Summary
一次マウス結腸腫瘍オルガノイドを確立するための簡単な方法が記載されている。通常のコロンは上皮ないのに対し、この方法では、結腸腫瘍細胞が生き残ると限られた成長因子を含む培地中でオルガノイドに成長するという特徴を利用しています。
Abstract
いくつかのヒトおよびマウスの大腸癌細胞株が確立された、そのような複数の細胞層、基底頂端極性、分化する能力、およびアノイキスなどの結腸腫瘍の生理学的完全性は大腸癌由来の細胞株で維持されていない。本研究では、佐藤T ら 1、大腸腫瘍の重要な生理機能を保持してから適応培養マウスの主結腸腫瘍オルガノイドするための方法を示しています。この方法は、腫瘍細胞が正常に比べて栄養素の条件を制限する上での成長を維持するという原理に基づいて、マウスの結腸腫瘍組織収集、隣接する正常結腸上皮解離、単一細胞に結腸腫瘍細胞を消化し、マトリゲルに結腸腫瘍細胞を包埋し、選択培養から成り上皮細胞。
原発腫瘍オルガノイド遺伝子組み換えマウスから単離した場合腫瘍自律FUNCTを評価するために非常に有用なシステムを提供特定の遺伝子のイオンである。また、腫瘍オルガノイドは遺伝子送達を瞑想ウイルスによる遺伝子操作に適している、大腸の腫瘍形成に関与し、したがってシグナル伝達経路は、また広範囲に過剰発現やノックダウンして調べることができます。原発腫瘍オルガノイド文化は、結腸腫瘍形成のためのメカニズムと治療法を研究する生理学的関連性の実現可能な手段を提供します。
Introduction
腸管上皮細胞が増殖し、脊椎動物の体2,3の他のすべての組織を上回る、臨時の速度で裏返します。腸管幹細胞（ISC）と通過増幅セルを含む分裂細胞、分泌（ゴブレット、パネートおよび腸内分泌細胞）または腸3のいずれかに分化する。 ISCは、陰窩の底に位置しています。パネート細胞は陰窩の一番下まで移動し、他の系統は絨毛3,4に上向きに移行するのに対し、長寿命です。ここでは細胞が微生物を含む腸の内容にさらされているとアノイキス誘発性アポトーシスのメカニズムを介して絨毛先端から流している。コロンは絨毛とパネート細胞を欠いていますが、恒常性を維持するためのメカニズムは4と似ています。
Wntシグナル伝達経路は、腸の増殖およびISCメンテナンス4において重要な役割を果たしているに関与している。番目の削除電子転写因子TCF4、Wntシグナルの下流エフェクターは、腸管幹細胞および組織破壊5の後続の損失につながる。同様に、Wntシグナル阻害剤DKK1のトランスジェニック発現は、上皮増殖を減少させ、分泌細胞系統6を枯渇させる。逆に、WntシグナルアゴニストR-スポンジン-1の過剰発現は、腸陰窩細胞7の強力かつ迅速な増殖を誘導する。
腸のホメオスタシスのためのWntシグナル伝達の重要性が与えられ、Wnt経路の変異は、しばしば結腸癌8において観察されている。大腸癌は、米国9のがんによる死亡の3番目の主要な原因である。赤身の肉やアルコールを過剰摂取は、身体活動の減少、そして継承と体細胞突然変異は結腸癌10,11のリスク要因であると考えられている。大腸腺腫性ポリポーシス（APC）遺伝子、キーWntシグナル伝達因子は、PAの大部分で変異されている12,13、家族散発、および大腸炎関連大腸癌とtients。 Axin2およびβ-カテニンを含むWntシグナル伝達経路に関与する他の因子の変異はまた、大腸癌14,15が観察される。しかしながら、結腸癌のための正確なメカニズムで効果的な治療法はまだ欠けている。結腸癌の分子機構の調査を容易にするために、積極的な細胞型に良性の癌の進行の異なる段階を示すヒト結腸癌細胞株は、16〜18が確立されている。別の転移特性を有するマウスの大腸癌細胞株もまた19,20入手可能である。彼らは密接に生体状態の模倣や、その他の生理学的に関連データ21を生成するので、それにもかかわらず、一次電池またはオルガノイド培養は、形質転換細胞株よりも好ましい。ほとんどの大腸癌由来の細胞ラインはlackin、板に取り付け単層としてまたは細胞懸濁液のような成長頂端 - 基底外側向きと細胞間のタイトジャンクションのgの。分化した細胞は、絨毛の先端に到達し、22を流しているとしても、 生体内での正常および腫瘍腸上皮細胞はアポトーシスと呼ばれるアノイキスの自発的な形を受ける。これらの機能は、細胞株で要約することが困難であるが、大腸癌23の発達過程において重要である。これらの機能は、プライマリオルガノイドに保持されます。また、腫瘍オルガノイド培養はin vivo試験に比べて遺伝子の腫瘍の自律機能を評価するための効率的なシステムを提供する。腸のin vivoでの遺伝子操作は、腸固有のドライバを使用したトランスジェニックおよび/ またはノックアウトマウスの作成 を通じ、主に時間のかかるプロセスです。しかし、腫瘍オルガノイドは容易にウイルス媒介遺伝子操作の影響を受けやすいので、正確な分子メカニズムを評価するための素晴らしいツールです。プライマリ腸腫瘍オルガノイド培養HAVeが可能と強力な手法であることが実証されて。プライマリ腸細胞培養は、単一の成体LGR5 +幹細胞24からin vitroでの陰窩·絨毛構造を持つ機能的な腸オルガノイドを確立することができます。これらオルガノイドは、再生25損傷結腸組織に移植し、移植することができます。培養条件のさらなる適応は、マウスとヒトの大腸小腸と1実現可能な大腸から類似の上皮オルガノイドをしていた。基礎培地とEGFがプライマリマウス結腸腫瘍オルガノイド1を成長させるために十分であるのに対し、一次正常な結腸上皮培養、基礎培地と同様にEGF、ノギン、R-スポンジンとWnt3aは含めて成長因子のために、必要不可欠である。ここでは、単離するための詳細なプロトコルを記述し、文化、および結腸腫瘍オルガノイドを生成します。
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Protocol
1。大腸腫瘍の単離と細胞解離
- 腸の腫瘍は、任意の散発または治療によって誘発される大腸癌モデルから単離することができる。マウスはCO 2で安楽死させなければならない。コロン次いで、冷リン酸緩衝食塩水（PBS）でフラッシュし、収集され、長手方向に開口している。実体顕微鏡を使用して腫瘍を含む領域を特定し、ハサミで出て解剖し、冷PBSで洗浄する。
- EDTAキレート化緩衝液（2 mMのEDTA、5.6ミリモル/ LのNa 2 HPO 4、8.0ミリモル/ L KH 2 PO 4、96.2ミリモル/ LのNaCl、1.6ミリモル/ LのKCl、43.4ミリモル/ Lスクロース、内腫瘍を含む腸断片をインキュベート氷上で60分間、D-ソルビトール54.9ミリモル/ L、蒸留水で0.5ミリモル/ L DL-ジチオスレイトール）。
- 腫瘍細胞が間葉に取り付けたままになりつつキレート化した後、正常な腸上皮細胞のほとんどは、切り離される。正常上皮細胞を含むキレート化バッファをオフに吸引5mlの冷たいキレート化バッファーで残留腫瘍断片をもう一度洗う。
- キレート化バッファをオフに吸引、5ミリリットル冷たい1×PBSで腫瘍フラグメントを洗う。
- 1×PBS、消化バッファー（2.5％ウシ胎児血清、ペニシリンの1単位/ ml、ストレプトマイシンを1μg/ mlであり、2.5 ngのアムホテリシンB、200 U / mlのIV型コラゲナーゼの/ mlでインキュベート腫瘍フラグメントをオフ吸引37℃で2時間125ダルベッコ改変イーグル培地でμgの/ mlのII型ディスパーゼ）℃、
- 腫瘍フラグメントは1分間通常の重力下で落ち着く、と15ミリリットルファルコンチューブに上清を回収することができます。ペレット3分間200×gで遠心分離し、3分間200×gで遠心分離することによって5ミリリットルPBSで1回洗浄することにより、単一細胞腫瘍サスペンション上澄み。
2。腸腫瘍の文化
- 500μlのPBSで腫瘍細胞ペレットを再懸濁し、血球計を用いて単離し、単一腫瘍細胞を数える。
- セントによってペレット腫瘍細胞3分間200 xgでrifuging、およびウェルあたりマトリゲル50μlの当たり15,000細胞で24ウェルプレートに氷と皿の上に5 mg / mlのマトリゲルでそれらを再懸濁します。
- マトリゲルは、37℃で15分間重合し、500よく基底/μlの培地（ペニシリン1単位/ ml、ストレプトマイシンを1μg/ mlの、および2.5 ngの/アムホテリシンB mlの、10ミリモル/ L HEPES追加してみましょう、2mMのグルタマックス、1X N2サプリメント、1X B27サプリメント、アドバンストダルベッコ改変イーグルMedium/F12 1ミリモル/ L N-アセチルシステイン）は50 ngの/ mlのマウスEGFを含む。
3。設立オルガノイドのメンテナンス
- 週に一度、EGF 2日おきと通路オルガノイド1:5に含む基礎培地を変更します。
- 継代のために、新鮮な基礎培地に培地を交換してください。機械的に遮断するヒントP1000ピペットを用いオルガノイドとマトリゲルを混乱させると15ミリリットルファルコンチューブに移す。さらに、機械的な解離は、火災磨かパスツールパイプを用いて達成されるって。
- 2分間200 xgで基礎培地と遠心分離機5mlの解離オルガノイドを洗ってください。
- 上清を捨て、マトリゲルでペレットを再懸濁し、上記のように培地を追加します。
4。ストレージと設立オルガノイドの回収
- 長期保存の場合は、少なくとも2年間安定である液体N 2中オルガノイドを凍結。凍結オルガノイドの場合、ヒントはカットオフと15ミリリットルファルコンチューブに移すとP1000ピペットを使用して混乱させる。
- 2分間200 xgで基礎培地と遠心分離機5mlの解離オルガノイドを洗ってください。
- 20％ウシ胎児血清（FBS）および10％ジメチルスルホキシド（DMSO）を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）でペレットを再懸濁し、上清を捨てる。
- 1.5 mlのクライオチューブに転送細胞は、その後℃の冷凍庫で冷却速度を達成するために-80でナルゲンミスターフロスティ冷凍コンテナとストアにチューブを入れて-1の°C /分。一晩インキュベートした後、液体N 2にチューブを移す。
- 回復のために、冷凍オルガノイドは急速に、上記の条件をマトリゲルと文化の中で再懸濁し、スピンダウン、基礎培地で洗浄し、37℃の水浴中で解凍されています。
5。 RNA抽出、タンパク質抽出と免疫組織化学
- RNA抽出：通路について上述したように細胞を収集する。 RNAは、製造業者の指示に従ってPicoPure TM RNAアイソレーションキットで分離されています。
- タンパク質抽出：細胞ペレットを上記のように、100μlの放射線免疫アッセイ緩衝液（RIPAで溶解集められ、50ミリモル/ LのTris-HCl pH7.5で、150ミリモル/ LのNaCl、2ミリモル/ L EDTA、1％NP-40、0.1 1xのプロテアーゼ阻害剤％SDS）。
- 免疫組織化学：細胞培養培地をオフに吸引し、クライオ金型にカットオフヒントをP1000ピペットで腫瘍オルガノイドを転送し、TISですぐに凍結ドライアイスで凍結培地（OCT）を訴える。凍結切片は7μmで 切断し、以前26説明したように染色した。
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Representative Results
/ +マウスは、 図1に示されている3ヶ月のApc 分から結腸腫瘍オルガノイド形成の時間経過。 0日目に、単一細胞をプレーティング（ 図1A）に続く数時間を観察することができた。 1日目、で耐火核を有する上皮細胞を観察することができた結腸腫瘍を生き延びた。 3日目に、細胞の大きさは倍増した。 6日目、オルガノイドの大きさは10倍以上に拡大し、途中でアポトーシスの兆候を示した。 14日目に、orgnoidsは不規則なコンパートメント（ 図1B）に成長するだろう。ここでは、39.33を持っていた±22.05オルガノイド/ウェル本研究では30分（ 図1C）のために75 U / mlのコラゲナーゼの消化条件で形成されていないオルガノイドに比べて、2時間200 U / mlのコラゲナーゼの消化条件で形成。
このオルガノイド培養モデルは、機能の研究では、β-ケイトの免疫蛍光染色を使用することができる表示する忍、Wntシグナル伝達経路の積分成分が図2に示されている。 β-カテニンの陽性染色された細胞は、博士Clevers 'グループ24が提案した中央の管腔と成長パターンを確認オルガノイド、外の層に位置しています。
図1。 3ヶ月のApc 分が/ +マウス（）が0、1、3、6、（B）は14日が表示されて培養した。から取ら結腸腫瘍由来代表オルガノイド形成二つの異なるコラゲナーゼ消化条件下でオルガノイド形成の（C）の成功率。
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図2。 / +マウスが表示されている3ヶ月のApc 分から取ら結腸腫瘍由来オルガノイドためのβ-カテニンの免疫蛍光染色。 4 '、6 -ジアミジノ-2 -フェニル、塩酸塩（DAPI）は核を染色するために使用された。
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Discussion
このプロトコルで説明する実験手順は、プライマリマウス大腸腫瘍の単離および培養のためにできるようになります。プロトコルは博士Cleversグループ1,24,27によって行わ精液の仕事から構成されている。我々は、腫瘍オルガノイドの良い収量を得るために消化時間とコラゲナーゼ濃度を最適化しました。重要なステップは、単一のセル、マトリゲル再懸濁、および選択培養への腫瘍細胞の消化を含む。腫瘍細胞の消化に、結腸腫瘍の効率的な解離を取得し、それらの生存率を維持するために、コラゲナーゼ消化および濃度は、経験的に導出され、最適化されなければならない。例えば、30分、75 U / ml及びインキュベーション時間にコラゲナーゼを使用した場合、我々は、単一の腫瘍細胞懸濁液としないオルガノイドを取得しなかったが、我々の手では、この条件で形成した。細胞-細胞接触を維持する300 U / ml及びincubatioにコラゲナーゼを使用する場合は、ここで、培養癌細胞28のために重要であると報告されているnは3時間、間質細胞汚染の時間も観察される。同様に、マトリゲル再懸濁、濃度、及び固化時間も経験的に決定されるべきである。オルガノイドは、腫瘍上皮の正確な評価を可能にする。腸の腫瘍から確立オルガノイドは長期培養が可能である。我々は容易に増殖と分化にかなりの違いがなくても数ヶ月のために確立されたオルガノイドを使用している。設立オルガノイドは遺伝的ノックダウンと過剰発現のために操作することができます。さらに、腫瘍オルガノイドは、ヒト腫瘍生検サンプルから生成することができるため培養技術は、患者固有の方法で基本的なメカニズムを研究するために使用することができる。 Wnt経路は、腸胚発生に重要である。成人の腸内では、Wntはトランジット増幅細胞とWnt経路の調節不全は、結腸腫瘍形成29のために重要である、通常の増殖に重要である。選択培養のWi第EGFは、結腸腫瘍オルガノイドの成長を維持するのに十分である。しかし、Wnt3aはで補充するとき、オルガノイドは、より効率的に成長する。したがって、いくつかの細胞は、結腸由来の細胞株とは異なり、Wntシグナルリガンドの効果を成長促進に応答する。
オルガノイドは、より密接に確立された大腸癌導出ラインより腸上皮を模倣し、そして我々は、より正確で生理学的に関連するデータを提供すると信じています。上述したように、この技術は、大腸癌の発生と進行のメカニズムを調べるために有用である。大腸癌治療の治療効果を評価する際、腫瘍オルガノイドは、より正確なデータを提供する。
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Disclosures
我々は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
本研究では、国立衛生研究所（CA148828）、ミシガン胃腸ペプチドセンターの大学、ミシガン大学総合がんセンターのジェフリーA.コルビーコロン癌研究とトム劉メモリアル基金からYMSへの補助金によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 356234 | 5 mg/ml |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | 375U/mg |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | 1.8U/mg |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF), Murine, Natural | Invitrogen | 53003-018 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | 100 x |
| B27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | 50 x |
| Glutamax-I | Gibco | 35050-079 | 100x |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165-5G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965-092 | |
| PicoPureTM RNA Isolation Kit | Invitrogen | KIT0204 |
References
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Creamer, B., Shorter, R. G., Bamforth, J. The turnover and shedding of epithelial cells. I. The turnover in the gastro-intestinal tract. Gut. 2, 110-118 (1961).
- Crosnier, C., Stamataki, D., Lewis, J. Organizing cell renewal in the intestine: stem cells, signals and combinatorial control. Nat. Rev. Genet. 7, 349-359 (2006).
- Medema, J. P., Vermeulen, L. Microenvironmental regulation of stem cells in intestinal homeostasis and cancer. Nature. 474, 318-326 (2011).
- Korinek, V., et al. Depletion of epithelial stem-cell compartments in the small intestine of mice lacking Tcf-4. Nat. Genet. 19, 379-383 (1998).
- Pinto, D., Gregorieff, A., Begthel, H., Clevers, H. Canonical Wnt signals are essential for homeostasis of the intestinal epithelium. Genes Dev. 17, 1709-1713 (2003).
- Kim, K. A., et al. Mitogenic influence of human R-spondin1 on the intestinal epithelium. Science. 309, 1256-1259 (2005).
- Reya, T., Clevers, H. Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature. 434, 843-850 (2005).
- Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A.
- Sesink, A. L., Termont, D. S., Kleibeuker, J. H., Vander Meer, R. Red meat and colon cancer: the cytotoxic and hyperproliferative effects of dietary heme. Cancer Res. 59, 5704-5709 (1999).
- Fearon, E. R.
- Nishisho, I., et al. Mutations of chromosome 5q21 genes in FAP and colorectal cancer patients. Science. 253, 665-669 (1991).
- Xue, X., et al. Hypoxia-inducible factor-2alpha activation promotes colorectal cancer progression by dysregulating iron homeostasis. Cancer Res. 72, 2285-2293 (2012).
- Liu, W., et al. Mutations in AXIN2 cause colorectal cancer with defective mismatch repair by activating beta-catenin/TCF signalling. Nat. Genet. 26, 146-147 (2000).
- Morin, P. J., et al. Activation of beta-catenin-Tcf signaling in colon cancer by mutations in beta-catenin or APC. Science. 275, 1787-1790 (1997).
- Brattain, M. G., Fine, W. D., Khaled, F. M., Thompson, J., Brattain, D. E. Heterogeneity of malignant cells from a human colonic carcinoma. Cancer Res. 41, 1751-1756 (1981).
- Leibovitz, A., et al. Classification of human colorectal adenocarcinoma cell lines. Cancer Res. 36, 4562-4569 (1976).
- Willson, J. K., Bittner, G. N., Oberley, T. D., Meisner, L. F., Weese, J. L. Cell culture of human colon adenomas and carcinomas. Cancer Res. 47, 2704-2713 (1987).
- Brattain, M. G., Strobel-Stevens, J., Fine, D., Webb, M., Sarrif, A. M. Establishment of mouse colonic carcinoma cell lines with different metastatic properties. Cancer Res. 40, 2142-2146 (1980).
- Ikubo, A., Aoki, Y., Nagai, E., Suzuki, T. Highly metastatic variant of a mouse colon carcinoma cell line, LM17 and its response to GM-CSF gene therapy. Clin. Exp. Metastasis. 17, 849-855 (1999).
- Basant, S. K., Rinesh, K. Principles Of Animal Cell Culture. Student Compendium. Textbook Student Edition. 6, 61-96 (2008).
- Vachon, P. H., et al. Differentiation state-selective roles of p38 isoforms in human intestinal epithelial cell anoikis. Gastroenterology. 123, 1980-1991 (2002).
- Darido, C., et al. Defective claudin-7 regulation by Tcf-4 and Sox-9 disrupts the polarity and increases the tumorigenicity of colorectal cancer cells. Cancer Res. 68, 4258-4268 (2008).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Yui, S., et al. Functional engraftment of colon epithelium expanded in vitro from a single adult Lgr5(+) stem cell. Nat. Med. 18, 618-623 (2012).
- Anderson, E. R., Xue, X., Shah, Y. M. Intestinal hypoxia-inducible factor-2alpha (HIF-2alpha) is critical for efficient erythropoiesis. J. Biol. Chem. 286, 19533-19540 (2011).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469, 415-418 (2011).
- Kondo, J., et al. Retaining cell-cell contact enables preparation and culture of spheroids composed of pure primary cancer cells from colorectal cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 6235-6240 (2011).
- Clevers, H., Nusse, R.
