Summary
Een eenvoudige methode om primaire murine colon tumor organoïde stellen beschreven. Deze methode maakt gebruik van de functie die colon tumorcellen overleven en te groeien in organoids in media die beperkte groei factoren, terwijl de normale colon epitheel niet doen.
Abstract
Verschillende menselijke en murine colonkanker cellijnen zijn vastgesteld, zijn fysiologische integriteit van colon tumoren zoals meerdere cellagen, basale-apicale polariteit vermogen om te differentiëren en anoikis niet colonkanker afgeleide cellijnen gehandhaafd. De huidige studie toont een methode voor het kweken van primaire muis colontumor organoids aangepast van Sato T et al.. 1, die belangrijke fysiologische functies van darmtumoren behoudt. Deze methode bestaat muis colontumor weefselverzameltoestel, aangrenzend normaal colon epitheel dissociatie colontumorcellen digestie in enkele cellen, inbedden colon tumorcellen in Matrigel en selectief kweekmedium gebaseerd op het principe dat tumorcellen handhaven groei beperkende nutriënten vergelijking met normale epitheelcellen.
De primaire tumor organoids als geïsoleerd van genetisch gemodificeerde muizen bieden een zeer nuttig systeem om tumor autonome funct beoordelenion van specifieke genen. Bovendien is de tumor organoids vatbaar zijn voor genetische manipulatie door virus mediteerde genaflevering; daarom signaalwegen betrokken bij de dikke darm ontstaan van tumoren kan ook uitgebreid onderzocht worden door overexpressie of knockdown. Primaire tumor organoids cultuur biedt een fysiologische relevant en haalbaar middel om de mechanismen en therapeutische modaliteiten voor de dikke darm ontstaan van tumoren te bestuderen.
Introduction
De intestinale epitheliale cellen vermenigvuldigen en omdraaien op een buitengewone snelheid, sneller dan alle andere weefsels in het gewervelde lichaam 2,3. De delende cellen, waaronder intestinale stamcellen (ISC) en doorvoer-versterkende cellen differentiëren in beide secretie (beker, Paneth en entero-endocriene cellen) of enterocyten 3. De ISC ligt aan de basis van de crypte. Paneth cellen verplaatsen naar de bodem van de crypten en hebben een lange levensduur, terwijl andere lijnen migreren naar boven aan de villi 3,4. Hier worden de cellen blootgesteld aan de darminhoud inbegrip microbiota worden afgeworpen van de villus uiteinden via een anoikis-geïnduceerde apoptotische mechanisme. Hoewel de colon mist villi en Paneth cellen, het mechanisme voor het handhaven van homeostase soortgelijk 4.
De Wnt signaleringsroute is betrokken bij een cruciale rol in het intestinale proliferatie en ISC onderhoud 4 spelen. Schrapping van the transcriptiefactor TCF4, een stroomafwaartse effector van Wnt signalering leidt tot verlies van intestinale stamcellen en daaropvolgende afbraak van het weefsel 5. Ook transgene expressie van Wnt inhibitor DKK1 vermindert de epitheliale proliferatie en put afscheidende cellijnen 6. Omgekeerd overexpressie van het Wnt-agonist R-spondin-1 induceert krachtige en snelle verspreiding van intestinale crypte cellen 7.
Gezien het belang van Wnt-signalering voor intestinale homeostase, worden Wnt pathway mutaties vaker waargenomen bij darmkanker 8. Darmkanker is de derde belangrijkste oorzaak van overlijden door kanker in de Verenigde Staten 9. Overtollige inname met rood vlees en alcohol, verminderde fysieke activiteit, en erfelijke en somatische mutaties worden beschouwd als risicofactoren van darmkanker 10,11. Het adenomateuze polyposis coli (APC)-gen, een belangrijke factor Wnt signalering wordt gemuteerd in de meeste patients met familiaire, sporadische en colitis-geassocieerde darmkanker 12,13. Mutaties van andere factoren betrokken bij Wnt signaling pathway inbegrip Axin2 en β-catenine zijn eveneens waargenomen bij darmkanker 14,15. Echter, de precieze mechanisme en effectieve therapie voor darmkanker ontbreekt nog. Om het onderzoek naar de moleculaire mechanismen voor darmkanker te vergemakkelijken, hebben menselijke colonkanker cellijnen die verschillende stadia van de progressie van kanker uit een goedaardige om een agressieve celtype vastgesteld 16-18. Muis coloncarcinoom cellijnen met verschillende metastatische eigenschappen zijn ook beschikbaar 19,20. Toch zijn primaire cellen of organoïde culturen voorkeur boven getransformeerde cellijnen, omdat ze nauw nabootsen van de in vivo toestand en het genereren van meer fysiologisch relevante gegevens 21. De meeste dikke darm-kanker afgeleide cellijnen groeien als monolaag bevestigd aan de plaat of als celsuspensies, lacking apicale-basolaterale oriëntatie en krappe kruispunten tussen cellen. Ook normale en tumor intestinale epitheliale cellen in vivo ondergaan een spontane vorm van apoptose genoemd anoikis als de gedifferentieerde cellen bereiken de villus tips en worden afgeworpen 22. Deze functies zijn moeilijk te herhalen in cellijnen maar zijn belangrijk in het ontwikkelingsproces van darmkanker 23. Deze functies worden onderhouden in primaire organoids. Bovendien is de tumor organoïde culturen een efficiënte systeem tumor autonome functies van genen dan in vitro studies evalueren. Genetische manipulatie in vivo van de darm is een tijdrovend proces vooral door het creëren van transgene en / of knockout muizen met darm-specifieke drivers. Echter, de tumor organoids zijn gemakkelijk vatbaar voor virale gemedieerde genetische manipulaties en dus een geweldig hulpmiddel voor het beoordelen precieze moleculaire mechanismen. Primaire darmtumor organoïde culturen have aangetoond dat een haalbaar en krachtige techniek. Primaire intestinale celkweek kan functionele intestinale organoids leggen met crypte-villi structuur in vitro van een enkele volwassen Lgr5 + stamcellen 24. Deze organoids kunnen worden getransplanteerd en geënt in beschadigde darm weefsel voor regeneratie 25. Verdere aanpassing van de kweekomstandigheden waren vergelijkbaar epitheliale organoids gemaakt van muizen en menselijke dikke darm dunne darm en dikke darm haalbaar 1. Voor primaire normale colon epitheel cultuur, basaal kweekmedium evenals groeifactoren zoals EGF, Noggin, R-spondin en Wnt3a zijn essentieel, terwijl basaal kweekmedium en EGF voldoende is voor de teelt van primaire muis colontumor organoids 1. Hier een gedetailleerd protocol te isoleren, cultuur, en het genereren van colontumor organoids beschrijven we.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Colon Tumor Isolatie en celdissociatie
- Darmtumoren kan worden geïsoleerd uit elke sporadische behandeling geïnduceerde colonkanker model. De muizen worden gedood met CO2. Colons worden vervolgens verzameld, gespoeld met koude fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en longitudinaal geopend. Identificeer gebieden met tumoren met behulp van een stereomicroscoop, ontleden met een schaar, en wassen met koud PBS.
- Incubeer intestinale fragmenten die tumoren in EDTA chelatie buffer (2 mM EDTA, 5,6 mmol / L Na 2 HPO 4, 8,0 mmol / L KH 2PO 4, 96,2 mmol / L NaCl, 1,6 mmol / L KCl, 43,4 mmol / L sucrose, 54.9 mmol / L D-sorbitol, 0,5 mmol / L DL-dithiothreïtol in gedestilleerd water) gedurende 60 minuten op ijs.
- Na chelatie, zullen de meeste van de normale intestinale epitheliale cellen worden losgemaakt, terwijl tumorcellen blijven aan het mesenchym. Aspireren van de chelatietherapie buffer met normale epitheelcellenen was het overblijfsel tumor fragmenten nog een keer met 5 ml koud chelatie buffer.
- Aspireren van de chelatietherapie buffer, wassen tumorfragmenten met 5 ml koud 1x PBS.
- Zuig van de 1x PBS, incubeer tumorfragmenten in digestiebuffer (2,5% foetaal runderserum, 1 eenheid / ml penicilline, 1 ug / ml streptomycine, en 2,5 ng / ml amfotericine B, 200 U / ml collagenase type IV, 125 ug / ml type II dispase in Dulbecco's Modified Eagle Medium) gedurende 2 uur bij 37 ° C.
- Laat de tumor fragment te regelen onder normale zwaartekracht gedurende 1 min, en verzamel de bovenstaande vloeistof in een 15 ml Falcon buis. Pellet de enkele cel tumor suspensie supernatant door centrifugeren bij 200 g gedurende 3 min en eenmaal wassen met 5 ml PBS met centrifugeren bij 200 x g gedurende 3 minuten.
2. Cultuur van Intestinale Tumor
- Resuspendeer de tumorcel pellet met 500 pi PBS, tellen enkele, geïsoleerde tumorcellen met behulp van een hemocytometer.
- Pellet tumorcellen door centrifuging bij 200 xg gedurende 3 min en resuspendeer ze in 5 mg / ml Matrigel op ijs en plaat in platen met 24 putjes bij 15.000 cellen per 50 pi per putje Matrigel.
- Laat de Matrigel polymeriseren 15 min bij 37 ° C en voeg 500 ul / putje basisvoedingsoplossing (1 eenheid / ml penicilline, 1 ug / ml streptomycine, en 2,5 ng / ml amfotericine B, 10 mmol / L HEPES , 2mM Glutamax, 1x N2 supplement, 1x B27 supplement, 1 mmol / L N-acetylcysteïne in Geavanceerde Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12) met daarin 50 ng / ml muizen EGF.
3. Onderhoud van Gevestigde Organoids
- Wijzig basaal kweekmedium dat EGF om de 2 dagen en de passage organoids 01:05 een keer per week.
- Voor de passage, vervang het kweekmedium met verse basaal kweekmedium. Mechanisch verstoren organoids en Matrigel met een P1000 pipet met tips afgesneden en overbrengen in een 15 ml falcon buis. Verdere mechanische dissociatie wordt bereikt met behulp van een brand gepolijste Pasteur pijptte.
- Wassen gedissocieerd organoids met 5 ml basisvoedingsoplossing en centrifugeer bij 200 xg gedurende 2 minuten.
- Verwijder het supernatant, resuspendeer de pellet met Matrigel en voeg kweekmedium zoals hierboven beschreven.
4. Opslag en herstel van Opgericht Organoids
- Voor langdurige opslag, invriezen organoids in vloeibare N2 die stabiel zijn gedurende ten minste 2 jaar. Voor het invriezen organoids, verstoren met behulp van een P1000 pipet met tips afgesneden en overbrengen in een 15 ml falcon buis.
- Wassen gedissocieerd organoids met 5 ml basisvoedingsoplossing en centrifugeer bij 200 xg gedurende 2 minuten.
- Verwijder het supernatant, resuspendeer de pellet met Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) bevattende 20% foetaal bovine serum (FBS) en 10% dimethylsulfoxide (DMSO).
- Overdracht cellen in 1,5 ml cryobuizen, zet dan de buizen in een Nalgene Mr Frosty bevriezen container en op een -80 ° C vriezer een afkoelsnelheid bereikenvan -1 ° C / min. Na overnacht incubatie buizen zetten in vloeibare N2.
- Voor herstel, worden de bevroren organoids snel ontdooid in een 37 ° C waterbad, wassen met basaal kweekmedium, spin down, opnieuw in suspensie in Matrigel en cultuur met hierboven beschreven omstandigheden.
5. RNA-extractie, Eiwitextractie en Immunohistochemistry
- RNA-extractie: Cellen worden verzameld zoals hierboven beschreven voor passage. RNA wordt geïsoleerd met PicoPure TM RNA Isolation Kit volgens de instructies van de fabrikant.
- Protein Extraction: celpellets worden verzameld zoals hierboven beschreven en gelyseerd in 100 pl radioimmunoprecipitatie testbuffer (RIPA, 50 mmol / L Tris-HCl pH 7,5, 150 mmol / L NaCl, 2 mmol / L EDTA, 1% NP-40, 0,1 % SDS) met 1x proteaseremmer.
- Immunohistochemistry: Aspireren off celcultuurmedium, overdragen tumor organoids met P1000 pipet met tips afgesneden in Cryo-schimmel en onmiddellijk te bevriezen in tisaanklagen bevriezing medium (oktober) met droog ijs. Vriescoupes werden gesneden op 7 pm en gekleurd zoals eerder 26 beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het tijdsverloop van een colontumor organoïde vorming van drie maanden oude Apc min / + muis wordt getoond in figuur 1. Op dag 0, kunnen enkele cellen verscheidene uren worden waargenomen na plateren (Figuur 1A). Op dag 1, overleefde colontumor epitheelcellen met vuurvast kernen worden waargenomen. Op dag 3, de grootte van de cellen verdubbeld. Op dag 6, de grootte van organoïde uitgebreid meer dan tienvoudig en tekenen van apoptose in het midden. Op dag 14, zou de orgnoids uitgroeien tot onregelmatige compartimenten (Figuur 1B). Hier hebben we 39,33 ± 22,05 organoids / goed gevormd onder de voorwaarde digestie van 200 U / ml collagenase gedurende 2 uur, in vergelijking met geen organoids gevormd onder de voorwaarde digestie van 75 U / ml collagenase gedurende 30 min in deze studie (figuur 1C).
Om tonen organoïde cultuur model kan worden gebruikt voor de functionele studie, immunofluorescente kleuring van β-cate nin, een integraal onderdeel voor Wnt signaleringsroute wordt getoond in figuur 2. De positieve gekleurde cellen voor β-catenine zijn in de lagen van de organoïde die groeipatroon bevestigd met een door Dr Clevers groep 24 voorgestelde centrale lumen.
Figuur 1. Een representatieve organoïde vorming afgeleid van colon tumor uit een drie maanden oude Apc min / + muis werd gekweekt (A) 0, 1, 3, 6 en (B) 14 dagen weergegeven. (C) De succesvolle tarief van organoïde formatie onder twee verschillende collagenase spijsvertering voorwaarden.
50210fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50210/50210fig2.jpg "/>
Figuur 2. Immunofluorescente kleuring van β-catenine voor organoids afgeleid van een colontumor uit een drie maanden oude Apc min / + muis weergegeven. 4 ',6-diamidino-2-fenylindool dihydrochloride (DAPI) werd gebruikt om kernen vlek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De in dit protocol beschreven experimentele procedures zal zorgen voor isolatie en kweek van primaire muizen darmtumoren. Het protocol is een bewerking van baanbrekende werk van dr. Clevers groep 1,24,27. We geoptimaliseerd de spijsvertering tijd en collagenase concentratie tot een betere opbrengst van de tumor organoids krijgen. De kritische stappen omvatten tumorcel spijsvertering in enkele cellen, Matrigel resuspensie en selectieve cultuur. Voor tumorcel vertering, om een efficiënte scheiding van darmtumoren verkrijgen en hun levensvatbaarheid behouden, moet de vertering en concentratie van collagenase empirisch worden afgeleid en geoptimaliseerd. Bijvoorbeeld bij het gebruik van collagenase bij 75 U / ml en de incubatie tijd van 30 min, we hadden geen enkel tumorcelsuspensies en geen organoids verkrijgen werden gevormd onder deze voorwaarde in onze handen. Onderhouden van cel-cel contact wordt gemeld kritisch te zijn voor het kweken van kankercellen 28, hier bij gebruik van collagenase bij 300 U / ml en broen tijd van 3 uur, stromacellen contaminatie wordt ook waargenomen. Evenzo Matrigel resuspensie, de concentratie en stollingstijd moet ook empirisch worden bepaald. De organoids maken een nauwkeurige beoordeling van de tumor epitheel. De gevestigde darmtumoren organoids kunnen langetermijnkweek. We hebben direct gebruikt gevestigde organoids voor enkele maanden zonder noemenswaardige verschillen in proliferatie en differentiatie. De gevestigde organoïde kan genetisch worden gemanipuleerd voor knockdown en overexpressie. Bovendien kan de tumor organoids worden gegenereerd uit humane tumor biopsie monsters; daarom kweken techniek kan worden gebruikt om basismechanisme in een patiënt specifieke wijze te bestuderen. De Wnt pathway is kritiek voor intestinale embryonale ontwikkeling. In de volwassen darm Wnts zijn cruciaal voor de normale verspreiding van doorvoer-versterkende cellen en ontregeling van de Wnt-route is van cruciaal belang voor het colon ontstaan van tumoren 29. Selectieve cultuur with EGF voldoende voor het handhaven colontumor organoïde groei. Echter, wanneer aangevuld met Wnt3a, de organoids groeien efficiënter. Daarom zijn de cellen reageren op de groei bevorderende effecten van Wnt liganden, anders dan verscheidene colon-afgeleide cellijnen.
De organoids nauwer bootsen het darmepitheel dan gevestigde darmkanker afgeleide lijnen, en wij geloven zal nauwkeurigere en fysiologisch relevante gegevens te verstrekken. Zoals hierboven beschreven, deze techniek is nuttig voor het onderzoeken van de ontwikkeling en progressie mechanismen voor darmkanker. Ook de tumor organoids zal nauwkeurigere gegevens zijn bij de beoordeling van de therapeutische werkzaamheid van darmkanker behandelingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Wij hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door subsidies aan YMS van de National Institutes of Health (CA148828), De Universiteit van Michigan Maag Peptide Center, en Jeffrey A. Colby Colon Cancer Research en de Tom Liu Memorial Fondsen van de Universiteit van Michigan Comprehensive Cancer Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 356234 | 5 mg/ml |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | 375U/mg |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | 1.8U/mg |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF), Murine, Natural | Invitrogen | 53003-018 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | 100 x |
| B27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | 50 x |
| Glutamax-I | Gibco | 35050-079 | 100x |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165-5G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965-092 | |
| PicoPureTM RNA Isolation Kit | Invitrogen | KIT0204 |
References
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Creamer, B., Shorter, R. G., Bamforth, J. The turnover and shedding of epithelial cells. I. The turnover in the gastro-intestinal tract. Gut. 2, 110-118 (1961).
- Crosnier, C., Stamataki, D., Lewis, J. Organizing cell renewal in the intestine: stem cells, signals and combinatorial control. Nat. Rev. Genet. 7, 349-359 (2006).
- Medema, J. P., Vermeulen, L. Microenvironmental regulation of stem cells in intestinal homeostasis and cancer. Nature. 474, 318-326 (2011).
- Korinek, V., et al. Depletion of epithelial stem-cell compartments in the small intestine of mice lacking Tcf-4. Nat. Genet. 19, 379-383 (1998).
- Pinto, D., Gregorieff, A., Begthel, H., Clevers, H. Canonical Wnt signals are essential for homeostasis of the intestinal epithelium. Genes Dev. 17, 1709-1713 (2003).
- Kim, K. A., et al. Mitogenic influence of human R-spondin1 on the intestinal epithelium. Science. 309, 1256-1259 (2005).
- Reya, T., Clevers, H. Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature. 434, 843-850 (2005).
- Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A.
- Sesink, A. L., Termont, D. S., Kleibeuker, J. H., Vander Meer, R. Red meat and colon cancer: the cytotoxic and hyperproliferative effects of dietary heme. Cancer Res. 59, 5704-5709 (1999).
- Fearon, E. R.
- Nishisho, I., et al. Mutations of chromosome 5q21 genes in FAP and colorectal cancer patients. Science. 253, 665-669 (1991).
- Xue, X., et al. Hypoxia-inducible factor-2alpha activation promotes colorectal cancer progression by dysregulating iron homeostasis. Cancer Res. 72, 2285-2293 (2012).
- Liu, W., et al. Mutations in AXIN2 cause colorectal cancer with defective mismatch repair by activating beta-catenin/TCF signalling. Nat. Genet. 26, 146-147 (2000).
- Morin, P. J., et al. Activation of beta-catenin-Tcf signaling in colon cancer by mutations in beta-catenin or APC. Science. 275, 1787-1790 (1997).
- Brattain, M. G., Fine, W. D., Khaled, F. M., Thompson, J., Brattain, D. E. Heterogeneity of malignant cells from a human colonic carcinoma. Cancer Res. 41, 1751-1756 (1981).
- Leibovitz, A., et al. Classification of human colorectal adenocarcinoma cell lines. Cancer Res. 36, 4562-4569 (1976).
- Willson, J. K., Bittner, G. N., Oberley, T. D., Meisner, L. F., Weese, J. L. Cell culture of human colon adenomas and carcinomas. Cancer Res. 47, 2704-2713 (1987).
- Brattain, M. G., Strobel-Stevens, J., Fine, D., Webb, M., Sarrif, A. M. Establishment of mouse colonic carcinoma cell lines with different metastatic properties. Cancer Res. 40, 2142-2146 (1980).
- Ikubo, A., Aoki, Y., Nagai, E., Suzuki, T. Highly metastatic variant of a mouse colon carcinoma cell line, LM17 and its response to GM-CSF gene therapy. Clin. Exp. Metastasis. 17, 849-855 (1999).
- Basant, S. K., Rinesh, K. Principles Of Animal Cell Culture. Student Compendium. Textbook Student Edition. 6, 61-96 (2008).
- Vachon, P. H., et al. Differentiation state-selective roles of p38 isoforms in human intestinal epithelial cell anoikis. Gastroenterology. 123, 1980-1991 (2002).
- Darido, C., et al. Defective claudin-7 regulation by Tcf-4 and Sox-9 disrupts the polarity and increases the tumorigenicity of colorectal cancer cells. Cancer Res. 68, 4258-4268 (2008).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Yui, S., et al. Functional engraftment of colon epithelium expanded in vitro from a single adult Lgr5(+) stem cell. Nat. Med. 18, 618-623 (2012).
- Anderson, E. R., Xue, X., Shah, Y. M. Intestinal hypoxia-inducible factor-2alpha (HIF-2alpha) is critical for efficient erythropoiesis. J. Biol. Chem. 286, 19533-19540 (2011).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469, 415-418 (2011).
- Kondo, J., et al. Retaining cell-cell contact enables preparation and culture of spheroids composed of pure primary cancer cells from colorectal cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 6235-6240 (2011).
- Clevers, H., Nusse, R.
