Summary
我们描述的方法对活细胞视频显微镜
Abstract
吞噬清除病原真菌和微生物，更一般地，可以认为包括四个不同的阶段：（ⅰ）吞噬细胞迁移的病原体是所在的站点;（ii）确认病原体相关的分子模式（PAMPS）通过模式识别受体（PRRS）;吞没的（ⅲ）的吞噬细胞的细胞膜结合的微生物，及（iv）处理成熟的吞噬体和消化摄入的粒子的吞噬细胞内。研究，评估其全部吞噬1，2，3，4，5的信息，但被限制的，因为它们通常不会打破过程分解成迁移，吞噬和吞噬体的成熟，可能受到影响的差异。此外，这些研究评估摄取作为一个单一的事件，而不是作为一个连续的动态过程。最近，我们已经开发了先进的活细胞成像技术，并结合这两个基因的功能分析病原体和宿主细胞创造一个跨学科平台的先天免疫细胞的功能和致病机理进行了分析。这些研究揭示了小说方面的吞噬作用，只能观察系统的时域分析人类巨噬细胞和真菌病原体和更普遍的传染性微生物的分子和细胞之间的相互作用。例如，我们已经开始定义如下：（a）该细胞表面的组件所需的每个阶段的过程中识别，吞噬和杀真菌细胞1，6，7，8（b）如何表面几何形状影响巨噬细胞吞噬和杀灭酵母和菌丝细胞的效率;及（c）如何吞噬导致的巨噬细胞，细胞周期和行为的改变。
相反，单一的时间点快照，活细胞的视频显微镜使作为共同研究各种各样的宿主细胞和病原体ntinuous序列在漫长的时间段，提供广泛的动态过程，包括细胞迁移，复制和小泡运输的时间和空间信息。在这里，我们详细描述如何准备主机和真菌细胞，并进行视频显微镜实验。这些方法可以提供未来的研究与其他吞噬细胞和微生物的用户指南。
Protocol
1。C.白色念珠菌的生长和条件
- 准备SC-URA琼脂平板上，通过加入6.9克无氨基酸的酵母氮碱，1毫升1 M NaOH溶液，10毫升1％（重量/体积）腺嘌呤hemisulphate盐和20克技术琼脂（先前11中详细描述）。化妆用蒸馏水，H 2 O的体积至900毫升高压灭菌器，允许琼脂冷却，但还不够巩固，然后在无菌条件下，添加50毫升无菌的40％D-葡萄糖和50毫升无菌4％SC-URA辍学。混合，倒入培养皿中，并留下琼脂平板上，冷却和固化。商店琼脂平皿上，在5℃下直至使用。
- 数C。白色念珠菌血清型的菌株CAI4 + CIp10从甘油保存于-80°C到SC-URA琼脂平板上。
- 孵育板在30°C至菌落形态和存储在5°C。
- 文化单一C. SC-URA在5毫升培养基（配方在1.1，但没有技术的琼脂）和白色念珠菌殖民地孵育过夜30℃，200 rpm到生成固定相C.白色念珠菌 。
2 C.白色念珠菌染色异硫氰酸荧光素（FITC）
- 加入10微升C.白色念珠菌 990微升PBS（pH 7.4）中，并过夜培养，使用血球计进行细胞计数。
- 为了帮助可视化C.吞噬作用测定期间的白色念珠菌 ，染色剂1×10 8 C。白色念珠菌在0.05M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液（pH9.6）在室温下在黑暗中10分钟，用1毫克/毫升FITC。
- 要除去未结合的FITC，洗C.白色念珠菌在1毫升1×PBS中，离心机在3000×g下5分钟，去除上清液，沉淀重悬在1ml 1×PBS。重复3次。
- 重悬浮沉淀，在1×10 6细胞/μl，以1×PBS。
3。 J774.1小鼠巨噬细胞系的制备
- 保持在75厘米2组织J774.1巨噬细胞在DMEM培养基的培养瓶中补充有10％（V / V）胎牛血清（FCS），200 U / ml青霉素/链霉素和2mM的L-谷氨酰胺，37℃，5％CO 2的 。原发性巨噬细胞的制备12，13中详细描述的其他地方。
- 刮J774.1细胞从组织培养烧瓶中，并转移到一个50毫升Falcon管中。在600×g下离心5分钟，得到的细胞沉淀。
- 去除上清，重悬沉淀在10ml预先温热的补充的DMEM培养基中。计数细胞，用血细胞计数板1×10 6 J774.1巨噬细胞在2ml补充的DMEM培养基，在35毫米的玻璃为基础的成像菜。孵育过夜，在37℃，5％CO 2。
- 成像前，取代补充的DMEM培养基中，用2毫升预加热补充CO 2独立的介质（有10％（V / V）胎牛血清（FCS），200 U / ml青霉素/链霉素和2mM的L-谷氨酰胺） 1的μMLysoTracker红DND-99。
4。活细胞视频显微细胞吞噬功能测定
- 显微镜的选择将取决于什么是本地可用，但在显微镜设置将需要包括一个倒置的阶段，环境室，加热至37℃，并激发/发射过滤器的所选择的污渍（FITC和TRITC）。
- 打开显微镜上的加热器在实验前，留出足够的时间对环境的控制腔升温到37°C。室温度稳定所需的时间会有所不同，不同的显微镜设置。
- 显微镜和电脑，打开和加载的图像处理软件。安装盘上的显微镜载物台的成像和调整的重点，找到J774.1巨噬细胞。优化TRITC和DIC图像的外观，通过调整透射光的百分比和曝光时间。
- 取出成像菜和添加3×10 6 FITC染色C.白色念珠菌为t他的菜。记录的时间，C.白色念珠菌的菜。菜的阶段，并优化如有必要，FITC图像的外观。如果需要的话，设置了积分榜。
- 开始成像时，所有的点都聚焦和渠道进行了优化。捕获FITC，TRITC和DIC的图像，每分钟6小时。
Representative Results
在这里，我们显示出有代表性的结果为C.白色念珠菌的吸收在6小时的活细胞视频显微镜实验的小鼠巨噬细胞株J774.1。 图1是一个具有代表性的活细胞的视频显微镜电影，示出C 的吞噬念珠菌的小鼠J774.1巨噬细胞。视频显微镜使活细胞内的C.白色念珠菌是可视化而不需要染色外部念珠菌。然而，在这些实验中，C。白色念珠菌是染色使用的pH值敏感的染料FITC（绿色），骤冷过程中的巨噬细胞吞噬体酸化，并促进念珠菌已内在化（ 图1）的确认。为了进一步援助可视化的摄入C.白色念珠菌，巨噬细胞染色使用的红色荧光染料LysoTracker红色DND-99，这污渍酸性舱室和作为吞噬体成熟的非特异性的标志物。图2是从活细胞的视频显微镜实验的静止图像，并示出了变化的数目C 的白色念珠菌个人J774.1巨噬细胞摄入。在这个实验中，82％J774.1巨噬细胞吞噬的至少一个C。白色念珠菌细胞在6小时的吞噬作用测定结束。在图3中的数量的内化C.白色念珠菌细胞每巨噬细胞的报道。的平均数C.白色念珠菌每巨噬细胞为3.4，但有趣的巨噬细胞可以摄取16真菌细胞， 图4是一个静止图像的序列，从有代表性的活细胞的视频显微镜实验示出了巨噬细胞吞噬C.白色念珠菌细胞与巨噬细胞和巨噬细胞最终裂解，菌丝生长， 图4示出视频显微镜使吞没的靶细胞后的事件的分析， 即数据可为き产生lling的巨噬细胞C.白色念珠菌菌丝在有关摄入的靶细胞的数量和形态发生的，以及如何巨噬细胞杀涉及可以实时研究吞噬体成熟。
图1。活细胞的吞噬作用C.视频显微镜电影念珠菌的小鼠J774.1巨噬细胞。巨噬细胞染色用红色荧光染料LysoTracker红色的DND-99，和C。染色用FITC（绿色） 白色念珠菌 。巨噬细胞和 C。 白色念珠菌共培养6小时的期间在37℃下在完全独立的CO 2 -介质。捕获的图像，在1分钟的时间间隔6小时。巨噬细胞建立与 C的细胞-细胞接触，可以看出白色念珠菌，随后是C 的吸收白色念珠菌为巨噬细胞的吞噬体。箭头指向为 C。 白色念珠菌之前J774.1巨噬细胞的吞噬。此视频还显示，FITC的荧光是quenc的的HED以下吞噬C.白色念珠菌 。比例尺，10微米。 点击这里观看电影 。
图2代表活细胞视频显微镜静止图像表示在由个别的巨噬细胞吞噬的白色念珠菌的数目变化。巨噬细胞（染色使用LysoTracker红色DND-99）共同培养与FITC染色C.白色念珠菌 （绿色）。存在偏差的情况的数目C 的白色念珠菌吞没（箭头旁边的数字表示吞没白色念珠菌的数目），和C 中白色念珠菌形态（ 即酵母的诗句菌丝）。比例尺，20微米。
图3图形示出的 C数白色念珠菌摄入每J774.1小鼠巨噬细胞的吞噬功能检测结束6小时。这些数据代表2个独立实验。一共有100个巨噬细胞计数从每个实验的3个领域，共600名个人的巨噬细胞。
图4。这一系列的图片，从有代表性的活细胞视频显微镜实验显示巨噬细胞（M）和C.白色念珠菌 （C）之前，在识别过程中（A，B），期间和之后的吸收（C，D）C.白色念珠菌菌丝内的巨噬细胞（E，F），这可能会导致在巨噬细胞裂解（G）的继续增长。其他的巨噬细胞被招募到破裂的部位，并试图摄取公布的C.白色念珠菌 （H）。是染色使用红色荧光染料LysoTrac的的巨噬细胞KER红色DND-99 和 C。染色用FITC（绿色） 白色念珠菌 。需要注意的是FITC染色淬火后，C.白色念珠菌 J774.1巨噬细胞（C）的吸收。比例尺，10微米。
Discussion
这里使用视频显微镜活细胞的方法研究巨噬细胞的吞噬能力。视频显微镜提供了多种附加层的信息进行分析。的一个基本优点是，摄取的数据在整个6小时观察期间的任何时间点，可以产生（从一个单一的实验）。更重要的是，所描述的方法使差分分析的各个阶段的吞噬作用。我们已经表明，例如，C 的整体摄取变动白色念珠菌的糖基化和巨噬细胞细胞系和原发性巨噬细胞的形态发生的突变体可以是一个后果，在巨噬细胞迁移的变化建立了细胞-细胞接触一次向靶细胞或吞噬率7。
有一些陷阱，以避免当进行这些实验。首先，这是非常重要的，以确保稳定的环境条件下，在整个实验的多项式dure。这是最好的实现中的环境的腔室，它被设置在开始实验之前，几个小时的实验条件。视频质量高度依赖于复杂的模块，使用红外激光器自动保持的样品的机械或热的变化，从而消除了手动对焦校正需要z位置，而不管。
鉴于扩展性的实验中，重要的是要限制激光曝光和相关联的光漂白及经光的影响，这可以最小化通过采用高度的荧光标记物，有利于低曝光时间。 FITC染色这里所描述的协议，快速和可靠的。作为FITC染色是一个非常光明的，稳定的，低的曝光时间是必需的，这使得FITC延长时间推移电影的理想选择。然而，我们经常使用各种不同的目标污渍，包括Calcofluor白和PKH染料标记的有机体。
在这项研究中，在1分钟的时间间隔超过6小时的吞噬功能测定图像被抓获。图像之间的时间间隔，可以调整根据调查过程下。例如，时间间隔进行查处时，可以降低快速过程，如小泡运输。显微镜和摄像头规格的最小时间间隔将被限制。有一些注意事项时，要牢记调节定时。首先，减少快照之间的时间间隔将意味着可以少点成像和文件的大小将大大增加。相反，增加的图像间隔太多会使的电影失去连续性。
这种方法可以应用原则上学习其他病原体和吸收的宿主细胞死亡。例如，我们最近的研究表明骨髓来源的巨噬细胞从sialoadhesin的基因敲除小鼠表现出极大地减少唾液酸化空肠弯曲菌的结合和吞噬。但是，目标的大小是一个重要的决定因素的可行性，减少靶细胞的大小，图像分析变得越来越困难。先进的图像分析软件是必不可少的快速视频显微镜分析，这应该加上适当的生物信息学的支持，方便的生成算法研究单个细胞和整个细胞群的迁移。活细胞视频显微镜在复杂的图像分析软件的迁移和单个细胞-巨噬细胞白念珠菌相互作用分钟按分钟分析相结合，提供了独特的复杂性C.白色念珠菌的巨噬细胞的吞噬作用ES。有巨大的潜力，以扩大这些方法来研究其他病原体和吞噬细胞（树突状细胞，嗜中性粒细胞），并更详细地或更多的生理，如上皮细胞和内皮细胞层的表面上的图像细胞 - 细胞相互作用的3D视频显微镜。这种技术的下一代工具在宿主 - 病原体相互作用的研究，将有助于生成详细的空间和时间信息，广泛的动态过程。
Disclosures
作者有没有透露。 NG是无限制的资金支持基础研究吉利德科学公司（Gilead Sciences）的收件人。 LE担任顾问，葛兰素史克公司在早期药物开发工作。
Acknowledgments
LPE是苏格兰高级临床研究员和承认的首席科学家，的办公室（SCD/03）的支持。这项工作是由威康信托基金会资助计划LPE（089930）。 NARG是由威康信托计划资助（080088）和设备补助金（075470）（DeltaVision的），并通过一个FP7-2007-2013格兰特（HEALTH-F2-2010-260338-ALLFUN）。我们想感谢阿伯丁大学的成像设备，尤其是凯文·麦肯齐，有益的支持和建议。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0402 | |
| NaOH | Sigma | S5881-500G | |
| Adenine hemisulphate salt | Sigma | A3159-25G | |
| Agar technical (no. 3) | Oxoid | LP0013 | |
| D-glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| SC-Ura dropout | Formedium | DSCK102 | |
| FITC | Sigma | F7250-1G | |
| Sodium carbonate | BDH | 301215M | |
| Sodium bicarbonate | BDH | 102475W | |
| PBS | Gibco | 18912-014 | |
| DMEM | Lonza | BE12-614F | |
| FCS | Life Technologies | 10106169 | |
| Penicillin/streptomycin | PAA | P11-010 | |
| L-glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
| 35 mm glass-dishes | PAA | PAA12305160X |
References
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