Summary
Vi beskriver metoder til live-cell video mikroskopi af
Abstract
Fagocytiske clearance af patogene svampe, og mikroorganismer mere generelt, kan anses for at bestå af fire forskellige faser: (i) migration af fagocytter til det sted, hvor patogener er placeret, (ii) anerkendelse af patogen-associerede molekylære mønstre (PAMPs) gennem mønster anerkendelse receptorer (PRRS), (iii) engulfment af mikroorganismer bundet til den fagocyt cellemembran, og (iv) behandling af opslugt celler inden modning phagosomes og fordøjelse af den indtagne partikel. Undersøgelser der vurderer fagocytose i sin helhed er informative 1, 2, 3, 4, 5 men er begrænset ved, at de ikke normalt bryde processen ned i migration, engulfment og phagosome modning, hvilket kan påvirkes differentielt. Endvidere disse undersøgelser vurderer optagelse som en enkelt begivenhed, snarere end som en kontinuerlig dynamisk proces. Vi har for nylig udviklet avancerede live-cell imaging teknologier, og har kombineret disse med genetisk funktionel analyse af bådepatogene og værtsceller for at skabe en tværgående platform til analyse af medfødte immuncelle funktion og fungal patogenese. Disse undersøgelser har afsløret hidtil ukendte aspekter af fagocytose, der kun kunne observeres ved hjælp af systematisk tidsmæssig analyse af de molekylære og cellulære vekselvirkninger mellem menneskelige fagocytter og svampepatogener og smitsomme mikroorganismer mere generelt. For eksempel har vi begyndt at angive følgende: (a) komponenterne af celleoverfladen kræves for hvert trin i processen anerkendelse, engulfment og drab af svampeceller 1, 6, 7, 8, (b) hvor overfladegeometri påvirker effektiviteten af makrofagoptagelse og drab af gær og svampetrådenes celler 7, og (c) hvor engulfment fører til ændring af cellecyklussen og opførsel af makrofager 9, 10.
I modsætning til enkelt tidspunkt snapshots, muliggør live-cell video mikroskopi mange forskellige værtsceller og patogener, der skal studeres som continuous sekvenser over lange tidsperioder, der giver rumlige og tidsmæssige oplysninger om en bred vifte af dynamiske processer, herunder celle migration, replikering og vesikulær menneskehandel. Her beskriver vi i detaljer, hvordan man forbereder vært og svampeceller, og foretage video mikroskopi eksperimenter. Disse fremgangsmåder kan give en bruger-guide for fremtidige undersøgelser med andre fagocytter og mikroorganismer.
Protocol
1. C. albicans Vækst og Betingelser
- Forbered SC-ura-agarplader ved tilsætning af 6,9 g gærnitrogenbase uden aminosyrer, 1 ml 1 M NaOH, 10 ml 1% (vægt / volumen) adenin hemisulfatsaltet og 20 g teknisk agar (tidligere beskrevet i detaljer i 11). Make up volumen til 900 ml med destilleret H 2 O. Autoklave, tillade agar til afkøling, men ikke nok til at størkne, og derefter tilsættes 50 ml steril 40% D-glucose og 50 ml steril 4% SC-Ura frafald under aseptiske forhold. Blandes og hældes i petriskåle og lade agarplader at afkøle og størkne. Store agarplader ved 5 ° C indtil anvendelse.
- Streak C. albicans serotype A, stamme CAI4 + CIp10 fra glycerol lagre opbevaret ved -80 ° C på SC-ura agarplade.
- Inkuber plade ved 30 ° C, indtil kolonier form og opbevares ved 5 ° C.
- Kultur en enkelt C. albicans koloni i 5 ml SC-Ura medium (opskrift som i 1,1, men uden teknisk agar) og inkuberes natten over ved 30° C, 200 rpm at generere stationær fase C. albicans.
2. C. albicans farvning under anvendelse af fluorescein isothiocyanat (FITC)
- Tilsæt 10 gl C. albicans kultur natten over til 990 pi PBS (pH 7,4) og udføre en celletælling ved hjælp af et hæmocytometer.
- At hjælpe visualisering af C. albicans under fagocytose assays, plet 1 × 10 8 C. albicans med 1 mg / ml FITC i 0,05 M carbonat-bicarbonat-buffer (pH 9,6) i 10 minutter ved stuetemperatur i mørke.
- For at fjerne ubundet FITC, vaske C. albicans i 1 ml 1 x PBS, centrifugeres ved 3.000 x g i 5 min, fjerne supernatanten og resuspender pellet i 1 ml 1 x PBS. Gentag 3 gange.
- Resuspender pellet ved 1 x 10 6 celler / gl i 1 x PBS.
3. Fremstilling af J774.1 Mouse makrofagcellelinie
- Opretholde J774.1 makrofager i 75 cm2 vævdyrkningskolber i DMEM-medium suppleret med 10% (volumen / volumen) føtalt kalveserum (FCS), 200 U / ml penicillin / streptomycin og 2 mM L-glutamin ved 37 ° C med 5% CO2. Fremstillingen af primære makrofager er beskrevet andetsteds i detaljer 12, 13.
- Skrabe J774.1-celler fra vævsdyrkningskolben og overføres til et 50 ml Falcon-rør. Der centrifugeres ved 600 x g i 5 minutter for at opnå en cellepellet.
- Fjern supernatanten og resuspender pelleten i 10 ml forvarmet suppleret DMEM-medium. Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer og plade 1 × 10 6 J774.1 makrofager i 2 ml suppleret DMEM-medium i et 35 mm glas-baserede imaging skålen. Inkuber natten over ved 37 ° C, 5% CO2.
- Forud for billeddannelse, erstatte suppleret DMEM-medium med 2 ml forvarmet suppleret CO2-uafhængigt medium (med 10% (volumen / volumen) føtalt kalveserum (FCS), 200 U / ml penicillin / streptomycin og 2 mM L-glutamin) indeholdende 1 uM LysoTracker Red DND-99.
4. Live-Cell Video Microscopy fagocytose Assay
- Valget af mikroskop vil afhænge af, hvad der er til rådighed lokalt, men mikroskopet opsætningen skal inkludere en omvendt fase, et miljøkammer opvarmet til 37 ° C og excitation / emission filtre til de valgte pletter (FITC og TRITC).
- Tænd mikroskopet varmelegeme inden forsøget og give tilstrækkelig tid til den miljømæssige styrekammeret at varme op til 37 ° C. Den tid det tager for kammertemperatur at stabilisere vil variere for forskellige mikroskop opsætninger.
- Tænd mikroskopet og computer, og indlæse imaging software. Monter imaging skålen på objektbordet og justere fokus for at finde de J774.1 makrofager. Optimere udseendet af TRITC og DIC billeder ved at justere procentdelen af transmitteret lys og eksponeringstider.
- Tag billedtromlen skålen og tilsæt 3 × 10 6 FITC-farvede C. albicans til than fad. Registrere den tid, C. albicans tilsættes til skålen. Returnér parabol til scenen og optimere udseendet af FITC billeder, hvis det er nødvendigt. Opsæt et pointsystem liste, hvis det kræves.
- Påbegynde billeddannelse, når alle punkter er i fokus, og kanalerne er optimeret. Capture FITC, TRITC og DIC billeder hvert minut i 6 timer.
Representative Results
Her viser vi repræsentative resultater for C. albicans optagelse af en murin makrofag cellelinie J774.1 løbet af en 6 timers live-cell video mikroskopi eksperiment. Figur 1 er et repræsentativt live-cell video mikroskopi film, der viser fagocytose af C. albicans fra murine J774.1 makrofager. Live-cell video mikroskopi muliggør internalisering af C. albicans skal visualiseres uden at det er nødvendigt at farve ekstern Candida. Men i disse eksperimenter C. albicans blev farvet ved anvendelse af den pH-følsomme farvestof FITC (grøn), som er standset ved syrning af makrofag phagosome, og letter bekræftelse af, at Candida er blevet internaliseret (fig. 1). For yderligere hjælp visualisering af indtaget C. albicans, makrofager blev farvet med den røde fluorescerende farvestof LysoTracker red DND-99, der farver sure rum, og tjener som en ikke-specifik markør for phagosome modning.Figur 2 er et stillbillede fra en live-cell video mikroskopi eksperiment og illustrerer variationen i antallet af C. albicans indtages af individuelle J774.1 makrofager. I dette eksperiment, omspændt 82% af J774.1 makrofager mindst en C. albicans celle ved slutningen af det 6 timer fagocytose-assay. I figur 3, at antallet af internaliserede C. albicans celler pr makrofag er rapporteret. Det gennemsnitlige antal C. albicans optaget pr makrofag er 3,4, men interessant makrofager kan indtage op til 16 svampeceller. Figur 4 er en sekvens af stillbilleder fra en repræsentativ live-cell video mikroskopi eksperiment, der viser en makrofag phagocytosing C. albicans celler, hypha vækst med makrofag og i sidste ende makrofag lysis. Figur 4 illustrerer, at video-mikroskopi muliggør analyse af begivenhederne efter omslutning af målceller, kan dvs. data frembringes for killing af makrofager ved C. albicans hyfer i forhold til antallet og morfogenese af indtagne målceller, og hvordan makrofag drab angår phagosome modning som kan studeres i realtid.
Figur 1. Live-cell video mikroskopi film viser fagocytose af C. albicans fra murine J774.1 makrofager. Makrofager farves med den røde fluorescerende farvestof LysoTracker rød DND-99, og C. albicans farves ved hjælp af FITC (grøn). Makrofager og C. albicans blev dyrket for en periode på 6 timer ved 37 ° C og i CO2-uafhængigt medium. Billeder blev taget med 1 min intervaller i 6 timer. Makrofager kan ses om celle-celle-kontakt med C. albicans, som derefter efterfølges af optagelse af C. albicans i makrofag phagosomes. Pile peger på C. albicans inden omslutning af J774.1 makrofager. Denne video viser også, at FITC-fluorescens er quenched efter omslutning af C. albicans. Scale bar, 10 um. Klik her for at se film .
Figur 2. Repræsentant live-cell video mikroskopi stillbillede viser variationen i antallet af C.albicans opslugt af individuelle makrofager. Makrofager (farvet under anvendelse LysoTracker red DND-99) blev dyrket sammen med FITC-farvede C. albicans (grøn). Der er variation i antallet af C. albicans omspændt (et tal ud for en pil indikerer antallet af C. albicans omspændt), og C. albicans morfologi (dvs. gær vers hypha). Scale bar, 20 um.
Figur 3. Graf, der viser antallet af C. albicans indtaget per J774.1 murin makrofag ved slutningen af 6 timer fagocytose assays. Dataene repræsenterer to uafhængige forsøg. I alt 100 makrofager blev talt fra 3 felter fra hvert eksperiment, hvilket giver i alt 600 individuelle makrofager.
Fig. 4. En serie billeder fra et repræsentativt live-cell video mikroskopi eksperiment, der viser en makrofag (M) og C. albicans (C) før og under anerkendelse (A, B), og under og efter optagelse (C, D). C. albicans hyfer fortsætte med at vokse inden for makrofagen (E, F), hvilket kan resultere i makrofag lysis (G). Andre makrofager rekrutteres til stedet for brud og forsøg på at indtage den frigivne C. albicans (H). Makrofager farves med den røde fluorescerende farvestof LysoTracker rød DND-99, og C. albicans farves ved hjælp af FITC (grøn). Bemærk, at FITC-farvning standses efter C. albicans optagelse ved J774.1 makrofager (C). Scale bar, 10 um.
Discussion
Her fremgangsmåden til anvendelse af levende-celle video mikroskopi at undersøge makrofag-fagocytose er beskrevet. Video mikroskopi tilbyder flere ekstra lag af information til analyse. En grundlæggende fordel er, at optagelses-data kan genereres (fra et enkelt eksperiment) for ethvert tidspunkt gennem 6 timers observationsperiode. Hvad vigtigere er, den beskrevne metode muliggør differentieret analyse af de enkelte faser af fagocytose. Vi har for eksempel vist, at ændringer af den samlede optagelse af C. albicans glycosylering og morfogenese mutanter af makrofagcellelinier og primære makrofager kan enten være en følge af ændringer i makrofag migration hen imod målceller eller hastigheden af engulfment når celle-celle-kontakt er etableret 7.
Der er en række faldgruber for at undgå, når de foretager disse eksperimenter. For det første er det meget vigtigt at sikre stabile miljøforhold i forsøgsperioden procedure. Dette opnås bedst i et klimakammer, der er indstillet til de eksperimentelle betingelser flere timer før påbegyndelse af forsøget. Video kvalitet er meget afhængig af avancerede moduler, der bruger infrarøde lasere til automatisk at opretholde prøven z-position uanset mekaniske eller termiske forandringer hvilket eliminerer behovet for manuel fokus korrektioner.
I betragtning af den udvidede karakter af forsøgene er det vigtigt at begrænse laserlys eksponering og fotoblegning og fotoomdannelse virkninger, som kan minimeres ved anvendelse af stærkt fluorescerende markører, som letter lav eksponeringstider. Den FITC farvningsprotokol beskrevet her er hurtig og pålidelig. Da FITC er en meget lys og stabil pletten, lave eksponeringstider er påkrævet, og det gør FITC ideel til længere time-lapse film. Men vi anvender rutinemæssigt en række forskellige mål pletter, herunder Calcofluor White og PKH farvestoffer samt mærkede organismer.
Under denne undersøgelse blev billeder optaget med 1 min intervaller over en 6 timers fagocytose-assay. Intervallet mellem billeder kan justeres afhængig af processen, der undersøges. For eksempel kan intervallet nedsættes, når de efterforsker hurtige processer såsom vesikulær menneskehandel. Det mindste tidsinterval vil blive begrænset af mikroskop og kameraet specifikationer. Der er nogle overvejelser at huske på, når justering tider. Først vil mindske intervallet mellem snapshots betyde færre point kan afbildes og filstørrelse vil blive væsentligt forøget. Tværtimod vil øge billedet interval for meget make filmen mister kontinuitet.
Denne fremgangsmåde kan anvendesi princippet til at studere andre patogener og optag af døende værtsceller. For eksempel har vi for nylig vist, at knoglemarvsceller afledte makrofager fra sialoadhesin-deficiente mus i høj grad udviser reduceret binding og fagocytose af sialyleret Campylobacter jejuni 8. Imidlertid målstørrelse er en vigtig determinant for gennemførligheden, som billedanalyse bliver stadig sværere med en reduktion i målcelle størrelse. Sofistikeret billede analyse software er afgørende for hurtig video mikroskopi analyse, og dette bør kombineres med passende bioinformatik til fremme af generation af algoritmer til at studere migration af de enkelte celler og hele cellepopulationer 7. Live-celle video mikroskopi i kombination med sofistikeret billede analyse software til minut-for-minut analyse af migration og individuelle makrofag-C.albicans interaktioner, giver unik indsigt i kompleksiteten af C. albicans fagocytose af macrophages. Der er et enormt potentiale for at udvide disse metoder til at studere andre patogener og fagocytter (dendritiske celler, neutrofile) og at udvikle 3D-video mikroskopi til billede celle-celle interaktioner i nærmere eller på flere fysiologiske overflader, såsom epitel og endotel cellelag. Denne teknik er en del af den næste generation af værktøjer i studiet af værtspatogene interaktioner og vil hjælpe med at generere detaljerede rumlige og tidsmæssige oplysninger om en bred vifte af dynamiske processer.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre. NG er en modtager af ubegrænset bevilling støtte til grundforskning af Gilead Sciences. LE arbejder som konsulent for GSK i tidlig udvikling af lægemidler.
Acknowledgments
LPE er en skotsk Senior Clinical Fellow og anerkender støtte fra Chief Scientist Office (SCD/03). Dette arbejde blev finansieret af Wellcome Trust Project Grant til LPE (089.930). NARG blev finansieret af en Wellcome Trust Programme Grant (080.088) og et udstyr Grant (075.470) (for DeltaVision), og ved et FP7-2007-2013 Grant (HEALTH-F2-2010 til 260.338-Allfun). Vi vil gerne takke University of Aberdeen imaging facilitet, og især Kevin MacKenzie, for hjælp og støtte og rådgivning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0402 | |
| NaOH | Sigma | S5881-500G | |
| Adenine hemisulphate salt | Sigma | A3159-25G | |
| Agar technical (no. 3) | Oxoid | LP0013 | |
| D-glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| SC-Ura dropout | Formedium | DSCK102 | |
| FITC | Sigma | F7250-1G | |
| Sodium carbonate | BDH | 301215M | |
| Sodium bicarbonate | BDH | 102475W | |
| PBS | Gibco | 18912-014 | |
| DMEM | Lonza | BE12-614F | |
| FCS | Life Technologies | 10106169 | |
| Penicillin/streptomycin | PAA | P11-010 | |
| L-glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
| 35 mm glass-dishes | PAA | PAA12305160X |
References
- McKenzie, C. G. J., et al. Contribution of Candida albicans cell wall components to recognition by and escape from murine macrophages. Infect. Immun. 78, 1650-1658 (2010).
- Mora-Montes, H. M., et al. Recognition and blocking of innate immunity cells by Candida albicans chitin. Infect. Immun. 79, 1961-1970 (2011).
- Keppler-Ross, S., et al. Recognition of yeast by murine macrophages requires mannan but not glucan. Eukaryot. Cell. 9, 1776-1787 (2010).
- Vijayan, D., et al. Mincle polarizes human monocyte and neutrophil responses to Candida albicans. Immunol. Cell Biol. , (2012).
- Seider, K., et al. The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation. J. Immunol. 187, 3072-3086 (2011).
- Sheth, C., et al. Glycosylation status of the C. albicans cell wall affects the efficiency of neutrophil phagocytosis and killing but not cytokine signalling. Med. Mycol. (5), 513-524 (2011).
- Lewis, L. E. Stage specific assessment of Candida albicans phagocytosis by macrophages identifies cell wall composition and morphogenesis as key determinants. PLoS Pathog. 8 (3), e1002578 (2012).
- Klaas, M., et al. Sialoadhesin Promotes Rapid Proinflammatory and Type I Interferon Responses to a Sialylated Pathogen, Campylobacter jejuni. J. Immunol. , In Press (2012).
- Lewis, L. E., et al. Candida albicans infection inhibits macrophage cell division and proliferation. Fungal Genet. Biol. , (2012).
- Bain, J. M., et al. Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages. Fungal Genet. Biol. , (2012).
- Mora-Montes, H., et al. Interactions between macrophages and cell wall oligosaccharides of Candida albicans. Methods Mol. Biol. 845, 247-260 (2012).
- McPhillips, K., et al. Assessment of apoptotic cell phagocytosis by macrophages. Methods Mol. Biol. 559, 247-256 (2009).
- Erwig, L. -P., et al. Differential regulation of phagosome maturation in macrophages and dendritic cells mediated by Rho GTPases and ezrin-radixin-moesin (ERM) proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (34), 12825-12830 (2006).
