기본 마우스 대장 종양의 체외 Organoid의 문화
Summary
기본 생쥐 대장 종양 organoid을 설정하는 간단한 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은 대장 종양 세포가 생존하고 상피 정상적인 결장하지 않는 반면, 제한된 성장 인자를 포함하는 미디어 organoids로 성장하는 기능을 사용합니다.
Abstract
여러 인간과 생쥐 대장 암 세포주가 설립되어 같은 여러 세포 레이어, 기저 정점 극성을 구별 할 수있는 능력, 그리고 anoikis으로 결장 종양의 생리적 무결성은 대장 암 유래 세포주에서 유지되지 않습니다. 본 연구 사토 T 등 1., 대장 종양의 중요한 생리적 기능을 유지에서 적응 배양 마우스 기본 대장 종양 organoids하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 종양 세포가 정상에 비해 영양 상태 제한에 성장을 유지한다는 원칙에 따라 마우스 결장 종양 조직 수집, 인접한 정상 대장 상피 세포 분리, 단일 세포로 결장 종양 세포의 소화, 마트 리젤로 결장 종양 세포를 포함하고, 선택적 문화로 구성 상피 세포.
유전자 변형 생쥐에서 분리 된 경우, 기본 종양 organoids 종양 자치 funct를을 평가하는 매우 유용한 시스템을 제공특정 유전자의 이온. 또한, 종양 organoids는 유전자 전달을 묵상 바이러스 유전자 조작 의무이다, 대장 종양에 관여하므로 신호 전달 경로는 광범위하게 발현 또는 최저로 조사 할 수 있습니다. 기본 종양 organoids 문화 결장 종양에 대한 메커니즘과 치료 양식을 연구하는 생리 적절하고 실현 가능한 방법을 제공합니다.
Introduction
장 상피 세포 증식과 척추 동물의 몸 2,3의 모든 다른 조직을 능가 특별한 속도로 뒤집습니다. 장 줄기 세포 (ISC)와 대중 교통 증폭 세포를 포함하여 분할 세포는 분비 (잔,에 Paneth 및 enteroendocrine) 세포 또는 장 세포로 분화 3. ISC는 지하실의 기지에 위치해 있습니다. 에 Paneth 세포는 지하실의 맨 아래로 이동하고 다른 계통이 융모 3,4 위쪽으로 마이그레이션하는 반면, 긴 수명입니다. 여기에 세포는 미생물을 포함한 창자 내용에 노출되어 anoikis에 의한 세포 사멸 메커니즘을 통해 융모 끝에서 창고입니다. 콜론 융모와에 Paneth 세포를 부족하지만, 항상성을 유지하기위한 메커니즘은 4와 비슷합니다.
Wnt 신호 전달 경로는 장내 증식과 ISC 유지 보수 4에 중요한 역할을에 연루되어있다. 일 삭제전자 전사 인자 TCF4, Wnt 신호의 다운 스트림 이펙터, 장 줄기 세포 및 조직 5의 후속 고장의 손실로 연결됩니다. 마찬가지로, Wnt의 억제 DKK1의 유전자 발현은 상피 증식을 감소시키고 분비 세포 계보는 6 고갈. 반대로, Wnt의 작용제 R-spondin-1의 과발현은 장 토굴 세포 7의 강력하고 신속한 확산을 유도합니다.
장 항상성에 대한 Wnt 신호의 중요성을 감안할 때, Wnt의 통로 돌연변이는 자주 결장암 8에서 관찰된다. 대장 암은 미국에서 9 암 사망의 세 번째 주요 원인이다. 붉은 고기와 알콜을 가진 과잉 섭취는 신체 활동을 감소시키고, 상속 및 체세포 돌연변이가 대장 암 10,11의 위험 인자로 간주됩니다. 대장 용종증 대장균 (APC) 유전자, 키 Wnt 신호 계수, 펜실베이니아의 대다수 변이가족, 산발적 및 대장염과 연관된 대장 암 12,13와 tients. Axin2과 β-catenin의 등 Wnt 신호 전달 경로에 관여 다른 요인의 변이는 대장 암 14,15에서 관찰된다. 그러나 대장 암에 대한 정확한 메커니즘과 효과적인 치료는 여전히 부족하다. 대장 암에 대한 분자 메커니즘의 조사를 용이하게하기 위해, 공격적인 세포 유형으로 양성에서 암 진행의 여러 단계를 나타내는 인간의 대장 암 세포 라인은 16-18 설립되었습니다. 다른 전이성 특성을 가진 마우스 대장 암 세포주도 19,20 사용할 수 있습니다. 그들은 밀접하게 생체 상태를 모방하고 더 생리학 관련 데이터에게 21을 생성하기 때문에 그럼에도 불구하고, 일차 전지 또는 organoid 문화가 변형 세포 라인을 선호합니다. 대부분의 대장 암 유래 세포주는 lackin, 플레이트에 부착 된 단층이나 세포 현탁액으로 성장정점 – 기저 방향과 세포 간의 긴밀한 접합 g. 차별화 된 세포는 융모 끝을 도달하고 22을 흘리다대로 또한, 생체의 정상 및 종양의 장 상피 세포가 사멸 되나 anoikis의 자연 형태를 겪는다. 이러한 기능은 세포 라인에 요점을 되풀이하기 어려운 있지만, 대장 암 (23)의 발달 과정에서 중요한 역할을합니다. 이러한 기능은 기본 organoids에 유지됩니다. 또한, 종양 organoid 문화는 생체 내 연구에 비해 유전자의 종양의 자율적 인 기능을 평가하는 효율적인 시스템을 제공합니다. 소장의 생체 내에서 유전자 조작은 주로 소장 특정 드라이버를 사용하여 형질 전환 및 / 또는 녹아웃 마우스를 만들 통해 시간이 소요되는 과정입니다. 그러나, 종양 organoids은 쉽게 바이러스 매개 유전자 조작에 순종함으로써 정확한 분자 메커니즘을 평가하기위한 훌륭한 도구입니다. 주 장내 종양 organoid 문화 HAVE가 가능하고 강력한 기술로 입증되었습니다. 기본 장 세포 배양은 단일 성인 Lgr5 + 줄기 세포 24에서 체외 토굴 – 융모 구조로 기능성 장 organoids을 설정할 수 있습니다. 이 organoids은 이식과 재생 25 손상된 결장 조직에 접목 할 수 있습니다. 배양 조건의 추가 적응 마우스 콜론과 인간의 소장 1 가능한 결장에서 유사한 상피 organoids을 만들었다. 기초 배지와 EGF는 기본 마우스 대장 종양 organoids 1 성장을위한 충분한 반면 차 정상 대장 상피 문화, 기초 배지뿐만 아니라에 대한 EGF, Noggin의, R-spondin과 Wnt3a 등의 성장 인자가 필수적이다. 여기에서 우리는 자세한 프로토콜, 격리 문화, 대장 종양 organoids을 생성하는 방법에 대해 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에 설명 된 실험 절차는 기본 생쥐 대장 종양의 분리 및 문화하실 수 있습니다. 프로토콜은 박사 Clevers 그룹 1,24,27 수행 정액 직장에서 적응하고 있습니다. 우리가 종양 organoids의 더 나은 수율을 얻을 수있는 소화 시간과 콜라 농도를 최적화. 중요한 단계는 종양의 단일 세포로 세포의 소화, 마트 리젤의 부유하고, 선택적 문화를 이용하실 수 있습니다. 종양 세포 소화 순서대로…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 건강의 국립 연구소 (CA148828), 미시간 위장 펩티드 센터의 대학과 미시간 대학 종합 암 센터의 제프리 A. 콜비 대장 암 연구와 톰 리우 기념 기금에서 YMS에 교부금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 356234 | 5 mg/ml |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | 375 U/mg |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | 1.8 U/mg |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF), Murine, Natural | Invitrogen | 53003-018 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | 100 x |
| B27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | 50 x |
| Glutamax-I | Gibco | 35050-079 | 100x |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165-5G | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965-092 | |
| PicoPureTM RNA Isolation Kit | Invitrogen | KIT0204 |
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