Summary
Eine einfache Methode zur primären murinen Kolontumor organoide etablieren beschrieben. Dieses Verfahren nutzt die Eigenschaft, dass Kolontumorzellen überleben und wachsen in Organoiden in Medien, die begrenzte Wachstumsfaktoren, während normale Kolonepithelzellen nicht tun.
Abstract
Mehrere Menschen und der Maus Darmkrebs-Zelllinien etabliert haben, sind physiologische Integrität Kolontumoren wie mehrere Zellschichten, Basal-apikale Polarität, die Fähigkeit, zu differenzieren und nicht in anoikis Darmkrebs abgeleiteten Zelllinien erhalten. Die vorliegende Studie zeigt, ein Verfahren zur Kultivierung von primären Maus Kolontumors organoids von Sato T et al. 1, die wichtige physiologische Funktionen Kolontumoren behält angepasst. Dieses Verfahren besteht aus Maus Colontumorgewebe Sammlung, neben normalen Kolonepithel Dissoziation Kolontumorzellen Verdauung in einzelne Zellen, die Einbettung Kolontumorzellen in Matrigel und selektive Kultur beruht auf dem Grundsatz, dass Tumorzellen das Wachstum auf limitierende Nährstoff Bedingungen gewährleisten im Vergleich zu normalen Epithelzellen.
Der Primärtumor Organoiden wenn aus genetisch veränderten Mäusen isoliert bieten einen sehr nützlichen System Tumor autonomen Funkt beurteilenIonen bestimmter Gene. Darüber hinaus sind die Tumor organoids zugänglich genetische Manipulation von Virus nachgedacht Gentransfer; daher Signalwege im Dickdarm Tumorentstehung beteiligt könnte auch weitgehend durch Überexpression oder Knockdown untersucht werden. Primärtumor Organoiden Kultur bietet eine physiologische relevant und machbar Mittel, um die Mechanismen und therapeutischen Modalitäten für Doppelpunkt Tumorentstehung zu untersuchen.
Introduction
Die intestinalen Epithelzellen vermehren und drehen auf einer außerordentlichen Geschwindigkeit und übertraf damit alle anderen Geweben im Körper Wirbeltier 2,3. Die teilenden Zellen, einschließlich Darm-Stammzellen (ISC) und Transit-Verstärkung Zellen differenzieren entweder in sekretorischen (Kelch, Paneth und enteroendokrinen) Zellen oder Enterozyten 3. Das ISC ist an der Basis der Krypta. Panethzellen nach unten auf den Boden des Krypten und sind langlebig, während andere Linien nach oben wandern, um den Darmzotten 3,4. Hier werden die Zellen in den Darm Inhalte einschließlich Mikroflora ausgesetzt und werden von den villus Tipps durch eine anoikis-induzierte Apoptose-Mechanismus zu vergießen. Obwohl die Doppelpunkt fehlt Zotten und Panethzellen, ist der Mechanismus für die Aufrechterhaltung der Homöostase ähnlich 4.
Der Wnt-Signalweg ist in eine entscheidende Rolle in der intestinalen Proliferation und ISC Wartung 4 gebracht worden. Löschung von the Transkriptionsfaktor TCF4, ein nachgeschalteter Effektor der Wnt-Signalweg, führt zum Verlust der intestinalen Stammzellen und die anschließende Aufteilung des Gewebes 5. Ebenso reduziert transgene Expression der Wnt-Inhibitor DKK1 die epithelialen Proliferation und erschöpft sekretorischen Zelllinien 6. Umgekehrt induziert die Überexpression des Wnt-Agonisten R-spondin-1 potente und rasche Verbreitung der intestinalen Kryptenzellen 7.
Angesichts der Bedeutung der Wnt-Signalweg für intestinale Homöostase, sind Wnt-Signalweg Mutationen häufig in Darmkrebs 8 beobachtet. Darmkrebs ist die dritthäufigste Todesursache durch Krebs in den Vereinigten Staaten 9. Excess Nahrungsaufnahme mit rotem Fleisch und Alkohol, Bewegungsmangel und geerbt und somatische Mutationen gelten als Risikofaktoren für Darmkrebs 10,11 sein. Die adenomatöse Polyposis coli (APC)-Gen, ein Schlüssel Wnt-Faktor ist in der Mehrzahl der pa mutiertenPatienten mit familiärer, sporadisch, und Colitis-assoziierten Darmkrebs 12,13. Mutationen von anderen Faktoren in Wnt-Signalweg einschließlich Axin2 und β-Catenin beteiligt sind auch bei Darmkrebs 14,15 beobachtet. Jedoch ist die genaue Mechanismus und wirksame Therapie für Darmkrebs noch aus. Um die Untersuchung der molekularen Mechanismen für Darmkrebs zu erleichtern, haben menschliche Darmkrebs-Zelllinien, die verschiedene Stufen der Tumorprogression von einer gutartigen zu einer aggressiven Zelltyp wurden 16-18 etabliert. Maus Kolonkarzinomzelllinien mit verschiedenen metastasierenden Eigenschaften sind auch 19,20. Dennoch sind Primärzellen oder organoide Kulturen über transformierten Zelllinien bevorzugt, weil sie genau imitieren die in vivo-Zustand und erzeugen mehr physiologisch relevanten Daten 21. Die meisten Dickdarm-Krebs-Zelllinien wachsen als Monolayer an der Platte befestigt oder als Zellsuspensionen lacking apikalen basolateralen Orientierung und Tight Junctions zwischen den Zellen. Außerdem unterziehen normalen und Tumor-intestinalen Epithelzellen in vivo eine spontane Form der Apoptose bezeichnet anoikis wie die differenzierten Zellen die villus Tipps erreichen und Schuppen 22. Diese Funktionen sind nur schwer in Zelllinien rekapitulieren, sind aber in den Entwicklungsprozess von Darmkrebs 23 wichtig. Diese Funktionen werden in primäre Organoiden gepflegt. Darüber hinaus bieten die Tumorzellen organoiden Kulturen ein wirksames System zur Tumor autonomen Funktion der Gene im Vergleich zu in-vivo-Studien zu beurteilen. Genetische Manipulation in vivo des Darms ist ein zeitaufwendiger Prozess vor allem durch die Schaffung von transgenen und / oder Knockout-Mäusen mit Darm-spezifischen Treibern. Allerdings sind die Tumor Organoiden leicht zugänglich, um virale vermittelte genetische Manipulationen und damit ein großes Werkzeug für die Beurteilung der genauen molekularen Mechanismen. Primäre Darmtumor organoide Kulturen have demonstriert worden, um eine praktikable und leistungsfähige Technik sein. Primäre Darm Zellkultur funktionelle Darm Organoiden mit Krypta-Darmzotten Struktur in vitro herzustellen aus einer einzigen Erwachsenen Lgr5 + Stammzellen 24. Diese Organoiden können transplantiert werden und eingepflanzt in ein beschädigtes Gewebe zur Regeneration Doppelpunkt 25. Weitere Anpassung der Kulturbedingungen hatte ähnliche epithelialen Organoiden von Maus Doppelpunkt und menschlichen Dünndarm und Dickdarm möglich 1 gemacht. Für primären normalen Kolonepithel Kultur, basale Kulturmedium sowie Wachstumsfaktoren, einschließlich EGF, Noggin, R-und spondin Wnt3a sind unerlässlich, während basale Kulturmedium und EGF ist ausreichend für wachsende primäre Maustaste Kolontumor Organoiden 1. Hier beschreiben wir ein ausführliches Protokoll zu isolieren, Kultur und erzeugen Kolontumor Organoiden.
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Protocol
1. Colon Tumor Isolation und Zelldissoziation
- Intestinale Tumoren können von jedem sporadische oder Behandlung induzierten Dickdarmkrebs Modell isoliert werden. Die Mäuse sollten mit CO 2 eingeschläfert werden. Doppelpunkte werden dann gesammelt, gespült mit kaltem Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und der Länge nach geöffnet. Identifizieren Regionen mit Tumoren mit einem Stereomikroskop, sezieren mit einer Schere, und waschen mit kaltem PBS.
- Inkubieren Darm-Fragmente, die Tumoren in EDTA-Chelat-Puffer (2 mM EDTA, 5,6 mmol / L Na 2 HPO 4, 8,0 mmol / L KH 2 PO 4, 96,2 mmol / L NaCl, 1,6 mmol / L KCl, 43,4 mmol / L Saccharose, 54,9 mmol / l D-Sorbit, 0,5 mmol / l DL-Dithiothreitol in destilliertem Wasser) für 60 min auf Eis.
- Nach Chelat, werden die meisten der normalen intestinalen Epithelzellen abgetrennt werden, während Tumorzellen Mesenchym befestigt bleiben wird. Absaugen die Chelatbildung Puffer mit normalen Epithelzellenund wäscht den Rest Tumorfragmente ein weiteres Mal mit 5 ml kaltem Puffer Chelatbildung.
- Absaugen die Chelatbildung Puffer waschen Tumorfragmente mit 5 ml kaltem 1x PBS.
- Absaugen des 1x PBS, Inkubation Tumorfragmente bei der Verdauung Puffer (2,5% fötalem Rinderserum, 1 Einheit / ml Penicillin, 1 ug / ml Streptomycin und 2,5 ng / ml Amphotericin B, 200 U / ml Kollagenase Typ IV, 125 ug / ml Typ II Dispase in Dulbecco modifiziertem Eagle Medium) für 2 Stunden bei 37 ° C.
- Lassen Sie die Tumorfragment unter normalen Schwerkraft für 1 min absetzen, und den Überstand in ein 15 ml Falcon-Röhrchen. Pellet die einzelne Zelle Tumor Suspension Überstand durch Zentrifugation bei 200 xg für 3 min und waschen einmal mit 5 ml PBS durch Zentrifugation bei 200 xg für 3 min.
2. Kultur Darm Tumor
- Resuspendieren der Tumorzelle Pellet mit 500 ul PBS, zählen isolierte einzelne Tumorzellen mit einer Zählkammer.
- Pellet Tumorzellen durch centrifuging bei 200 × g für 3 min, und resuspendieren sie in 5 mg / ml Matrigel auf Eis und Platte in Platten mit 24 Vertiefungen mit 15.000 Zellen pro 50 ul pro Vertiefung Matrigel.
- Lassen Sie die Matrigel für 15 min polymerisiert bei 37 ° C, und fügen Sie 500 ul / Vertiefung basalen Kulturmedium (1 Einheit / ml Penicillin, 1 ug / ml Streptomycin und 2,5 ng / ml Amphotericin B, 10 mmol / L HEPES , 2 mM Glutamax, 1x N2 Ergänzung, 1x B27 Ergänzung, 1 mmol / L N-Acetylcystein in Modified Adler Erweiterte Dulbecco Medium/F12) mit 50 ng / ml Maus-EGF.
3. Wartung Gegründet Organoide
- Ändern basalen Kulturmedium mit EGF alle 2 Tage und Passage Organoiden 01.05 einmal pro Woche.
- Für Passagieren, ersetzen Sie das Kulturmedium durch frisches basalen Kulturmedium. Mechanisch stören Organoiden und Matrigel mit einem P1000 mit Spitzen abgeschnitten und in ein 15 ml Falcon-Röhrchen. Weitere mechanische Dissoziation wird erreicht, indem ein Feuer polierten Pasteur Rohrtte.
- Waschen Sie distanzierte Organoiden mit 5 ml der basalen Kulturmedium und Zentrifuge bei 200 xg für 2 min.
- Überstand verwerfen, das Pellet mit Matrigel und fügen Kulturmedium wie oben beschrieben.
4. Speicher-und Recovery von Gegründet Organoide
- Für die langfristige Lagerung einfrieren Organoiden in flüssigem N 2, die stabil sind für mindestens 2 Jahre. Zum Einfrieren Organoiden, stören mit einem P1000 mit Spitzen abgeschnitten und in ein 15 ml Falcon-Röhrchen.
- Waschen Sie distanzierte Organoiden mit 5 ml der basalen Kulturmedium und Zentrifuge bei 200 xg für 2 min.
- Der Überstand wird verworfen, das Pellet mit Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM), enthaltend 20% fötales Rinderserum (FBS) und 10% Dimethylsulfoxid (DMSO).
- Transfer-Zellen in 1,5 ml Kryoröhrchen, dann die Rohre in einer Nalgene Mr. Frosty Einfrieren Behälter und Speicher in einem -80 ° C Gefrierschrank, eine Kühlung zu erzielenvon -1 ° C / min. Nach Inkubation über Nacht übertragen Röhrchen in flüssigem N 2.
- Für die Wiederherstellung werden die gefrorenen Organoiden schnell in einem 37 ° C Wasserbad, waschen mit basalen Kulturmedium, Spin-down, in Matrigel und Kultur mit oben beschriebenen Bedingungen resuspendieren. Aufgetaut
5. RNA-Extraktion, Protein Extraction und Immunhistochemie
- RNA-Extraktion: Die Zellen werden gesammelt, wie oben beschrieben, für den Durchgang. RNA wird mit PicoPure TM RNA Isolation Kit nach den Anweisungen des Herstellers isoliert.
- Protein Extraction: Zellpellets werden gesammelt wie oben beschrieben und lysiert in 100 ul Assaypuffer Radioimmunfällung (RIPA, 50 mmol / l Tris-HCl pH 7,5, 150 mmol / l NaCl, 2 mmol / l EDTA, 1% NP-40, 0,1 % SDS) mit 1x Proteasehemmer.
- Immunhistochemie: Absaugen Zellkulturmedium, übertragen Tumor Organoiden mit P1000 mit Spitzen aus in Cryo-Form geschnitten und sofort einfrieren in tisverklagen Einfriermedium (OCT) mit Trockeneis. Gefrierschnitte wurden bei 7 um geschnitten und gefärbt, wie zuvor beschrieben 26.
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Representative Results
Der zeitliche Verlauf eines Kolontumor organoide Bildung von einem drei Monate alten ApcMin / + Maus ist in Abbildung 1 dargestellt. Am Tag 0, könnten einzelne Zellen mehrere Stunden nach der Beschichtung (Abbildung 1A) beobachtet werden. Am Tag 1, überlebten Kolontumors Epithelzellen mit feuerfesten Kerne beobachtet werden. Am Tag 3, verdoppelte sich die Größe der Zellen. Am Tag 6, erweitert die Größe der organoide mehr als das Zehnfache und zeigte Anzeichen von Apoptose in der Mitte. Am Tag 14, würden die orgnoids in unregelmäßige Kammern (1B) wachsen. Hier hatte 39,33 ± 22,05 organoids / Vertiefung unter der Verdauung Bedingung von 200 U / ml Collagenase 2 Stunden gebildet wird, im Vergleich zu keiner organoids unter der Bedingung Verdauung von 75 U / ml Kollagenase für 30 min in dieser Studie (1C) gebildet.
Um zu zeigen, diese organoide Kultur-Modell für die funktionelle Untersuchung Immunfluoreszenzfärbung von β-Cate verwendet werden könnte nin, ein integraler Bestandteil für Wnt-Signalweg ist in Abbildung 2 dargestellt. Die positiven gefärbten Zellen für β-Catenin in den aus Schichten des OBs, die das Wachstum Muster mit einem zentralen Lumen von Dr. Clevers 'Gruppe 24 vorgeschlagen bestätigt entfernt.
Abbildung 1. Ein Vertreter organoide Bildung von Kolontumor von einem drei Monate alten ApcMin / + Maus gemacht abgeleitet wurde (A) 0, 1, 3, 6 kultiviert und (B) 14 Tage dargestellt. (C) Die erfolgreiche Rate von organoide Bildung unter zwei verschiedenen Bedingungen Kollagenaseverdau.
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Abbildung 2. Immunfluoreszenzfärbung von β-Catenin für Organoiden von einem Doppelpunkt Tumor aus einem drei Monate alten ApcMin / + Maus gezeigt wird genommen abgeleitet. 4 ',6-Diamidino-2-phenylindol, Dihydrochlorid (DAPI) wurde verwendet, um Kerne zu färben.
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Discussion
Die experimentellen Verfahren in diesem Protokoll beschrieben wird zur Isolierung und Kultivierung von primären murinen Kolontumoren ermöglichen. Das Protokoll wird von bahnbrechenden Arbeit von Dr. Clevers Gruppe 1,24,27 getan angepasst. Wir optimierten die Verdauung Zeit und Kollagenasekonzentration um eine bessere Ausbeute des Tumors Organoiden bekommen. Die kritischen Schritte umfassen Tumorzelle Verdauung in einzelne Zellen, Matrigel Resuspension und selektive Kultur. Für Tumorzellen Verdauung, um eine effiziente Spaltung von Kolontumoren erhalten und behalten ihre Lebensfähigkeit, sollte die Verdauung und die Konzentration von Kollagenase empirisch abgeleitet und optimiert werden. Zum Beispiel bei der Verwendung von Kollagenase bei 75 U / ml und Inkubationszeit von 30 min, haben wir nicht erhalten einzelne Tumorzelle Suspensionen und keine Organoiden wurden unter dieser Bedingung in unseren Händen ist. Pflege Zell-Zell-Kontakt wird berichtet, kritisch zu sein für die Kultivierung Krebszellen 28, hier bei der Verwendung von Kollagenase bei 300 U / ml und incubation von 3 h Stromazellen Verunreinigung beobachtet. Ebenso sollte Matrigel Resuspension der Konzentration und Erstarrungszeit auch empirisch ermittelt werden. Die Organoiden erlauben eine präzise Beurteilung des Tumors Epithel. Die Organoiden von Darm-Tumoren etabliert sind in der Lage langfristige Kultur. Wir haben gut etablierte Organoiden für mehrere Monate ohne nennenswerten Unterschiede in der Proliferation und Differenzierung verwendet. Die etablierte organoide können genetisch Knockdown und Überexpression manipuliert werden. Darüber hinaus können die Tumor organoids von humanen Tumor-Biopsien erzeugt werden, weshalb die Kultivierung Technik kann verwendet werden, um grundlegende Mechanismus bei einem Patienten gezielt zu untersuchen. Der Wnt-Signalweg ist entscheidend für Darm Embryonalentwicklung. Im adulten Darm Wnts sind entscheidend für die Proliferation von normalen Transit verstärkenden Zellen und Fehlregulation des Wnt-Signalweg ist entscheidend für Doppelpunkt Tumorentstehung 29. Selektive Kultur with EGF ist ausreichend für die Aufrechterhaltung Kolontumor organoide Wachstum. Wenn sie jedoch mit Wnt3a ergänzt, die Organoiden effizienter wachsen. Daher sind die Zellen, die auf die wachstumsfördernde Wirkung von Wnt-Liganden, im Gegensatz zu einigen Kolon-Zelllinien.
Die Organoiden genauer nachahmen das Darmepithel als etablierte Darmkrebs abgeleitet Linien, und wir glauben, dass sie genauer und physiologisch relevanten Daten zur Verfügung. Wie oben beschrieben, ist diese Technik nützlich für die Untersuchung der Entstehung und Progression Mechanismen für Darmkrebs. Auch die Tumor Organoiden liefert genauere Daten bei der Beurteilung der therapeutischen Wirksamkeit von Darmkrebs Behandlungen.
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Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse zu YMS von den National Institutes of Health (CA148828), The University of Michigan Gastrointestinale Peptide Center und Jeffrey A. Colby Colon Cancer Research und der Tom Liu Memorial Funds von der University of Michigan Comprehensive Cancer Center unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 356234 | 5 mg/ml |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | 375U/mg |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | 1.8U/mg |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF), Murine, Natural | Invitrogen | 53003-018 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | 100 x |
| B27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | 50 x |
| Glutamax-I | Gibco | 35050-079 | 100x |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165-5G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965-092 | |
| PicoPureTM RNA Isolation Kit | Invitrogen | KIT0204 |
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