Summary
En simpel metode til at etablere den primære murine colontumor organoid beskrives. Denne metode udnytter den funktion, der colontumorceller overleve og vokse ind organoids i medier indeholder begrænsede vækstfaktorer, mens normal colon epitel ikke.
Abstract
Adskillige humane og murine coloncancer cellelinier er blevet etableret, er fysiologisk integritet tyktarmstumorer såsom flere cellelag, basal-apikal polaritet, evne til at skelne, og anoikis ikke vedligeholdes i tyktarmskræft afledte cellelinier. Den foreliggende undersøgelse viser en metode til dyrkning af primære muse colontumorceller organoids tilpasset fra Sato T et al. 1, som bevarer vigtige fysiologiske funktioner i colontumorer. Denne metode består af muse kolon tumorvæv indsamling, tilstødende normale colon epitel dissociation colontumorceller fordøjelse i enkelte celler, indlejring colontumorceller i Matrigel, og selektiv kultur baseret på princippet om, at tumorceller fastholde væksten på begrænsende næringsstof betingelser sammenlignet med normale epitelceller.
Den primære tumor organoids hvis isoleret fra genetisk modificerede mus giver et meget nyttigt system til at vurdere tumor autonome funktion af specifikke gener. Desuden tumor organoids er modtagelig for genmanipulation af virus mediterede genlevering, og derfor signalveje involveret i tyktarmen tumorigenese kunne også grundigt undersøgt ved overekspression eller knockdown. Primær tumor organoids kultur giver en fysiologisk relevante og gennemførlige midler til at studere de mekanismer og terapeutiske modaliteter for colon tumorigenese.
Introduction
De tarmepithelceller formere og slå over på en ekstraordinær sats, overgår alle andre væv i hvirveldyr kroppen 2,3. De delende celler, herunder tarm stamceller (ISC) og transit-forstærkende celler differentierer til enten sekretoriske (bæger, Paneth og enteroendocrine) celler eller enterocyterne 3. ISC er placeret i bunden af krypten. Paneth celler bevæger sig ned til bunden af krypter og lever længe, mens andre slægter migrere opad til villi 3,4. Her cellerne udsættes for tarmindholdet herunder mikrobiota og er kastet fra villus tip gennem en anoikis-induceret apoptotisk mekanisme. Selv tyktarmen mangler villi og Paneth celler, mekanismen for at opretholde homeostase ligner 4..
Wnt signalvejen har været impliceret i at spille en afgørende rolle i den intestinale spredning og ISC vedligeholdelse 4.. Sletning af the transskription faktor TCF4, en downstream effektor af Wnt signalering, fører til tab af tarm stamceller og efterfølgende opdeling af vævet 5.. Ligeledes transgen ekspression af Wnt inhibitor kr.1 reducerer epitelproliferation og udtømning sekretoriske celleafstamninger 6.. Omvendt overekspression af Wnt agonist R-spondin-1 inducerer potent og hurtige udbredelse af intestinale kryptceller 7.
Betragtning af betydningen af Wnt signalering til tarm homeostase er Wnt pathway mutationer observeret hyppigere i tyktarmskræft 8. Tyktarmskræft er den tredje hyppigste årsag til kræftdødsfald i USA 9.. Overskydende kosten med rødt kød og alkohol, nedsat fysisk aktivitet, og nedarvede og somatiske mutationer anses for at være risikofaktorer for tyktarmskræft 10,11. Den adenomatøs polypose coli (APC)-gen, en nøgle Wnt signalering faktor, er muteret i et flertal af patienter med familiær, sporadisk og colitis-associeret tyktarmskræft 12,13. Mutationer af andre faktorer involveret i Wnt signalvejen herunder Axin2 og β-catenin er også observeret i tyktarmskræft 14,15. Men den præcise mekanisme og effektiv behandling for tyktarmskræft mangler stadig. For at lette efterforskningen af de molekylære mekanismer for tyktarmskræft, har humane coloncancer cellelinier, der repræsenterer de forskellige stadier af kræft progression fra en godartet til en aggressiv celletype blevet etableret 16-18. Mus coloncarcinomceller cellelinier med forskellige metastatiske egenskaber er også tilgængelige 19,20. Alligevel er de primære celler eller organoid kulturer foretrækkes frem transformerede cellelinier, fordi de nøje efterligner in vivo tilstand og generere mere fysiologisk relevant data 21.. De fleste kolon kræft afledte cellelinjer vokse som monolag fastgjort til plade eller som celle suspensioner, Lacking apikal-basolateral orientering og tætte forbindelser mellem cellerne. Også normale og tumor tarmepitelceller in vivo undergår en spontan form for apoptose betegnes anoikis, som de differentierede celler nå villus tips og kaste 22. Disse funktioner er vanskelige at rekapitulere i cellelinier, men er vigtige i den udviklingsmæssige proces for tyktarmskræft 23.. Disse funktioner er opretholdt i primære organoids. Desuden giver tumor organoid kulturer et effektivt system til at vurdere tumor autonome funktioner af gener i forhold til in vivo studier. Genetisk manipulation in vivo af tarmen er en tidskrævende proces hovedsagelig ved at skabe transgene og / eller knockout-mus ved hjælp af tarmen-specifikke drivere. Men tumor organoids er let modtagelig for virale medieret genetiske manipulationer, og dermed et godt redskab til at vurdere præcise molekylære mekanismer. Primære tarm tumor organoid kulturer HAVe blevet påvist at være en gennemførlig og kraftfuld teknik. Primær tarm cellekultur kan etablere funktionelle tarm organoids med krypt-villi struktur in vitro fra en enkelt voksen Lgr5 + stamceller 24.. Disse organoids kan transplanteres og indpodet i det beskadigede tyktarmsvæv til regenerering 25.. Yderligere tilpasning af de dyrkningsbetingelser havde gjort lignende epitelial organoids fra muse colon og humane tyndtarm og tyktarm gennemførlig 1.. For primær normal colon epitel kultur, naeringsoploesning samt vækstfaktorer, herunder EGF, Noggin, R-spondin og Wnt3a er afgørende, mens naeringsoploesning og EGF er tilstrækkelig til dyrkning primære muse colontumorceller organoids 1.. Her beskriver vi en detaljeret protokol for at isolere, kultur og generere colontumorceller organoids.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Colontumor Isolering og celledissociering
- Intestinal tumorer kan isoleres fra enhver sporadisk eller behandling-induceret tyktarmskræft model. Musene bør aflives med CO2. Kolon, opsamles derefter, skylles med koldt phosphatbufret saltvand (PBS) og åbnet på langs. Identificer regioner, der indeholder tumorer ved hjælp af et stereomikroskop, dissekere ud med en saks, og vask med kold PBS.
- Inkuber tarm fragmenter indeholdende tumorer i EDTA chelation puffer (2 mM EDTA, 5,6 mmol / L Na 2 HPO 4, 8,0 mmol / L KH 2 PO 4, 96,2 mmol / l NaCl, 1,6 mmol / l KCl, 43,4 mmol / L saccharose, 54,9 mmol / L D-sorbitol, 0,5 mmol / L DL-dithiothreitol i destilleret vand) i 60 minutter på is.
- Efter chelering, vil de fleste af de normale tarmepitelceller afmonteres, mens tumorceller forbliver knyttet til mesenchyme. Aspirer off chelation buffer indeholdende normale epitelcellerog vask rest tumorfragmenter en gang med 5 ml kold kelation buffer.
- Aspirer off chelation buffer, vaske tumorfragmenter med 5 ml kold 1x PBS.
- Aspirer off 1x PBS, inkuberes tumorfragmenter i fordøjelsen buffer (2,5% kalvefosterserum, 1 enhed / ml penicillin, 1 ug / ml streptomycin og 2,5 ng / ml amphotericin B, 200 U / ml type IV collagenase 125 ug / ml type II dispase i Dulbeccos Modified Eagle Medium) i 2 timer ved 37 ° C.
- Tillad tumorfragment at afregne ved normal tyngdekraft i 1 min, og indsamle supernatanten i et 15 ml Falcon-rør. Pellet enkelt celle tumor suspension supernatanten ved centrifugering ved 200 xg i 3 minutter og vaskes en gang med 5 ml PBS ved centrifugering ved 200 xg i 3 min.
2.. Kultur i Tarm Tumor
- Resuspender tumor cellepellet med 500 pi PBS, tælle enkeltkæderne tumorceller ved hjælp af et hæmocytometer.
- Pellet tumorceller efter centrifuging ved 200 xg i 3 min, og resuspender dem i 5 mg / ml Matrigel på is og plade i 24-brønds plader ved 15.000 celler per 50 pi Matrigel per brønd.
- Lad Matrigel polymerisere i 15 minutter ved 37 ° C, og der tilsættes 500 gl / brønd naeringsoploesning (1 enhed / ml penicillin, 1 ug / ml streptomycin og 2,5 ng / ml amphotericin B, 10 mmol / L HEPES , 2 mM Glutamax, 1x N2 supplement, 1x B27 supplement, 1 mmol / l N-acetylcystein i Advanced Dulbeccos Modified Eagle Medium/F12) indeholdende 50 ng / ml murin EGF.
3.. Vedligeholdelse af Etablerede Organoids
- Ændre basale dyrkningsmedium indeholdende EGF hver 2 dage og passage organoids 01:05 en gang om ugen.
- For passage udskiftes dyrkningsmediet med frisk naeringsoploesning. Mekanisk forstyrre organoids og Matrigel ved hjælp af en P1000 pipette med tips skåret og overføre i en 15 ml Falcon-rør. Yderligere mekanisk dissociering opnås ved hjælp af en flammepoleret Pasteur rørtte.
- Vask dissocierede organoids med 5 ml naeringsoploesning og der centrifugeres ved 200 xg i 2 min.
- Supernatanten, pellet resuspenderes med Matrigel og tilføje dyrkningsmedium som beskrevet ovenfor.
4.. Opbevaring og inddrivelse af fastlagte Organoids
- For langtidsopbevaring, fryse organoids i flydende N2, som er stabile i mindst 2 år. Til frysning organoids, afbryde ved hjælp af en P1000 pipette med tips afskåret og overføre til en 15 ml Falcon-rør.
- Vask dissocierede organoids med 5 ml naeringsoploesning og der centrifugeres ved 200 xg i 2 min.
- Supernatanten, pellet resuspenderes med Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) indeholdende 20% kalvefosterserum (FBS) og 10% dimethylsulfoxid (DMSO).
- Overfør celler i 1,5 ml kryorør, og derefter sætte rørene i en Nalgene Mr. Frosty frysning beholder og opbevares i en -80 ° C fryser for at opnå en afkølingshastighedenpå -1 ° C / min. Efter inkubering natten overføre rør i flydende N2.
- Til nyttiggørelse, er de frosne organoids hurtigt optøet i et 37 ° C vandbad, vask med naeringsoploesning, spin ned, resuspenderes i Matrigel og kultur med de ovenfor beskrevne betingelser.
5.. RNA Extraction, Protein Udvinding og Immunohistokemi
- RNA-ekstraktion: Celler opsamles som beskrevet ovenfor for passage. RNA isoleres med PicoPure TM RNA Isolation Kit ifølge producentens anvisninger.
- Protein Extraction: Cellepellets opsamles som beskrevet ovenfor og lyseret i 100 ul radioimmunfældningsassays assaybuffer (RIPA, 50 mmol / L Tris-HCI, pH 7,5, 150 mmol / l NaCl, 2 mmol / L EDTA, 1% NP-40, 0,1 % SDS) med 1x proteasehæmmer.
- Immunhistokemi: Aspirer off cellekulturvæske, overføre tumor organoids med P1000 pipette med tips skåret ud i Cryo-mug og fryse straks tissagsøge frysemedium (OLT) med tøris. Frosne sektioner blev skåret på 7 um og farvet som beskrevet tidligere 26..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tidsforløbet for en colontumor organoid dannelse fra en tre-måneder gamle Apc min / + mus er vist i figur 1.. På dag 0, kan enkelte celler observeret flere timer efter udpladning (fig. 1A). På dag 1, overlevede colontumorceller epitelceller med refraktær kerner kunne observeres. På dag 3, fordoblet størrelsen af celler. På dag 6, udvidet størrelsen af organoid mere end ti gange og viste tegn på apoptose i midten. På dag 14 ville orgnoids vokse ind uregelmæssige rum (figur 1B). Her havde vi 39,33 ± 22,05 organoids / velformede under fordøjelsen tilstand 200 U / ml collagenase i 2 timer, sammenlignet med ingen organoids dannet under fordøjelsen tilstand på 75 U / ml collagenase i 30 min i denne undersøgelse (figur 1C).
For at vise dette organoid kultur model kan anvendes til funktionel undersøgelse, immunfluorescensfarvning af β-kat nin, en integreret komponent til Wnt signalvejen er vist i figur 2.. De positive farvede celler for β-catenin er placeret i de ud lag af organoid, som bekræftede vækstmønster med en central lumen foreslået af Dr. Clevers 'gruppe 24.
Figur 1. En repræsentativ organoid dannelse afledt fra colontumor taget fra en tre-måneder gamle Apc min / + mus blev dyrket i (A) 0, 1, 3, 6 og (B) 14 dage vises. (C) Den vellykkede sats organoid formation under to forskellige collagenasefordøjelse betingelser.
50210fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50210/50210fig2.jpg "/>
Figur 2. Immunfluorescensfarvning af β-catenin for organoids afledt fra en colontumor taget fra en tre-måneder gamle Apc min / + mus er vist. 4 ',6-diamidino-2-phenylindol, dihydrochlorid (DAPI) blev anvendt til at farve kerner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De eksperimentelle procedurer, der beskrives i denne protokol vil give mulighed for isolering og dyrkning af primære murine colontumorer. Protokollen er tilpasset fra banebrydende arbejde udført af Dr. Clevers gruppe 1,24,27. Vi optimeret fordøjelse tid og collagenase koncentration for at få et bedre udbytte af tumor organoids. De kritiske trin omfatter tumorcelle fordøjelse i enkelte celler, Matrigel resuspension, og selektiv kultur. Tumor-celle fordøjelse, for at opnå en effektiv adskillelse af colontumorer og opretholde deres levedygtighed, bør fordøjelsen og koncentration af kollagenase være empirisk og optimeres. For eksempel, når du bruger collagenase ved 75 U / ml og inkubationstid på 30 min, vi ikke skaffe enkelt tumor celle suspensioner og ingen organoids blev dannet under denne betingelse i vores hænder. Fastholdelse celle-celle-kontakt er rapporteret at være kritisk for dyrkning cancerceller 28, her ved hjælp af kollagenase ved 300 U / ml og incubation tid 3 timer, stroma celler forurening er også observeret. Tilsvarende bør Matrigel resuspension, koncentrationen, og størkningstid også bestemmes empirisk. De organoids tillader præcis vurdering af tumor epitel. De organoids oprettet fra tarm tumorer er i stand til langsigtet kultur. Vi har let anvendes etablerede organoids i flere måneder uden væsentlige forskelle i proliferation og differentiering. Den etablerede organoid kan være genetisk manipuleret til knockdown og overekspression. Desuden kan tumor organoids blive genereret fra humane tumor biopsiprøver, og derfor dyrkning teknik kan bruges til at studere grundlæggende mekanisme i en patient specifik måde. Den Wnt vej er kritisk for tarm embryonale udvikling. I den voksne tarmen Wnts er kritiske for den normale spredning af transit-forstærkende celler og dysregulering af Wnt vej er afgørende for colon tumorigenesis 29.. Selektiv kultur with EGF er tilstrækkelig til at opretholde colontumor organoid vækst. Men når det suppleres med Wnt3a de organoids vokse mere effektivt. Derfor, at cellerne reagerer på den vækstfremmende virkning af Wnt ligander, i modsætning til flere kolon-afledte cellelinier.
De organoids mere nøje efterligner tarmepitelet end etablerede tyktarmskræft afledte linjer, og vi tror vil give mere præcise og fysiologisk relevant data. Som beskrevet ovenfor, denne teknik er nyttig til at undersøge initiering og progression mekanismer til tyktarmskræft. Også tumor organoids vil give mere præcise data ved vurderingen af den terapeutiske effekt af tyktarmskræft behandlinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af tilskud til YMS fra National Institutes of Health (CA148828), The University of Michigan Gastrointestinal Peptid Center og Jeffrey A. Colby Colon Cancer Research og Tom Liu Memorial Funds fra University of Michigan Comprehensive Cancer Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 356234 | 5 mg/ml |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | 375U/mg |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | 1.8U/mg |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF), Murine, Natural | Invitrogen | 53003-018 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | 100 x |
| B27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | 50 x |
| Glutamax-I | Gibco | 35050-079 | 100x |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165-5G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965-092 | |
| PicoPureTM RNA Isolation Kit | Invitrogen | KIT0204 |
References
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Creamer, B., Shorter, R. G., Bamforth, J. The turnover and shedding of epithelial cells. I. The turnover in the gastro-intestinal tract. Gut. 2, 110-118 (1961).
- Crosnier, C., Stamataki, D., Lewis, J. Organizing cell renewal in the intestine: stem cells, signals and combinatorial control. Nat. Rev. Genet. 7, 349-359 (2006).
- Medema, J. P., Vermeulen, L. Microenvironmental regulation of stem cells in intestinal homeostasis and cancer. Nature. 474, 318-326 (2011).
- Korinek, V., et al. Depletion of epithelial stem-cell compartments in the small intestine of mice lacking Tcf-4. Nat. Genet. 19, 379-383 (1998).
- Pinto, D., Gregorieff, A., Begthel, H., Clevers, H. Canonical Wnt signals are essential for homeostasis of the intestinal epithelium. Genes Dev. 17, 1709-1713 (2003).
- Kim, K. A., et al. Mitogenic influence of human R-spondin1 on the intestinal epithelium. Science. 309, 1256-1259 (2005).
- Reya, T., Clevers, H. Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature. 434, 843-850 (2005).
- Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A.
- Sesink, A. L., Termont, D. S., Kleibeuker, J. H., Vander Meer, R. Red meat and colon cancer: the cytotoxic and hyperproliferative effects of dietary heme. Cancer Res. 59, 5704-5709 (1999).
- Fearon, E. R.
- Nishisho, I., et al. Mutations of chromosome 5q21 genes in FAP and colorectal cancer patients. Science. 253, 665-669 (1991).
- Xue, X., et al. Hypoxia-inducible factor-2alpha activation promotes colorectal cancer progression by dysregulating iron homeostasis. Cancer Res. 72, 2285-2293 (2012).
- Liu, W., et al. Mutations in AXIN2 cause colorectal cancer with defective mismatch repair by activating beta-catenin/TCF signalling. Nat. Genet. 26, 146-147 (2000).
- Morin, P. J., et al. Activation of beta-catenin-Tcf signaling in colon cancer by mutations in beta-catenin or APC. Science. 275, 1787-1790 (1997).
- Brattain, M. G., Fine, W. D., Khaled, F. M., Thompson, J., Brattain, D. E. Heterogeneity of malignant cells from a human colonic carcinoma. Cancer Res. 41, 1751-1756 (1981).
- Leibovitz, A., et al. Classification of human colorectal adenocarcinoma cell lines. Cancer Res. 36, 4562-4569 (1976).
- Willson, J. K., Bittner, G. N., Oberley, T. D., Meisner, L. F., Weese, J. L. Cell culture of human colon adenomas and carcinomas. Cancer Res. 47, 2704-2713 (1987).
- Brattain, M. G., Strobel-Stevens, J., Fine, D., Webb, M., Sarrif, A. M. Establishment of mouse colonic carcinoma cell lines with different metastatic properties. Cancer Res. 40, 2142-2146 (1980).
- Ikubo, A., Aoki, Y., Nagai, E., Suzuki, T. Highly metastatic variant of a mouse colon carcinoma cell line, LM17 and its response to GM-CSF gene therapy. Clin. Exp. Metastasis. 17, 849-855 (1999).
- Basant, S. K., Rinesh, K. Principles Of Animal Cell Culture. Student Compendium. Textbook Student Edition. 6, 61-96 (2008).
- Vachon, P. H., et al. Differentiation state-selective roles of p38 isoforms in human intestinal epithelial cell anoikis. Gastroenterology. 123, 1980-1991 (2002).
- Darido, C., et al. Defective claudin-7 regulation by Tcf-4 and Sox-9 disrupts the polarity and increases the tumorigenicity of colorectal cancer cells. Cancer Res. 68, 4258-4268 (2008).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Yui, S., et al. Functional engraftment of colon epithelium expanded in vitro from a single adult Lgr5(+) stem cell. Nat. Med. 18, 618-623 (2012).
- Anderson, E. R., Xue, X., Shah, Y. M. Intestinal hypoxia-inducible factor-2alpha (HIF-2alpha) is critical for efficient erythropoiesis. J. Biol. Chem. 286, 19533-19540 (2011).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469, 415-418 (2011).
- Kondo, J., et al. Retaining cell-cell contact enables preparation and culture of spheroids composed of pure primary cancer cells from colorectal cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 6235-6240 (2011).
- Clevers, H., Nusse, R.
