Summary
Un metodo semplice per determinare primario murino organoide tumore colon è descritto. Questo metodo utilizza la funzione che le cellule tumorali del colon sopravvivere e crescere in organoidi in terreni contenenti fattori di crescita limitate, mentre colon normale epiteliale non lo fanno.
Abstract
Sono state create diverse linee di cellule tumorali di colon umano e murino, l'integrità fisiologica dei tumori del colon, come gli strati multipli delle cellule basali, polarità-apicale, la capacità di differenziare e anoikis non vengono mantenute nel cancro linee cellulari derivate colon. Il presente studio dimostra un metodo per la coltura principale del mouse colon organoidi tumorali adattato da Sato T et al. 1, che conserva importanti funzioni fisiologiche di tumori del colon. Questo metodo consiste colon raccolta topo tessuto tumorale, adiacente normale epitelio dissociazione colon, colon cellule tumorali digestione in singole cellule, incorporando le cellule tumorali del colon in matrigel, e la coltura selettivo basato sul principio che le cellule tumorali mantenere la crescita sul limitare condizioni di nutrienti rispetto al normale cellule epiteliali.
Le organoidi tumore primario, se isolate da topi geneticamente modificati, forniscono un sistema molto utile per valutare Funz autonomo tumoreione di geni specifici. Inoltre, i organoidi tumorali sono suscettibili di manipolazione genetica da virus meditato la consegna del gene; percorsi quindi di segnalazione coinvolte nella tumorigenesi del colon potrebbero essere ampiamente studiati da sovraespressione o atterramento. Primaria cultura organoidi tumorale fornisce un fisiologici relativi mezzi e fattibile per studiare i meccanismi e le modalità terapeutiche per la tumorigenesi del colon.
Introduction
Le cellule epiteliali intestinali proliferano e si girano a una velocità straordinaria, superando tutti gli altri tessuti del corpo dei vertebrati 2,3. Le cellule in divisione, comprese le cellule staminali intestinali (ISC) e cellule di transito-amplificazione si differenziano in due secretoria (calice, Paneth e enteroendocrine) cellule o enterociti 3. L'ISC si trova alla base della cripta. Cellule Paneth spostano verso il fondo delle cripte e sono di lunga durata, mentre altri lignaggi migrano verso l'alto per i villi 3,4. Qui le cellule sono esposte ai contenuti intestinali tra cui microbiota e si staccano dalle punte dei villi, attraverso un meccanismo apoptotico anoikis indotta. Sebbene il colon manca villi e cellule Paneth, il meccanismo per il mantenimento dell'omeostasi è simile 4.
La via di segnalazione Wnt è stata implicata nel giocare un ruolo cruciale nella proliferazione intestinale e ISC manutenzione 4. Soppressione del secoloe fattore di trascrizione TCF4, un effettore a valle di segnalazione Wnt, porta alla perdita di cellule staminali intestinali e la successiva ripartizione del tessuto 5. Analogamente, l'espressione transgenica dell'inibitore DKK1 Wnt riduce la proliferazione epiteliale e impoverisce linee cellulari secretorie 6. Viceversa, l'iperespressione di agonista Wnt R-spondina-1 induce potente e rapida proliferazione di cellule intestinali cripta 7.
Data l'importanza della segnalazione Wnt per l'omeostasi intestinale, le mutazioni di Wnt sono frequentemente osservate nel cancro del colon 8. Il cancro del colon è la terza causa di morte per cancro negli Stati Uniti 9. Assunzione in eccesso di carne rossa e alcool, ridotta attività fisica, e ha ereditato e mutazioni somatiche sono considerati fattori di rischio di tumore del colon 10,11. La poliposi coli (Apc) gene adenomatosa, un fattore chiave di segnalazione Wnt, è mutato in una maggioranza di papazienti con familiare, sporadica, e il cancro del colon colite associata a 12,13. Le mutazioni di altri fattori coinvolti nella via di segnalazione Wnt compresi Axin2 e β-catenina si osservano anche nel cancro del colon 14,15. Tuttavia, il meccanismo preciso ed efficace terapia per il cancro al colon sono ancora carenti. Per facilitare la ricerca dei meccanismi molecolari per il cancro del colon, le linee cellulari tumorali di colon umano che rappresentano diverse fasi della progressione del cancro da un benigno a un tipo di cellule aggressive sono state stabilite 16-18. Mouse linee cellulari di carcinoma del colon con diverse proprietà metastatiche sono disponibili anche 19,20. Tuttavia, le cellule primarie o culture organoide sono preferite rispetto alle linee cellulari trasformate, perché strettamente imitano lo stato in vivo e generano più fisiologicamente rilevanti di dati 21. Maggior colon-cancro linee cellulari derivate crescere come monostrato fissata sulla piastra o come sospensioni cellulari, Lacking di orientamento apicale-basolaterale e giunzioni strette tra le cellule. Inoltre, le cellule epiteliali intestinali normali e tumorali in vivo sottoposti a una forma spontanea di apoptosi anoikis definito come le cellule differenziate raggiungono le punte dei villi e sono capannone 22. Queste caratteristiche sono difficili da ricapitolare in linee cellulari, ma sono importanti nel processo di sviluppo del cancro al colon 23. Queste caratteristiche vengono mantenute in organoidi primari. Inoltre, le culture organoide tumorali forniscono un sistema efficiente per valutare funzioni autonome di geni tumorali rispetto a studi in vivo. Manipolazione genetica in vivo dell'intestino è un processo che richiede tempo principalmente attraverso la creazione transgenici e / o topi knockout utilizzando driver intestino-specifici. Tuttavia, i organoidi tumorali sono facilmente suscettibili di manipolazioni genetiche virali mediata e quindi un ottimo strumento per valutare i meccanismi molecolari precisi. Primari intestinali tumorali organoide culture have stato dimostrato di essere una tecnica fattibile e potente. Coltura di cellule intestinali primaria può stabilire organoidi intestinali funzionali con struttura cripta-villi in vitro da un singolo adulto LGR5 + cellule staminali 24. Questi organoidi possono essere trapiantati e innestate nel tessuto danneggiato del colon per la rigenerazione 25. Ulteriore adeguamento delle condizioni di coltura aveva fatto organoidi epiteliali simili da colon mouse e piccolo intestino umano e del colon fattibile 1. Per il normale epitelio del colon cultura primaria, terreno di coltura così come fattori di crescita tra cui EGF, Zucca, R-spondina e Wnt3a sono essenziali, mentre è sufficiente per la coltivazione del mouse colon organoidi tumore primario 1 terreno di coltura e di EGF. Qui si descrive un protocollo dettagliato per isolare, la cultura, e generare organoidi del tumore del colon.
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Protocol
1. Tumore del colon Isolamento e dissociazione cellulare
- Tumori intestinali possono essere isolati da qualsiasi modello di cancro al colon sporadico oppure indotta dal trattamento. I topi devono essere sacrificati con CO 2. I due punti vengono poi raccolti, lavati con freddo PBS (PBS) e aperto longitudinalmente. Identificare le regioni contenenti i tumori utilizzando uno stereomicroscopio, sezionare fuori con un paio di forbici, e lavare con PBS freddo.
- Incubare frammenti intestinali contenenti tumori nel buffer di chelazione EDTA (2 mM EDTA, 5,6 mmol / L di Na 2 HPO 4, 8.0 mmol / L KH 2 PO 4, 96,2 mmol / L di NaCl, 1,6 mmol / L KCl, 43,4 mmol / L di saccarosio, 54.9 mmol / L D-sorbitolo, 0,5 mmol / L di DL-ditiotreitolo in acqua distillata) per 60 min in ghiaccio.
- Dopo chelazione, la maggior parte delle normali cellule epiteliali intestinali sarà rimosso, mentre le cellule tumorali rimane collegata mesenchima. Aspirare il tampone di chelazione contenente cellule epiteliali normalie lavare il tumore residuo frammenta ancora una volta con 5 ml di tampone chelazione freddo.
- Aspirare il tampone di chelazione, lavare frammenti di tumore con 5 ml di freddo 1x PBS.
- Aspirare il PBS 1x off, incubare frammenti di tumore in tampone di digestione (2.5% siero fetale bovino, 1 unità / ml di penicillina, 1 mg / ml di streptomicina, e 2,5 ng / ml di amfotericina B, 200 U / ml di collagenasi di tipo IV, 125 mg / ml di tipo II dispasi in Dulbecco Modified Eagle Medium) per 2 ore a 37 ° C.
- Lasciare che il frammento di tumore a stabilirsi per gravità normale per 1 minuto e raccogliere il surnatante in una provetta Falcon 15. Pellet la singola cellula tumorale sospensione surnatante mediante centrifugazione a 200 xg per 3 min e lavare una volta con 5 ml di PBS mediante centrifugazione a 200 xg per 3 min.
2. Cultura di tumore intestinale
- Risospendere il pellet di cellule tumorali con 500 microlitri di PBS, contare le cellule tumorali isolate singole utilizzando un emocitometro.
- Pellet cellule tumorali di centorifuging a 200 xg per 3 min, e li risospendere in 5 mg / ml Matrigel su ghiaccio e piastra in piastre da 24 pozzetti a 15.000 cellule per 50 pl di Matrigel per pozzetto.
- Lasciare la Matrigel polimerizzare per 15 min a 37 ° C e aggiungere 500 microlitri / pozzetto basale terreno di coltura (1 unità / ml di penicillina, 1 mg / ml di streptomicina, e 2,5 ng / ml di amfotericina B, 10 mmol / L HEPES , 2mm Glutamax, 1x supplemento N2, 1x B27 supplemento, 1 mmol / L N-acetilcisteina in avanzata a Dulbecco Modified Eagle Medium/F12) contenente 50 ng / ml di EGF murino.
3. Manutenzione di organoidi Fondata
- Cambiare terreno di coltura contenente FEG ogni 2 giorni e passaggio organoidi 01:05 una volta alla settimana.
- Per passaging, sostituire il terreno di coltura con terreno di coltura fresco. Disturbare meccanicamente organoidi e Matrigel utilizzando una pipetta P1000 con punte tagliate e trasferire in una provetta Falcon 15. Un'ulteriore dissociazione meccanica viene ottenuta utilizzando un incendio lucidato Pasteur tubotte.
- Lavare organoidi dissociate con 5 ml di terreno di coltura e centrifugare a 200 xg per 2 min.
- Scartare il surnatante, risospendere il pellet con Matrigel e aggiungere mezzo di coltura come descritto sopra.
4. Conservazione e ripristino di organoidi Fondata
- Per la conservazione a lungo termine, congelare organoidi a liquido N 2 che sono stabili per almeno 2 anni. Per organoidi congelamento, può interferire con una pipetta P1000 con punte tagliate e trasferire in una provetta Falcon 15.
- Lavare organoidi dissociate con 5 ml di terreno di coltura e centrifugare a 200 xg per 2 min.
- Scartare il surnatante, risospendere il pellet con Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) contenente 20% di siero fetale bovino (FBS) e 10% di dimetilsolfossido (DMSO).
- Trasferire le cellule in 1,5 ml cryotubes, poi mettere i tubi in un Mr. Frosty contenitore congelamento Nalgene e conservare in un freezer -80 ° C per ottenere una velocità di raffreddamentodi -1 ° C / min. Dopo una notte di incubazione, trasferire i tubi in liquido N 2.
- Per il recupero, i organoidi congelati vengono scongelati rapidamente a 37 ° C a bagnomaria, lavare con terreno di coltura, centrifugare, risospendere in Matrigel e cultura con le condizioni sopra descritte.
5. Estrazione di RNA, estrazione di proteine ed immunoistochimica
- Estrazione dell'RNA: Le cellule vengono raccolti come descritto sopra per il passaggio. RNA è isolato con PicoPure TM RNA Isolation Kit secondo le istruzioni del produttore.
- Proteine di estrazione: pellet cellulari sono raccolti come descritto sopra e lisate in 100 microlitri tampone radioimmunoprecipitazione (RIPA; 50 mmol / L Tris-HCl pH 7.5, 150 mmol / L di NaCl, 2 mmol / L di EDTA, 1% NP-40, 0,1 % SDS) con 1x inibitore della proteasi.
- Immunoistochimica: Aspirare off mezzo di coltura cellulare, trasferire organoidi tumorali con P1000 pipetta con punte tagliate in Cryo-stampo e congelare immediatamente in tiscitare in giudizio medio congelamento (OCT) con ghiaccio secco. Sezioni congelate sono state tagliate a 7 micron e colorati come descritto in precedenza 26.
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Representative Results
La durata di un tumore del colon organoide da una formazione di tre mesi Apc min / + topo è mostrato in Figura 1. Al giorno 0, singole cellule potrebbero essere osservati diverse ore dopo la placcatura (Figura 1A). Al giorno 1, sopravvissero colon cellule epiteliali tumorali con nuclei refrattaria poteva essere rispettato. Al giorno 3, la dimensione delle cellule raddoppiato. Al giorno 6, il formato di organoide espansa più di dieci volte e ha mostrato segni di apoptosi nel mezzo. A 14 giorni, il orgnoids sarebbero cresciuti in compartimenti irregolari (Figura 1B). Qui abbiamo avuto 39,33 ± 22,05 organoidi / ben formato sotto la condizione di digestione di 200 U / ml di collagenasi per 2 ore, rispetto a nessun organoidi formatisi sotto la condizione digestione di 75 U / ml di collagenasi per 30 minuti in questo studio (Figura 1C).
Per mostrare questo modello di cultura organoide potrebbe essere utilizzato per lo studio funzionale, la colorazione di immunofluorescenza di β-cate nin, un componente integrale per via di segnalazione Wnt è mostrato in Figura 2. Le cellule colorate positivi per la β-catenina si trovano negli strati fuori dal organoide, che ha confermato modello di crescita con un lume centrale proposto dal gruppo Dr. Clevers '24.
Figura 1. Una formazione rappresentante organoide derivata da tumore colon preso da una a tre mesi Apc min / + topo è stato coltivato per (A) 0, 1, 3, 6 e (B) 14 giorni è mostrata. (C) Il tasso di successo della formazione organoide in due diverse condizioni di digestione collagenasi.
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Figura 2. Immunofluorescenza di β-catenina per organoidi derivate da un tumore del colon tratto da un tre-mese-vecchio Apc min / + mouse viene mostrato. 4 ',6-Diamidino-2-fenilindolo, Dihydrochloride (DAPI) è stato utilizzato per colorare nuclei.
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Discussion
Le procedure sperimentali descritte in questo protocollo permetterà di isolamento e la coltura di tumori al colon murini primari. Il protocollo è stato adattato dal lavoro seminale condotto dal Dott. gruppo Clevers 1,24,27. Abbiamo ottimizzato il tempo di digestione e la concentrazione di collagenasi per ottenere una migliore resa di organoidi tumorali. I punti critici sono la digestione delle cellule tumorali in cellule singole, Matrigel risospensione e cultura selettiva. Per la digestione delle cellule tumorali, per ottenere dissociazione efficiente dei tumori del colon e mantenere la loro vitalità, la digestione e la concentrazione di collagenasi dovrebbero essere empiricamente derivati e ottimizzati. Per esempio quando si utilizza collagenasi a 75 U / ml e l'incubazione di tempo di 30 minuti, non abbiamo otteniamo sospensioni di cellule tumorali singole e non organoidi sono formati in questa condizione nelle nostre mani. Mantenendo contatto cellula-cellula è segnalato per essere critica per le cellule tumorali coltura 28, qui utilizzando collagenasi a 300 U / ml e incubatiosi osserva anche n tempo di 3 ore, le cellule stromali contaminazione. Analogamente, Matrigel risospensione, la concentrazione e tempo di solidificazione dovrebbero essere determinati empiricamente. Le organoidi consentono la valutazione precisa del tumore epitelio. I organoidi stabilite dai tumori intestinali sono capaci di lungo termine cultura. Abbiamo prontamente utilizzato organoidi stabiliti per diversi mesi senza apprezzabili differenze nella proliferazione e differenziazione. Il organoide stabilito può essere geneticamente manipolato per atterramento e sovraespressione. Inoltre, i organoidi tumorali possono essere generati da campioni bioptici tumorali umani, pertanto la tecnica di coltura può essere usato per studiare meccanismo di base in modo specifico paziente. Via di Wnt è critico per lo sviluppo embrionale intestinale. Nell'intestino adulto Wnts sono critici per la normale proliferazione di cellule transito-amplificazione e disregolazione della via di Wnt è critica per tumorigenesi del colon 29. Selective cultura wiesimo FEG è sufficiente per mantenere la crescita del colon organoide tumore. Tuttavia, quando è integrato con Wnt3a, i organoidi crescono più efficientemente. Pertanto, le cellule sono sensibili alla crescita promuovendo effetti di ligandi Wnt, a differenza di diverse linee cellulari colon-derivati.
I organoidi più strettamente imitare l'epitelio intestinale di cancro del colon linee derivate stabiliti, e crediamo che fornirà dati più accurati e fisiologicamente rilevanti. Come descritto sopra, questa tecnica è utile per studiare l'iniziazione e meccanismi di progressione per il tumore del colon. Anche i organoidi tumorali forniranno dati più precisi nel valutare l'efficacia terapeutica dei trattamenti del cancro del colon.
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Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni a YMS dal National Institutes of Health (CA148828), L'Università del Michigan gastrointestinale Peptide Center e Jeffrey A. Colby Colon Cancer Research e Tom Liu Memorial Fondi della University of Michigan Comprehensive Cancer Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 356234 | 5 mg/ml |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | 375U/mg |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | 1.8U/mg |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF), Murine, Natural | Invitrogen | 53003-018 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | 100 x |
| B27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | 50 x |
| Glutamax-I | Gibco | 35050-079 | 100x |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165-5G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965-092 | |
| PicoPureTM RNA Isolation Kit | Invitrogen | KIT0204 |
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