Summary
Une méthode simple pour établir murin colon organoïde de la tumeur primitive est décrite. Cette méthode utilise la fonction que les cellules tumorales du côlon survivre et se développer dans organites dans un milieu contenant des facteurs de croissance limitées, alors côlon normal épithéliale n'en ont pas.
Abstract
Plusieurs lignées cellulaires de cancer du côlon humain et murin ont été établis, l'intégrité physiologique des tumeurs du côlon telles que de multiples couches de cellules, la polarité basal-apicale, la capacité de se différencier, et anoïkis ne sont pas conservées dans des lignées cellulaires dérivées de cancer du côlon. La présente étude démontre une méthode de culture côlon souris organoïdes de tumeurs primaires adaptés de Sato T et al. 1, qui conserve les caractéristiques physiologiques importants de tumeurs du côlon. Cette méthode consiste à recueillir de la souris du colon de la tumeur de tissu, adjacente à la normale du côlon épithélium de dissociation, du côlon tumeur des cellules digestion dans des cellules individuelles, incorporant des cellules de tumeur du côlon en Matrigel, et la culture sélective sur la base du principe selon lequel les cellules tumorales maintenir une croissance sur la limitation des conditions nutritives par rapport à la normale cellules épithéliales.
Les principaux organites tumorales si isolées de souris génétiquement modifiées offrent un système très utile pour évaluer fonct autonome tumeurion de gènes spécifiques. Par ailleurs, les organites tumorales se prêtent à la manipulation génétique par le virus médité la livraison de gènes; voies par conséquent de signalisation impliquées dans la tumorigenèse du côlon pourraient également être étudiée de façon approfondie par la surexpression ou knockdown. Tumeur culture des organites primaire fournit un moyen physiologiques pertinents et réalisables pour étudier les mécanismes et les modalités thérapeutiques pour la tumorigenèse du côlon.
Introduction
Les cellules épithéliales intestinales prolifèrent et retournent à un rythme extraordinaire, dépassant tous les autres tissus dans le corps des vertébrés 2,3. Les cellules qui se divisent, y compris les cellules souches intestinales (ISC) et les cellules de transit d'amplification se différencient en deux cellules ou entérocytes 3 sécrétoire (gobelet, Paneth et entéroendocrine). L'ISC se trouve à la base de la crypte. Cellules de Paneth se déplacent vers le bas de cryptes et sont de longue durée, tandis que d'autres lignées migrent vers le haut pour les villosités 3,4. Ici, les cellules sont exposées à des contenus stomacaux y compris les micro et se détachent de la pointe des villosités par un mécanisme apoptotique anoïkis induite. Bien que le colon n'a pas villosités et les cellules de Paneth, le mécanisme de maintien de l'homéostasie est similaire 4.
La voie de signalisation Wnt est impliquée à jouer un rôle crucial dans la prolifération intestinale et ISC entretien 4. Suppression de the facteur de transcription TCF4, un effecteur en aval de la signalisation Wnt, conduit à la perte de cellules souches intestinales et répartition ultérieure du tissu 5. De même, l'expression transgénique de la DKK1 inhibiteur de Wnt réduit la prolifération épithéliale et épuise lignées de cellules sécrétoires 6. En revanche, la surexpression de l'agoniste Wnt R-spondine-1 induit la prolifération puissante et rapide des cellules de la crypte intestinale 7.
Compte tenu de l'importance de la signalisation Wnt pour l'homéostasie intestinale, les mutations de la voie Wnt sont fréquemment observées dans le cancer du côlon 8. Le cancer du colon est la troisième cause de décès par cancer aux États-Unis 9. L'apport alimentaire excès de viande rouge et d'alcool, activité physique réduite, et a hérité et mutations somatiques sont considérés comme des facteurs de cancer du colon 10,11 risque. Le coli (APC), la polypose adénomateuse gène, un facteur clé de signalisation Wnt, est muté dans la majorité des patients ayant familial, sporadique, et la colite associée à un cancer du colon 12,13. Mutations d'autres facteurs impliqués dans la voie de signalisation Wnt y compris Axin2 et β-caténine sont également observées dans le cancer du colon 14,15. Cependant, le mécanisme précis et un traitement efficace pour le cancer du côlon font encore défaut. Pour faciliter les enquêtes sur les mécanismes moléculaires du cancer du côlon, les lignées cellulaires du cancer du côlon humain représentant les différentes étapes de la progression du cancer d'une forme bénigne à un type de cellules agressives ont été établies 16-18. les lignées cellulaires de carcinome du côlon de souris avec différentes propriétés métastatiques sont également disponibles 19,20. Néanmoins, les cellules primaires ou des cultures organoïdes sont préférés aux lignées cellulaires transformées parce qu'ils imitent étroitement un état vivo et génèrent plus physiologiquement pertinente des données 21. La plupart des lignées cellulaires dérivées du côlon-cancéreuses se développent comme monocouche fixé à la plaque ou sous forme de suspensions cellulaires, Lacking d'orientation apical-basolatéral et jonctions serrées entre les cellules. En outre, les cellules épithéliales intestinales normales et tumorales in vivo subissent une forme spontanée de l'apoptose anoïkis dites que les cellules différenciées atteignent les conseils des villosités et tombent 22. Ces caractéristiques sont difficiles à résumer dans des lignées cellulaires mais qui sont importantes dans le processus de développement du cancer du côlon 23. Ces caractéristiques sont maintenues dans organoïdes primaires. En outre, les cultures de organoïdes tumorales fournir un système efficace pour évaluer les fonctions autonomes de gènes tumoraux par rapport aux études in vivo. La manipulation génétique in vivo de l'intestin est un processus fastidieux principalement à travers la création transgénique et / ou souris knockout utilisation de pilotes spécifiques intestin. Cependant, les organites tumorales sont facilement prêter à des manipulations génétiques induites virales et donc un excellent outil pour évaluer les mécanismes moléculaires précis. Primaires intestinaux cultures organoïdes tumorales VHAe été démontrée comme étant une technique faisable et puissant. Culture des cellules intestinales primaire peut établir des organites fonctionnels intestinaux avec Crypt-villosités Structure in vitro à partir d'un seul adulte LGR5 + sur les cellules souches 24. Ces organites peuvent être transplantés et greffés dans les tissus du côlon endommagé pour la régénération 25. En outre l'adaptation des conditions de culture avait fait organites épithéliales similaires à partir de la souris côlon et l'intestin grêle et le côlon humain réalisable 1. Pour la culture primaire normale du côlon de l'épithélium, le milieu de culture de base ainsi que les facteurs de croissance, y compris EGF, caboche, R-spondine et Wnt3a sont essentiels, alors que le milieu de culture de base et de l'EGF est suffisante pour la croissance côlon organoïdes murins de tumeurs primaires 1. Nous décrivons ici un protocole détaillé pour isoler, la culture, et de générer des organites de tumeurs du côlon.
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Protocol
1. Colon Isolation de la tumeur et de dissociation cellulaire
- Tumeurs intestinales peuvent être isolés à partir de n'importe quel modèle de cancer du côlon sporadique ou induite par le traitement. Les souris doivent être euthanasiés avec du CO 2. Colons sont ensuite collectés, rincé à froid saline tamponnée au phosphate (PBS) et ouvert longitudinalement. Identifier les régions contenant des tumeurs à l'aide d'une loupe binoculaire, disséquer avec une paire de ciseaux, et laver avec du PBS froid.
- Incuber fragments intestinaux contenant les tumeurs dans un tampon de chélation d'EDTA (2 mM d'EDTA, 5,6 mmol / l de Na 2 HPO 4, 8,0 mmol / l de KH 2 PO 4, 96,2 mmol / l de NaCl, 1,6 mmol / L de KCl, 43.4 mmol / l de saccharose, 54,9 mmol / L D-sorbitol, 0,5 mmol / L DL-dithiothréitol dans de l'eau distillée) pendant 60 min sur la glace.
- Après chélation, la plupart des cellules épithéliales intestinales normales sera détaché, tandis que les cellules tumorales restent fixées à la mésenchyme. Aspirer le tampon de chélation contenant des cellules épithéliales normaleset laver la tumeur reste fragmente encore une fois avec le tampon de chélation froid ml 5.
- Aspirer le tampon de chélation, lavez fragments de tumeur avec 5 ml froid 1x PBS.
- Aspirer le PBS 1x, incuber des fragments de tumeur dans un tampon de digestion (2.5% de sérum de veau fœtal, 1 unité / ml de pénicilline, 1 pg / ml de streptomycine et 2,5 ng / ml d'amphotéricine B, 200 U / ml collagénase de type IV, 125 pg / ml de type II dispase en milieu Eagle modifié par Dulbecco) pendant 2 heures à 37 ° C.
- Laisser le fragment tumeur à s'installer sous gravité normale pendant 1 minute, et recueillir le surnageant dans un tube Falcon de 15 ml. Pellet la seule tumeur du surnageant de cellules en suspension par centrifugation à 200 g pendant 3 min et laver une fois avec 5 ml de PBS par centrifugation à 200 g pendant 3 min.
2. Culture de la tumeur intestinale
- Reprendre la cellule tumorale culot avec 500 pi de PBS, compter les cellules tumorales uniques isolés à l'aide d'un hémocytomètre.
- Cellules tumorales granulés par centrifuging à 200 g pendant 3 min, et remettre en suspension dans 5 mg / ml Matrigel sur la glace et la plaque dans des plaques à 24 puits à 15.000 cellules par 50 pi de Matrigel par puits.
- Laissez le Matrigel polymériser pendant 15 min à 37 ° C, et ajouter 500 ul / puits basal milieu de culture (1 unité / ml de pénicilline, 1 pg / ml de streptomycine et 2,5 ng / ml d'amphotéricine B, 10 mmol / L HEPES , 2 mM Glutamax, 1x supplément N2, 1x supplément B27, 1 mmol / L N-acétylcystéine dans d'avancée Eagle modifié par Dulbecco Medium/F12) contenant 50 ng / ml d'EGF murin.
3. Entretien des organites établies
- Changer le milieu de culture de base contenant EGF tous les 2 jours et passage organoïdes 01h05 une fois par semaine.
- Pour les passages, remplacer le milieu de culture par du milieu de culture de base fraîche. Mécaniquement perturber organites et Matrigel aide d'une pipette P1000 avec des pointes coupées et les transférer dans un tube Falcon de 15 ml. En outre dissociation mécanique est réalisée à l'aide d'un tuyau poli Pasteur de feuTTE.
- Lavez organoïdes dissociées avec 5 ml de milieu de culture de base et centrifuger à 200 g pendant 2 min.
- Jeter le surnageant, remettre le culot avec Matrigel et ajouter du milieu de culture tel que décrit ci-dessus.
4. Stockage et récupération des organites établies
- Pour le stockage à long terme, de geler organites dans l'azote liquide 2 qui sont stables pendant au moins 2 ans. Pour organoïdes congélation, perturber l'aide d'une pipette P1000 avec des pointes coupées et transférer dans un tube Falcon de 15 ml.
- Lavez organoïdes dissociées avec 5 ml de milieu de culture de base et centrifuger à 200 g pendant 2 min.
- Jeter le surnageant, remettre le culot de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) contenant 20% de sérum de veau fœtal (FBS) et 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO).
- cellules de transfert dans 1,5 ml cryotubes, puis mettre les tubes dans un Mr. Frosty récipient de congélation Nalgene et stocker dans un congélateur à -80 ° C pour atteindre une vitesse de refroidissementde -1 ° C / min. Après une nuit d'incubation, transférer tubes en N2 liquide.
- Pour la récupération, les organites congelés sont rapidement décongelés à 37 ° C au bain-marie, lavez avec un milieu de culture de base, ralentit ou remettre en suspension dans Matrigel et de la culture avec les conditions décrites ci-dessus.
5. Extraction de l'ARN, l'extraction des protéines et immunohistochimie
- Extraction de l'ARN: Les cellules sont collectées comme décrit plus haut pour le passage. L'ARN est isolé avec PicoPure TM RNA Isolation Kit selon les instructions du fabricant.
- Protein Extraction: Les culots cellulaires sont collectées comme décrit ci-dessus et lysées dans un tampon d'essai de radioimmunoprécipitation 100 pi (RIPA; 50 mmol / L Tris-HCl pH 7,5, 150 mmol / L de NaCl, 2 mmol / L EDTA, 1% de NP-40, 0,1 % SDS) avec 1x inhibiteur de protéase.
- Immunohistochimie: Aspirer le milieu de culture cellulaire, transférer organoïdes tumorales avec pipette P1000 avec des bouts coupés dans Cryo-moule et congeler immédiatement dans tispoursuivre milieu de congélation (OCT) avec de la glace sèche. Coupes congelées ont été coupées à 7 pm et colorées comme décrit précédemment 26.
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Representative Results
Le cours du temps d'une tumeur du côlon formation de organoïde d'un trois-month-old Apc min / + souris est illustré à la figure 1. Au jour 0, les cellules individuelles ont pu être observés plusieurs heures après placage (figure 1A). Au jour 1, a survécu côlon cellules épithéliales tumorales avec des noyaux réfractaires pourraient être observés. Au jour 3, la taille des cellules doublé. Au jour 6, la taille de organoïde progressé plus que décuplé et a montré des signes d'apoptose dans le milieu. Au jour 14, les orgnoids augmenteraient en compartiments irréguliers (figure 1B). Ici, nous avons eu 39,33 ± 22,05 organoïdes / bien formé dans les conditions de digestion de 200 U / ml de collagénase pendant 2 heures, comparativement à aucun organoïdes formés dans les conditions de digestion de 75 U / ml de collagénase pendant 30 min dans cette étude (figure 1C).
Pour afficher ce modèle de culture organoïde pourrait être utilisé pour l'étude fonctionnelle, immunofluorescence de β-cate nin, une partie intégrante de la voie de signalisation Wnt est montré à la figure 2. Les cellules colorées positives pour les β-caténine sont situés dans les couches hors du organoïde, qui a confirmé modèle de croissance avec une lumière centrale proposé par le groupe de M. Clevers 24.
Figure 1. Une formation de organoïde représentant dérivé de tumeur du côlon pris d'un trois-month-old Apc min / + souris a été cultivé pour (A) 0, 1, 3, 6 et (B) 14 jours est affiché. (C) Le taux de réussite de la formation organoïde sous deux conditions de digestion de collagénase différentes.
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Figure 2. Immunofluorescence de β-caténine pour organoïdes dérivées d'une tumeur au colon pris d'un trois-month-old Apc min / + souris est affiché. 4 ',6-Diamidino-2-Phenylindole, dichlorhydrate (DAPI) a été utilisé pour colorer les noyaux.
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Discussion
Les procédures expérimentales décrites dans ce protocole permettra d'isolement et de culture des tumeurs du côlon murins primaires. Le protocole est adapté du travail de pionnier accompli par le Dr Clevers groupe 1,24,27. Nous avons optimisé le temps de digestion et de concentration de la collagénase pour obtenir un meilleur rendement de organoïdes tumorales. Les étapes essentielles comprennent la digestion des cellules tumorales en cellules individuelles, Matrigel remise en suspension et de la culture sélective. Pour la digestion des cellules tumorales, afin d'obtenir la dissociation efficace de tumeurs du côlon et de maintenir la viabilité, la digestion et la concentration de la collagénase doivent être dérivées empiriquement et optimisées. Par exemple lors de l'utilisation de la collagénase à 75 U / ml et la durée d'incubation de 30 min, nous n'avons pas obtenu des suspensions de cellules tumorales simples et aucun organites ont été formés dans cette condition dans nos mains. Maintenir le contact cellule-cellule est signalé à être critique pour les cellules cancéreuses en culture de 28, ici lors de l'utilisation de la collagénase à 300 U / ml et incubatioOn observe également n temps de 3 heures, la contamination des cellules stromales. De même, Matrigel remise en suspension, la concentration et le temps de solidification doivent également être déterminés de manière empirique. Les organites permettent évaluation précise de l'épithélium tumoral. Les organites établies à partir de tumeurs intestinales sont capables de culture à long terme. Nous avons facilement utilisé organoïdes établies depuis plusieurs mois sans différences notables dans la prolifération et la différenciation. Le organoïde établi peut être manipulé génétiquement pour abattre et la surexpression. En outre, les organites tumorales peuvent être générés à partir d'échantillons de biopsies de tumeurs humaines, par conséquent la technique de culture peut être utilisée pour étudier les mécanismes de base d'une manière spécifique au patient. La voie de signalisation Wnt est essentielle pour le développement embryonnaire intestinal. Dans l'intestin adulte Wnt sont essentiels pour la prolifération normale des cellules transit-amplification et une dérégulation de la voie Wnt est critique pour la tumorigenèse du côlon 29. Culture sélective wie EGF est suffisante pour maintenir la croissance de organoïde côlon tumeur. Toutefois, lorsque complété avec Wnt3a, les organites se développent de manière plus efficace. Par conséquent, les cellules sont sensibles à la promotion de la croissance des effets de ligands Wnt, contrairement à plusieurs lignées de cellules du côlon dérivés.
Les organites imitent plus étroitement l'épithélium intestinal de lignées dérivées de cancer du côlon établies, et nous croyons fournira des données plus précises et physiologiquement pertinents. Comme décrit ci-dessus, cette technique est utile pour étudier l'initiation et les mécanismes de progression du cancer du côlon. En outre, les organites tumorales fourniront des données plus précises lors de l'évaluation de l'efficacité thérapeutique des traitements du cancer du côlon.
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Disclosures
Nous n'avons rien à révéler.
Acknowledgments
Cette étude a été financée par des subventions à YMS par le National Institutes of Health (CA148828), l'Université du Michigan gastro-intestinal peptide Center, et Jeffrey A. Colby recherche sur le cancer du côlon et du Fonds commémoratif Tom Liu du Comprehensive Cancer Center de l'Université du Michigan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 356234 | 5 mg/ml |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | 375U/mg |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | 1.8U/mg |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF), Murine, Natural | Invitrogen | 53003-018 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | 100 x |
| B27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | 50 x |
| Glutamax-I | Gibco | 35050-079 | 100x |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165-5G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965-092 | |
| PicoPureTM RNA Isolation Kit | Invitrogen | KIT0204 |
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