Summary
Wir beschreiben Methoden für Live-Cell-Video-Mikroskopie
Abstract
Phagozytische Abstand von pilzlichen Pathogenen und Mikroorganismen allgemein kann als aus vier verschiedenen Phasen bestehen: (i) die Migration von Phagozyten an den Ort, wo Krankheitserreger befinden, (ii) die Anerkennung der pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) durch Muster Erkennungsrezeptoren (PRRs), (iii) engulfment von Mikroorganismen gebunden an den Phagozyten Zellmembran, und (iv) Verarbeitung des Reifung verschlungen Zellen innerhalb Phagosomen und Verdauung der eingenommenen Teilchens. Studien, die Phagozytose Beurteilung in seiner Gesamtheit sind informativ 1, 2, 3, 4, 5, aber begrenzt sind, dass sie in der Regel nicht zu brechen den Vorgang ab in die Migration, engulfment und Phagosomenreifung, die unterschiedlich betroffen sein. Weiterhin Messung solcher Studien Aufnahme als ein einziges Ereignis, und nicht als ein kontinuierlicher dynamischer Prozess. Wir haben vor kurzem erweiterten Live-Cell-Imaging-Technologien entwickelt und kombiniert haben diese mit genetischen funktionelle Analyse von sowohlErreger und Wirtszellen, um eine übergreifende Plattform für die Analyse des angeborenen Immunsystems Zellfunktion und Pathogenität von Pilzen. Diese Studien haben neue Aspekte der Phagozytose, die nur beobachtet, wenn systematische zeitliche Analyse der molekularen und zellulären Interaktionen zwischen menschlichen Phagozyten und pilzlichen Krankheitserregern und infektiösen Mikroorganismen allgemein werden konnte aufgedeckt. Zum Beispiel haben wir begonnen, folgendes zu definieren: (a) die Komponenten der Zelloberfläche für jede Stufe des Prozesses der Erkennung, engulfment und Tötung von Pilzzellen 1, 6, 7, 8 erforderlich, (b), wie Oberflächengeometrie Einfluss auf die Effizienz der Makrophagen Aufnahme und Tötung von Hefe und Hyphen Zellen 7 und (c) wie engulfment führt zu Veränderungen des Zellzyklus und das Verhalten der Makrophagen 9, 10.
Im Gegensatz zum einzigen Zeitpunkt Momentaufnahmen, ermöglicht die Live-Video-Mikroskopie Zelle eine Vielzahl von Wirtszellen und Pathogenen als Co untersuchendenntinuous Sequenzen über längere Zeiträume, eine räumliche und zeitliche Informationen über eine breite Palette von dynamischen Prozessen, einschließlich der Zellmigration, Replikation und Vesikeltransport. Hier beschreiben wir detailliert, wie Host-und Pilzzellen vorzubereiten, und die Video-Mikroskopie Experimente durchzuführen. Diese Methoden können eine Benutzer-Leitfaden für künftige Studien mit anderen Phagozyten und Mikroorganismen.
Protocol
Ein. C. albicans Wachstum und AGB
- Planen SC Ura-Agarplatten, indem 6,9 g Yeast Nitrogen Base ohne Aminosäuren, 1 ml 1 M NaOH, 10 ml 1% (w / v) adenin Hemisulfat-Salz und 20 g technisches Agar (zuvor ausführlich in 11 beschrieben). Make-up Volumen auf 900 ml mit destilliertem H 2 O. Autoklaven ermöglichen Agar abkühlen, aber nicht genug, sich zu verfestigen, und fügen Sie dann 50 ml sterile 40% D-Glucose und 50 ml sterile 4% SC-Ura Dropout unter aseptischen Bedingungen. Mischen, in Petrischalen gießen und verlassen Agarplatten zu kühlen und zu verfestigen. Laden Agarplatten bei 5 ° C bis zur Verwendung.
- Streak C. albicans Serotyp Stamm CAI4 + CIp10 aus Glycerinstammkulturen bei -80 ° C auf SC Ura-Agar-Platte.
- Inkubieren Platte bei 30 ° C bis Kolonien bilden und speichern bei 5 ° C.
- Kultur ein einziges C. albicans-Kolonie in 5 ml SC-URA-Medium (Rezeptur wie in 1.1, aber ohne technische Agar) und Inkubation über Nacht bei 30° C, 200 Upm bis zur stationären Phase C zu erzeugen albicans.
2. C. albicans Färbung mit Fluorescein Isothiocyanate (FITC)
- Fügen Sie 10 ul C. albicans Übernachtkultur zu 990 ul PBS (pH 7,4) und führen eine Zellzahl unter Verwendung eines Hämozytometers.
- Zur Visualisierung von C. helfen albicans während Phagozytose-Assays, Fleck 1 × 10 8 C. albicans unter Verwendung von 1 mg / ml FITC in 0,05 M Carbonat-Bicarbonat-Puffer (pH 9,6) für 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
- Um ungebundenen FITC entfernen, waschen C. albicans in 1 ml 1 x PBS, Zentrifuge bei 3.000 × g für 5 min, entfernen Überstand und Pellet in 1 ml 1 x PBS. 3 Mal wiederholen.
- Pellet bei 1 × 10 6 Zellen / ul in 1 x PBS.
3. Herstellung des J774.1 Maus-Makrophagen-Zelllinie
- Pflegen J774.1 Makrophagen in 75 cm 2 GewebeKulturflaschen in DMEM-Medium mit 10% (v / v) fötalem Kälberserum (FCS), 200 U / ml Penicillin / Streptomycin und 2 mM L-Glutamin bei 37 ° C mit 5% CO 2. Die Herstellung der primären Makrophagen anderer Stelle im Detail 12, 13 beschrieben.
- Kratzen J774.1 Zellen aus der Zellkulturflasche und übertragen auf eine 50 ml-Falcon-Röhrchen. Zentrifuge bei 600 × g für 5 min, um eine Zelle Pellet zu erhalten.
- Überstand entfernen und Pellet in 10 ml vorgewärmten ergänzt DMEM Medium. Zählen von Zellen mit einem Hämocytometer und Platte 1 × 10 6 J774.1 Makrophagen in 2 ml ergänzt DMEM-Medium in einer 35 mm Glas-basierten Imaging Gericht. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2.
- Vor der Bebilderung, ersetzen ergänzt DMEM-Medium mit 2 ml vorgewärmt ergänzt CO 2-unabhängiges Medium (mit 10% (v / v) fötalem Kälberserum (FCS), 200 U / ml Penicillin / Streptomycin und 2 mM L-Glutamin) mit 1 uM LysoTracker Red DND-99.
4. Live Cell Video Microscopy Phagozytose Assay
- Die Wahl des Mikroskops wird auf das, was lokal verfügbar ist, sondern das Mikroskop Setup benötigen, um eine invertierte Bühne, ein Klimakammer erhitzt bis 37 zählen ° C und Anregung / Emission Filter für die ausgewählten Flecken (FITC und TRITC).
- Einschalten des Mikroskops Heizeinrichtung vor dem Experiment und wenn genügend Zeit für die Umwelt Steuerkammer auf 37 ° C erwärmen Die Zeit für Kammertemperatur zu stabilisieren getroffen werden für verschiedene Mikroskop Setups variieren.
- Schalten Sie das Mikroskop und Computer, und laden Sie die Imaging-Software. Montieren Sie den Imaging-Schüssel auf dem Mikroskoptisch und stellen Sie den Fokus auf die J774.1 Makrophagen zu finden. Optimieren das Aussehen TRITC und DIC Bildern durch Einstellen des Prozentsatzes von übertragenem Licht und Belichtungszeiten.
- Entfernen Sie die Imaging-Schüssel und fügen Sie 3 × 10 6 FITC gefärbten C. albicans bis ter austeilen. Notieren Sie sich die Zeit, dass C. albicans ist zu der Schale hinzugefügt. Bringen Sie den Teller auf die Bühne und optimieren das Erscheinungsbild der FITC Bilder, wenn nötig. Richten Sie eine Punkteliste, falls erforderlich.
- Abbildungssystem beginnen, wenn alle Punkte in Fokus sind, und die Kanäle optimiert sind. Erfassen FITC, TRITC und DIC Bilder pro Minute für 6 Stunden.
Representative Results
Hier zeigen wir repräsentative Ergebnisse für C. albicans Aufnahme durch einen murinen Makrophagen-Zelllinie J774.1 während einer 6 Stunden lebenden Zellen Videomikroskopie Experiment. Abbildung 1 ist eine repräsentative lebenden Zellen Videomikroskopie Film und zeigt Phagozytose von C. albicans by murine J774.1 Makrophagen. Live-cell Videomikroskopie können Internalisierung von C. albicans zu sein, ohne die Notwendigkeit, externe Candida Färbung visualisiert. jedoch während dieser Experimente, C. albicans wurde angefärbt unter Verwendung des pH-empfindlichen Farbstoff FITC (grün), die während des Ansäuerns des Makrophagen Phagosom abgeschreckt wird, und erleichtert eine Bestätigung, dass Candida internalisiert wurde (Abbildung 1). Zur weiteren Unterstützung Visualisierung der aufgenommenen C. albicans, Makrophagen wurden angefärbt unter Verwendung des roten Fluoreszenzfarbstoff LysoTracker roten DND-99, welche Flecken sauren Abteile und dient als ein nicht-spezifischer Marker für Phagosomenreifung.2 ist ein Standbild von einer Live-Video-Mikroskopie Zelle Experiment und veranschaulicht die Veränderung in der Anzahl von C. albicans eingenommen durch einzelne J774.1 Makrophagen. In diesem Experiment wurden 82% der verschlungen J774.1 Makrophagen mindestens eine C albicans-Zelle am Ende der 6 h Phagozytose Assay. In Abbildung 3 ist die Zahl der verinnerlichten C. albicans Zellen pro Makrophagen gemeldet. Die mittlere Anzahl der C. albicans pro up Makrophagen aufgenommen ist 3,4, aber interessanterweise Makrophagen kann Ingest bis 16 Pilzzellen. Abbildung 4 ist eine Folge von Standbildern von einer repräsentativen lebenden Zellen Videomikroskopie Experiment zeigt eine Makrophagen phagozytierenden C. albicans-Zellen, Hyphe Wachstum mit der Makrophagen und letztlich Makrophagen Lyse. Abbildung 4 zeigt, dass Videomikroskopie ermöglicht die Analyse von Ereignissen nach engulfment von Zielzellen, dh Daten des ki erzeugt werdenlling von Makrophagen durch C. albicans Hyphen in Bezug auf die Anzahl der aufgenommenen und Morphogenese Zielzellen und wie Makrophagen Tötung betrifft Phagosomenreifung die in Echtzeit untersucht werden kann.
Abbildung 1. Live-cell Videomikroskopie Film zeigt Phagozytose von C. albicans by murine J774.1 Makrophagen. Makrophagen sind gefärbt mit dem roten Fluoreszenzfarbstoff LysoTracker roten DND-99 und C albicans gefärbt mit FITC (grün). Makrophagen und C. albicans wurden für einen Zeitraum von 6 h bei 37 ° C co-kultiviert in vollständiger CO 2-unabhängiges Medium. Die Bilder wurden bei 1 min Intervalle für 6 Stunden gefangen. Makrophagen ersichtlich Einrichtung Zell-Zell-Kontakt mit C werden albicans, die dann durch Aufnahme von C folgt albicans in Makrophagen Phagosomen. Pfeile zeigen auf C. albicans vor durch J774.1 Makrophagen Phagozytose. Dieses Video zeigt auch, dass FITC Fluoreszenz QuEnched folgenden engulfment von C. albicans. Maßstab, 10 um. Klicken Sie hier, um Film anzusehen .
Abbildung 2. Repräsentative lebenden Zellen Videomikroskopie Standbild zeigt Variierung in der Anzahl von C.albicans durch einzelne Makrophagen verschlungen. Makrophagen (gebeizt mit LysoTracker roten DND-99) wurden mit FITC-gefärbte C. co-kultiviert albicans (grün). Es gibt Schwankungen in der Anzahl von C. albicans verschlungen (eine Zahl neben einem Pfeil zeigt die Anzahl von C. albicans verschlungen) und in C. albicans Morphologie (dh Hefe Verse Hyphen). Maßstab, 20 mm.
Abbildung 3. Graph zeigt die Anzahl der C. albicans pro Einnahme J774.1 murinen Makrophagen am Ende der 6 h Phagozytose Assays. Die Daten repräsentieren 2 unabhängigen Experimenten. Insgesamt 100 Makrophagen wurden aus 3 Felder aus jedem Experiment gezählt, was eine Gesamtzahl von 600 einzelnen Makrophagen.
Abbildung 4. Eine Reihe von Bildern von einer repräsentativen lebenden Zellen Videomikroskopie Experiment zeigt eine Makrophagen (M) und C. albicans (C) vor und während der Erkennung (A, B), und während und nach der Aufnahme (C, D). C. albicans Hyphen weiterhin im Makrophagen-(E, F), die in Makrophagen Lyse (G) führen können wachsen. Andere Makrophagen gezielt zum Ort des Bruches und versuchen, den Freigabe C. Ingest rekrutiert albicans (H). Makrophagen sind gefärbt mit dem roten Fluoreszenzfarbstoff LysoTracker roten DND-99 und C albicans gefärbt mit FITC (grün). Beachten Sie, dass FITC Färbung nach C abgeschreckt albicans Aufnahme durch Makrophagen J774.1 (C). Maßstab, 10 mm.
Discussion
Hier wird das Verfahren für die Verwendung von lebenden Zellen zu Makrophagen Videomikroskopie Phagozytose zu untersuchen beschrieben. Video-Mikroskopie bietet mehrere zusätzliche Schichten von Informationen für die Analyse. Ein wesentlicher Vorteil ist, dass die Aufnahme von Daten erzeugt werden (aus einem einzigen Experiment) für jeden Zeitpunkt während des Beobachtungszeitraums von 6 Stunden werden. Noch wichtiger ist, ermöglicht das beschriebene Verfahren differentiellen Analyse der einzelnen Phasen der Phagozytose. Wir haben zum Beispiel gezeigt, dass Veränderungen in der gesamten Aufnahme von C. albicans Glykosylierung und Morphogenese Mutanten durch Makrophagen Zelllinien und primäre Makrophagen kann entweder eine Folge von Änderungen der Makrophagen-Migrations-Richtung Zielzellen oder Rate von einmal engulfment Zell-Zell-Kontakt hergestellt 7 sein.
Es gibt eine Anzahl von Fallen zu vermeiden, wenn die Durchführung dieser Versuche. Erstens ist es sehr wichtig, um stabile Umgebungsbedingungen über den Versuchszeitraum Verfah sicherzustellenDure. Dies wird am besten in einer Klimakammer, die den experimentellen Bedingungen mehrere Stunden vor Beginn des Experiments eingestellt ist erreicht. Video Qualität ist stark abhängig von anspruchsvollen Module, Infrarot-Laser verwenden, um automatisch die Probe z-Position, unabhängig von mechanischen oder thermischen Veränderungen wodurch die Notwendigkeit für manuelle Fokussierung Korrekturen.
Angesichts der verlängerte Natur der Experimente ist es wichtig, Laserlicht ausgesetzt und die damit verbundenen Photobleichen und Photokonversion Effekte, die durch den Einsatz stark fluoreszierende Marker, die geringer Belichtungszeiten erleichtern minimiert werden kann, einschränken. Die FITC Färbung hier beschriebene Protokoll ist schnell und zuverlässig. Als FITC ist ein sehr helles und stabile Fleck, niedrige Belichtungszeiten erforderlich sind und dies macht FITC ideal für ausgedehnte Zeitraffer-Filme. Allerdings verwenden wir routinemäßig eine Vielzahl von verschiedenen Ziel-Flecken, einschließlich Calcofluor Weiß und PKH Farbstoffe sowie getaggt Organismen.
Während dieser Studie wurden Bilder von 1 min Intervallen über einen 6 h Phagozytose Assay erfasst. Das Intervall zwischen den Bildern kann angepasst je nach Verfahren untersucht werden. Zum Beispiel kann der Abstand verringert, wenn die Untersuchung schnelle Prozesse, wie Vesikeltransport werden. Das minimale Zeitintervall wird von Mikroskop und Kamera Spezifikationen. Es gibt einige Überlegungen zu bedenken, beim Einstellen Timings. Zunächst wird die Verringerung der Abstand zwischen Snapshots bedeutet weniger Punkte abgebildet werden können und die Dateigröße erheblich erhöht werden. Im Gegenteil, wird die Erhöhung der Bild-Intervall zu viel machen den Film zu verlieren Kontinuität.
Dieser Ansatz kann angewendet werdenim Prinzip zu studieren anderen Krankheitserregern und die Aufnahme von sterbenden Wirtszellen. Zum Beispiel haben wir vor kurzem gezeigt, dass Knochenmark-Makrophagen aus Sialoadhesin-defizienten Mäusen erheblich weisen verminderte Bindung und Phagozytose von sialylierten Campylobacter jejuni 8. Jedoch ist Zielgröße eine wichtige Determinante für Durchführbarkeit als Bildanalyse wird zunehmend schwieriger mit einer Reduzierung der Zielzelle skalieren. Anspruchsvolle Bildanalysesoftware notwendig für schnelle Videomikroskopie Analyse, und dies sollte mit entsprechenden Bioinformatik Träger gekoppelt werden, um die Erzeugung von Algorithmen, um die Migration der einzelnen Zellen und ganzen Zellpopulationen 7 studieren erleichtern. Live-cell Videomikroskopie in Kombination mit anspruchsvollen Bildanalyse-Software für die von Minute zu Minute Analyse von Migration und individuellen Makrophagen-C.albicans Interaktionen, bietet einen einzigartigen Einblick in die Komplexität von C. albicans Phagozytose durch macrophages. Es gibt ein enormes Potenzial, um diese Methoden zu erweitern, um andere Krankheitserreger und Fresszellen (dendritische Zellen, Neutrophile) zu studieren und 3D-Video-Mikroskopie Bild Zell-Zell-Interaktionen näher oder mehr physiologischen Oberflächen wie Epithel-und Endothelzellen Schichten zu entwickeln. Diese Technik ist Teil der nächsten Generation von Werkzeugen in der Studie der Wirt-Pathogen-Interaktionen und wird dazu beitragen detaillierte räumliche und zeitliche Informationen über eine breite Palette von dynamischen Prozessen.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren. NG ist ein Empfänger des uneingeschränkten Zuschüsse für die Grundlagenforschung von Gilead Sciences. LE arbeitet als Berater für GSK in der frühen Entwicklung von Medikamenten.
Acknowledgments
LPE ist ein schottischer Senior Clinical Fellow und erkennt die Unterstützung des Chief Scientist Office (SCD/03). Diese Arbeit wurde vom Wellcome Trust Project Grant LPE (089.930) finanziert. NarG wurde von einem Wellcome Trust Programm Grant (080.088) und einer Ausrüstung Grant (075.470) (für DeltaVision), und durch eine FP7-2007-2013 Grant (HEALTH-F2-2010 bis 260.338-Allfun) finanziert. Wir würden gerne die University of Aberdeen Bildgebung Anlage, insbesondere Kevin MacKenzie, für hilfreiche Unterstützung und Beratung danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0402 | |
| NaOH | Sigma | S5881-500G | |
| Adenine hemisulphate salt | Sigma | A3159-25G | |
| Agar technical (no. 3) | Oxoid | LP0013 | |
| D-glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| SC-Ura dropout | Formedium | DSCK102 | |
| FITC | Sigma | F7250-1G | |
| Sodium carbonate | BDH | 301215M | |
| Sodium bicarbonate | BDH | 102475W | |
| PBS | Gibco | 18912-014 | |
| DMEM | Lonza | BE12-614F | |
| FCS | Life Technologies | 10106169 | |
| Penicillin/streptomycin | PAA | P11-010 | |
| L-glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
| 35 mm glass-dishes | PAA | PAA12305160X |
References
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