 충분한 시간을 허용 ° C. 안정화하기 위해 챔버 온도에 대한 촬영 시간은 다른 현미경 설정에 따라 다를 수 있습니다.
- 현미경과 컴퓨터를 켠 이미징 소프트웨어를로드합니다. 현미경 무대에서 이미징 요리를 탑재하고 J774.1 대 식세포를 찾아 초점을 조정합니다. 전송 빛과 노출 시간의 비율을 조정하여 TRITC 및 DIC 이미지의 모양을 최적화 할 수 있습니다.
- 이미징 요리를 제거하고 추가 3 × 10 6 FITC-스테인드 C. t에 알비 칸스그는 요리. 시간을 녹화하는 것이 C. 알비 칸스는 요리에 추가됩니다. 무대에 요리를 반환하고 FITC 이미지의 모양 필요한 경우를 최적화 할 수 있습니다. 필요한 경우 포인트 목록을 설정합니다.
- 모든 점에 초점에 있고 채널을 최적화 할 때 이미지 하십시요. FITC, TRITC 및 DIC 이미지를 6 시간에 대한 분마다 캡처합니다.
Representative Results
여기 C.에 대한 대표적인 결과를 보여 6 시간 라이브 셀 비디오 현미경 실험 동안 손쥐 대 식세포 세포 라인 J774.1로 알비 칸스의 이해. 그림 1은 C.의 phagocytosis를 보여주는 대표적인 라이브 셀 비디오 현미경 영화입니다 손쥐 J774.1 대 식세포에 의한 알비 칸스. 라이브 셀 비디오 현미경은 C.의 내면화 수 외부 칸디다을 착색 할 필요없이 보여 질 수있는 알비 칸스. 그러나, 이러한 실험 중, C. 알비 칸스은 대 식세포의 phagosome의 산성화 동안 침묵하는 산도에 민감한 염료 FITC (녹색)를 사용하여 얼룩이, 그리고 칸디다는 (그림 1) internalized되었음을 확인을 용이하게했다. 섭취 C.의 추가 원조 시각화에 알비 칸스, 대 식세포는 붉은 색 형광 염료 LysoTracker 붉은 DND-99, 얼룩 산성 격실과 phagosome 성숙의 비 특정 마커 역할을 사용하여 얼룩 져 있었다.그림 2는 라이브 셀 비디오 현미경 실험에서 스틸 이미지이며, C.의 수에 변화를 보여줍니다 알비 칸스 개별 J774.1 대 식세포에 의해 섭취. 이 실험에서 J774.1 대 식세포의 82 %가 적어도 하나의 C.을 빨아 6 시간의 phagocytosis 분석의 끝에 알비 칸스 셀. 그림 3, internalized C.의 수가 대 식세포 당 알비 칸스 세포가보고됩니다. C.의 평균 수 대 식세포 당 최대 촬영 알비 칸스는 3.4이지만, 흥미로운 식세포는 16 곰팡이 세포까지 처리 할 수 있습니다. 그림 4 대 식세포 phagocytosing C.를 보여주는 대표적인 라이브 셀 비디오 현미경 실험에서 스틸 이미지의 순서입니다 알비 칸스 세포, 대 식세포, 그리고 궁극적으로 대 식세포 용해와 hypha 성장. 그림 4 그 비디오 현미경 타겟 세포의 engulfment에 따라 이벤트의 분석을 가능하게 보여줍니다, 즉 데이터는 기가를 생성 할 수 있습니다C.에 의해 대 식세포의 lling 섭취 대상 세포의 수와 morphogenesis와 관련하여 알비 칸스 균사 방법 및 대 식세포의 살인은 실시간으로 공부를 할 수 phagosome 성숙에 관한 것이다.
그림 1. C.의 phagocytosis를 보여주는 라이브 셀 비디오 현미경 영화 손쥐 J774.1 대 식세포에 의한 알비 칸스. 대 식세포는 붉은 색 형광 염료 LysoTracker 붉은 DND-99 및 C를 사용하여 묻은 알비 칸스는 FITC (녹색)를 사용하여 얼룩 져 있습니다. 대 식세포와 C. 알비 칸스 2 독립적 인 매체 전체 CO에서 37 ° C에서 6 시간의 기간 동안 공동 배양 하였다. 이미지는 6 시간 1 분 간격으로 촬영되었다. 대 식세포는 C.와 함께 세포 세포 접촉을 수립 볼 수 있습니다 그리고 C.의 이해가옵니다 알비 칸스, 대 식세포의 phagosomes에 알비 칸스. 화살표 C.를 가리 킵니다 알비 칸스 전에 J774.1 대 식세포에 의해 engulfment합니다. 이 동영상은 또한 FITC의 형광이 quenc입니다 보여줍니다C.의 쓰인 다음과 engulfment 알비 칸스. 규모 바, 10 μm. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
개인 대 식세포에 의해 빨아 C.albicans의 수가 그림 2. 대표 라이브 셀 비디오 현미경 스틸 이미지 표시 변화. 대 식세포 (스테인드 LysoTracker 붉은 색 사용 DND를 99) FITC-스테인드 C.와 공동 배양 한 알비 칸스 (녹색). 변화는 C.의 수에있다 알비 칸스은 (화살표 옆에 숫자가 C. 알비 칸스의 수는 빨아 나타냅니다) 빨아, 그리고 C.에 알비 칸스 형태 (예 : 효모 구절 hypha). 스케일 바, 20 μm.
그림 3. C.의 수를 보여주는 그래프 알비 칸스 6 시간의 phagocytosis의 assays의 끝에서 J774.1 손쥐 대 식세포 당 섭취. 데이터는 2 독립적 인 실험을 나타냅니다. 100 대 식세포의 총 600 개인 대 식세포의 총을 제공, 각 실험에서 3 분야에서 인정되었다.
그림 4. 대표 라이브 셀 비디오 현미경 대 식세포를 보여주는 실험 (M)와 C.에서 이미지의 일련의 알비 칸스 (C) 이전과 인식 (A, B) 동안, 그리고 (C, D). C.에게 동안과 이해 후 알비 칸스 균사가 대 식세포의 용해 (G) 될 수있는 대 식세포 (E, F), 내 성장을 계속한다. 다른 대 식세포가 파열 및 출시 C.를 처리하기 위해 시도의 사이트로 모집 알비 칸스 (H). 대 식세포는 붉은 색 형광 염료 LysoTrac를 사용 묻은ker 붉은 DND-99, 그리고 C. 알비 칸스는 FITC (녹색)를 사용하여 얼룩 져 있습니다. FITC 염색은 C.에 따라 침묵이 오니, 이용에 참고하여 J774.1 대 식세포 (C)에 의해 알비 칸스 이해. 스케일 바, 10 μm.
Discussion
다음은 대 식세포의 phagocytosis를 공부하는 라이브 세포의 비디오 현미경의 사용에 대한 방법을 설명합니다. 비디오 현미경 분석에 대한 정보의 여러 추가 레이어를 제공합니다. 하나의 기본 장점은 이해 데이터가 6 시간 관찰 기간 동안 어떤 시점에 (하나의 실험에서) 생성 할 수 있다는 것입니다. 더 중요한 것은, 설명 방법은 phagocytosis의 각 단계의 차등 분석을 할 수 있습니다. 우리는 예를 들어, 표시 한 그 C.의 전반적인 이해의 변화 대 식세포 세포 라인과 기본 식세포에 의한 알비 칸스의 글리코 실화와 morphogenesis의 돌연변이는 세포 세포 접촉 한 대상 셀 또는 engulfment의 속도에 대한 대 식세포의 이동의 변화 7 설립 중 결과가 될 수 있습니다.
이러한 실험을 실시 할 때 피해야 할 함정에는 여러가지가 있습니다. 첫째, 실험 proce에 걸쳐 안정된 환경 조건을 보장하기 위해 매우 중요합니다dure. 이것은 가장 몇 시간 실험을 시작하기 전에 실험 조건으로 설정되어 환경 챔버에 달성된다. 비디오 품질은 Z-위치에 관계없이 따라서 수동 초점 수정에 대한 필요성을 제거 기계적 또는 열 변경 자동으로 샘플을 유지하기 위해 적외선 레이저를 사용하여 정교한 모듈에 크게 의존합니다.
실험의 확장 특성을 감안할 때, 그것은 낮은 노출 시간을 용이하게 높은 형광 마커를 채용하여 최소화 할 수 있습니다 레이저 빛에 노출과 관련 photobleaching과 photoconversion 효과를 제한하는 것이 중요합니다. 여기에 설명 된 FITC 염색 프로토콜은 빠르고 신뢰할 수 있습니다. FITC는 바와 같이 매우 밝고 안정적인 얼룩, 낮은 노출 시간이 필요하며이 오랜 시간 경과 영화에 대한 FITC 이상적입니다. 그러나, 우리는 정기적으로 Calcofluor 화이트와 PKH 염료뿐만 아니라 태그 생물을 포함하여 다른 대상 얼룩의 다양한 사용합니다.
본 연구 동안 이미지는 6 시간의 phagocytosis 분석 이상 1 분 간격으로 촬영되었다. 이미지 사이의 간격은 조사중인 프로세스에 따라 조정할 수 있습니다. 이러한 기공을 갖는 인신 매매와 같은 빠른 프로세스를 조사 할 때 예를 들어, 간격이 감소 될 수있다. 최소 시간 간격은 현미경과 카메라 사양에 의해 제한됩니다. 타이밍을 조정하면 명심 몇 가지 고려 사항이 있습니다. 첫째, 스냅 샷 사이의 간격을 조절하면 적은 포인트가 이미징 될 수 있으며, 파일 크기가 상당히 증가 할 것이라는 것을 의미합니다. 반대로, 너무 많은 이미지 간격을 증가하면 동영상이 연속성을 잃게 할 것입니다.
이 접근 방식은 적용 할 수 있습니다원칙적으로 다른 병원체와 호스트 세포를 죽음의 이해를 공부합니다. 예를 들어, 최근 sialoadhesin - 결핍 생쥐에서 뼈 골수 유래 대 식세포이 크게 sialylated 캄 필로 박터 속 jejuni 8 구속력과 phagocytosis 감소 전시 것으로 나타났습니다. 이미지 분석 대상 셀 크기의 감소와 점점 더 어려워진다 그러나 대상 크기는 가능성의 중요한 결정자입니다. 정교한 이미지 분석 소프트웨어는 빠른 비디오 현미경 분석을 위해 필수적이며,이은 7 개별 셀 및 전체 세포 인구의 이주를 공부하는 알고리즘의 생성을 촉진하기 위해 적절한 생물 정보학 지원과 결합해야합니다. 마이그레이션 및 개인 대 식세포 - C.albicans 상호 작용의 분 별 분 분석을위한 정교한 이미지 분석 소프트웨어와 함께 라이브 셀 비디오 현미경은 C.의 복잡성에 독특한 통찰력을 제공합니다 macrophag로 알비 칸스 phagocytosis에스. 다른 병원체와 phagocytes을 (수지상 세포, 호중구) 공부하고, 더 자세하게 또는 상피 및 내피 세포 레이어와 같은 더 많은 생리 표면에 이미지 셀 셀의 상호 작용에 3D 비디오 현미경을 개발하기 위해이 방법을 확장 할 무한한 잠재력이 있습니다. 이 기술은 호스트 병원체 상호 작용의 연구에서 도구의 다음 세대의 일부입니다 및 동적 프로세스의 광범위한에 대한 자세한 공간과 측두엽 정보를 생성하는 데 도움이됩니다.
Disclosures
저자는 공개 할 수 없어요. NG는 길르앗 과학의 기초 연구에 대한 제한 기금 지원받는 것입니다. LE는 초기 약물 개발에 GSK의 컨설턴트로 작동합니다.
Acknowledgments
LPE는 스코틀랜드의 수석 임상 연구원이며, 최고 과학자 사무소 (SCD/03)의 지원을 인정합니다. 이 작품은 LPE (089930)에 웰컴 트러스트 프로젝트 기금의 지원을받는되었다. NARG은 웰컴 트러스트 프로그램 기금 (080088)과 장비 부여 (075470) (DeltaVision 용), 의해 FP7 - 2007-2013 기금 (건강-F2-2010-260338 - ALLFUN)에 의해 재정 지원되었다. 우리는 도움 지원과 조언을 특정 케빈 맥켄지의 애버딘 (Aberdeen) 영상 시설의 대학, 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0402 | |
| NaOH | Sigma | S5881-500G | |
| Adenine hemisulphate salt | Sigma | A3159-25G | |
| Agar technical (no. 3) | Oxoid | LP0013 | |
| D-glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| SC-Ura dropout | Formedium | DSCK102 | |
| FITC | Sigma | F7250-1G | |
| Sodium carbonate | BDH | 301215M | |
| Sodium bicarbonate | BDH | 102475W | |
| PBS | Gibco | 18912-014 | |
| DMEM | Lonza | BE12-614F | |
| FCS | Life Technologies | 10106169 | |
| Penicillin/streptomycin | PAA | P11-010 | |
| L-glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
| 35 mm glass-dishes | PAA | PAA12305160X |
References
- McKenzie, C. G. J., et al. Contribution of Candida albicans cell wall components to recognition by and escape from murine macrophages. Infect. Immun. 78, 1650-1658 (2010).
- Mora-Montes, H. M., et al. Recognition and blocking of innate immunity cells by Candida albicans chitin. Infect. Immun. 79, 1961-1970 (2011).
- Keppler-Ross, S., et al. Recognition of yeast by murine macrophages requires mannan but not glucan. Eukaryot. Cell. 9, 1776-1787 (2010).
- Vijayan, D., et al. Mincle polarizes human monocyte and neutrophil responses to Candida albicans. Immunol. Cell Biol. , (2012).
- Seider, K., et al. The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation. J. Immunol. 187, 3072-3086 (2011).
- Sheth, C., et al. Glycosylation status of the C. albicans cell wall affects the efficiency of neutrophil phagocytosis and killing but not cytokine signalling. Med. Mycol. (5), 513-524 (2011).
- Lewis, L. E. Stage specific assessment of Candida albicans phagocytosis by macrophages identifies cell wall composition and morphogenesis as key determinants. PLoS Pathog. 8 (3), e1002578 (2012).
- Klaas, M., et al. Sialoadhesin Promotes Rapid Proinflammatory and Type I Interferon Responses to a Sialylated Pathogen, Campylobacter jejuni. J. Immunol. , In Press (2012).
- Lewis, L. E., et al. Candida albicans infection inhibits macrophage cell division and proliferation. Fungal Genet. Biol. , (2012).
- Bain, J. M., et al. Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages. Fungal Genet. Biol. , (2012).
- Mora-Montes, H., et al. Interactions between macrophages and cell wall oligosaccharides of Candida albicans. Methods Mol. Biol. 845, 247-260 (2012).
- McPhillips, K., et al. Assessment of apoptotic cell phagocytosis by macrophages. Methods Mol. Biol. 559, 247-256 (2009).
- Erwig, L. -P., et al. Differential regulation of phagosome maturation in macrophages and dendritic cells mediated by Rho GTPases and ezrin-radixin-moesin (ERM) proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (34), 12825-12830 (2006).
