Summary
기본 생쥐 대장 종양 organoid을 설정하는 간단한 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은 대장 종양 세포가 생존하고 상피 정상적인 결장하지 않는 반면, 제한된 성장 인자를 포함하는 미디어 organoids로 성장하는 기능을 사용합니다.
Abstract
여러 인간과 생쥐 대장 암 세포주가 설립되어 같은 여러 세포 레이어, 기저 정점 극성을 구별 할 수있는 능력, 그리고 anoikis으로 결장 종양의 생리적 무결성은 대장 암 유래 세포주에서 유지되지 않습니다. 본 연구 사토 T 등 1., 대장 종양의 중요한 생리적 기능을 유지에서 적응 배양 마우스 기본 대장 종양 organoids하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 종양 세포가 정상에 비해 영양 상태 제한에 성장을 유지한다는 원칙에 따라 마우스 결장 종양 조직 수집, 인접한 정상 대장 상피 세포 분리, 단일 세포로 결장 종양 세포의 소화, 마트 리젤로 결장 종양 세포를 포함하고, 선택적 문화로 구성 상피 세포.
유전자 변형 생쥐에서 분리 된 경우, 기본 종양 organoids 종양 자치 funct를을 평가하는 매우 유용한 시스템을 제공특정 유전자의 이온. 또한, 종양 organoids는 유전자 전달을 묵상 바이러스 유전자 조작 의무이다, 대장 종양에 관여하므로 신호 전달 경로는 광범위하게 발현 또는 최저로 조사 할 수 있습니다. 기본 종양 organoids 문화 결장 종양에 대한 메커니즘과 치료 양식을 연구하는 생리 적절하고 실현 가능한 방법을 제공합니다.
Introduction
장 상피 세포 증식과 척추 동물의 몸 2,3의 모든 다른 조직을 능가 특별한 속도로 뒤집습니다. 장 줄기 세포 (ISC)와 대중 교통 증폭 세포를 포함하여 분할 세포는 분비 (잔,에 Paneth 및 enteroendocrine) 세포 또는 장 세포로 분화 3. ISC는 지하실의 기지에 위치해 있습니다. 에 Paneth 세포는 지하실의 맨 아래로 이동하고 다른 계통이 융모 3,4 위쪽으로 마이그레이션하는 반면, 긴 수명입니다. 여기에 세포는 미생물을 포함한 창자 내용에 노출되어 anoikis에 의한 세포 사멸 메커니즘을 통해 융모 끝에서 창고입니다. 콜론 융모와에 Paneth 세포를 부족하지만, 항상성을 유지하기위한 메커니즘은 4와 비슷합니다.
Wnt 신호 전달 경로는 장내 증식과 ISC 유지 보수 4에 중요한 역할을에 연루되어있다. 일 삭제전자 전사 인자 TCF4, Wnt 신호의 다운 스트림 이펙터, 장 줄기 세포 및 조직 5의 후속 고장의 손실로 연결됩니다. 마찬가지로, Wnt의 억제 DKK1의 유전자 발현은 상피 증식을 감소시키고 분비 세포 계보는 6 고갈. 반대로, Wnt의 작용제 R-spondin-1의 과발현은 장 토굴 세포 7의 강력하고 신속한 확산을 유도합니다.
장 항상성에 대한 Wnt 신호의 중요성을 감안할 때, Wnt의 통로 돌연변이는 자주 결장암 8에서 관찰된다. 대장 암은 미국에서 9 암 사망의 세 번째 주요 원인이다. 붉은 고기와 알콜을 가진 과잉 섭취는 신체 활동을 감소시키고, 상속 및 체세포 돌연변이가 대장 암 10,11의 위험 인자로 간주됩니다. 대장 용종증 대장균 (APC) 유전자, 키 Wnt 신호 계수, 펜실베이니아의 대다수 변이가족, 산발적 및 대장염과 연관된 대장 암 12,13와 tients. Axin2과 β-catenin의 등 Wnt 신호 전달 경로에 관여 다른 요인의 변이는 대장 암 14,15에서 관찰된다. 그러나 대장 암에 대한 정확한 메커니즘과 효과적인 치료는 여전히 부족하다. 대장 암에 대한 분자 메커니즘의 조사를 용이하게하기 위해, 공격적인 세포 유형으로 양성에서 암 진행의 여러 단계를 나타내는 인간의 대장 암 세포 라인은 16-18 설립되었습니다. 다른 전이성 특성을 가진 마우스 대장 암 세포주도 19,20 사용할 수 있습니다. 그들은 밀접하게 생체 상태를 모방하고 더 생리학 관련 데이터에게 21을 생성하기 때문에 그럼에도 불구하고, 일차 전지 또는 organoid 문화가 변형 세포 라인을 선호합니다. 대부분의 대장 암 유래 세포주는 lackin, 플레이트에 부착 된 단층이나 세포 현탁액으로 성장정점 - 기저 방향과 세포 간의 긴밀한 접합 g. 차별화 된 세포는 융모 끝을 도달하고 22을 흘리다대로 또한, 생체의 정상 및 종양의 장 상피 세포가 사멸 되나 anoikis의 자연 형태를 겪는다. 이러한 기능은 세포 라인에 요점을 되풀이하기 어려운 있지만, 대장 암 (23)의 발달 과정에서 중요한 역할을합니다. 이러한 기능은 기본 organoids에 유지됩니다. 또한, 종양 organoid 문화는 생체 내 연구에 비해 유전자의 종양의 자율적 인 기능을 평가하는 효율적인 시스템을 제공합니다. 소장의 생체 내에서 유전자 조작은 주로 소장 특정 드라이버를 사용하여 형질 전환 및 / 또는 녹아웃 마우스를 만들 통해 시간이 소요되는 과정입니다. 그러나, 종양 organoids은 쉽게 바이러스 매개 유전자 조작에 순종함으로써 정확한 분자 메커니즘을 평가하기위한 훌륭한 도구입니다. 주 장내 종양 organoid 문화 HAVE가 가능하고 강력한 기술로 입증되었습니다. 기본 장 세포 배양은 단일 성인 Lgr5 + 줄기 세포 24에서 체외 토굴 - 융모 구조로 기능성 장 organoids을 설정할 수 있습니다. 이 organoids은 이식과 재생 25 손상된 결장 조직에 접목 할 수 있습니다. 배양 조건의 추가 적응 마우스 콜론과 인간의 소장 1 가능한 결장에서 유사한 상피 organoids을 만들었다. 기초 배지와 EGF는 기본 마우스 대장 종양 organoids 1 성장을위한 충분한 반면 차 정상 대장 상피 문화, 기초 배지뿐만 아니라에 대한 EGF, Noggin의, R-spondin과 Wnt3a 등의 성장 인자가 필수적이다. 여기에서 우리는 자세한 프로토콜, 격리 문화, 대장 종양 organoids을 생성하는 방법에 대해 설명합니다.
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Protocol
1. 대장 종양의 분리 및 세포 해리
- 장내 종양은 어떤 산발적 또는 치료에 의한 대장 암 모델에서 분리 할 수 있습니다. 마우스는 CO 2 안락사되어야한다. 콜론은 다음 찬 인산 완충 식염수 (PBS)로 플러시 수집 및 세로 방향으로 열립니다. 입체 현미경을 사용하여 종양을 포함하는 영역을 식별, 가위로 해부하고, 차가운 PBS로 씻어.
- EDTA 킬레이트 버퍼에 종양을 포함하는 장 조각 (2 mM의 EDTA, 5.6 mmol / L 나 2 HPO 4, 8.0 mmol / L KH 2 PO 4, 96.2 mmol / L의 NaCl, 1.6 mmol / L KCl을, 43.4 mmol / L 자당을 품다 얼음에 60 분 54.9 mmol / L D-소르비톨, 0.5 mmol / 증류수 L DL-디티 올 트레이 톨).
- 종양 세포는 간엽에 연결된 상태로 유지됩니다 동안 킬레이트 화 한 후, 정상적인 창자 상피 세포의 대부분은 분리됩니다. 정상 상피 세포를 포함하는 킬레이트 버퍼를 대기음그리고 남은 종양을 씻어 5 ML 차가운 킬레이트 버퍼를 한 번 더 파편.
- 킬레이트 버퍼를 대기음, 5 ML 차가운 1X PBS로 종양의 조각을 씻는다.
- 1X PBS를 대기음, 소화 버퍼에 종양의 조각 (2.5 % 태아 소 혈청, 페니실린의 1 단위 / ML, 스트렙토 마이신의 1 ㎍ / ㎖, 2.5 NG / 암포 테리 신 B의 ML 200 U / ML 유형 IV 콜라를 품다 37 2 시간 동안 125 ㎍ / Dulbecco의 수정 된 이글 매체에 ML 타입 II 디스 파제 (dispase)) ° C.
- 종양 조각은 1 분 동안 정상적인 중력 하에서 해결하고, 15 ML 팔콘 튜브에 뜨는를 수집 할 수 있습니다. 펠릿 3 분 200 XG에 원심 분리, 3 분 200 XG에 원심 분리하여 5 ML PBS로 한 번 세척하여 단일 세포 종양 서스펜션 뜨는.
2. 장내 종양의 문화
- 혈구를 사용하여 고립 된 단일 종양 세포를 계산, 500 μL PBS와 종양 세포 펠렛을 resuspend을.
- 센트 펠렛 종양 세포3 분 200 XG에 rifuging, 잘 당 마트 리젤 ㎕의 50 15,000 세포에서 24 - 웰 플레이트에 얼음 접시에 5 밀리그램 / ML 리겔에서 그들을 resuspend을.
- 마트 리젤은 37 ° C에서 15 분 동안 중합, 500도 기초 / μL 문화 매체 (페니실린의 1 단위 / ML, 스트렙토 마이신의 1 ㎍ / ㎖, 2.5 NG / 암포 테리 신 B의 ML, 10 mmol / L HEPES 추가 할 , 2mM의 Glutamax, 1X N2 보충, 1X B27 보충제, 고급 Dulbecco의 수정 된 이글 Medium/F12 1 mmol / L N-아세틸 시스테인) 50 NG / ML 쥐 EGF를 포함.
3. 설립 Organoids 유지 보수
- 일주일에 한 번 EGF 2 일 통과 organoids 1시 5분 모든을 포함하는 기저 문화 매체를 변경합니다.
- 과 Passaging를 들어, 신선한 기초 문화 매체와 문화 매체를 교체하십시오. 기계적으로 잘라 팁 P1000 피펫을 사용하여 organoids와 리겔을 중단하고 15 ML 팔콘 튜브로 전송할 수 있습니다. 또한 기계적 분리는 화재 광택 파스퇴르 파이프를 사용하여 수행됩니다TTE.
- 2 분 200 XG에 기초 배지와 원심 분리기 5 ㎖와 해리 organoids을 씻으십시오.
- 상층 액을 버리고, 마트 리젤과 펠렛을 resuspend을하고 위에서 설명한대로 문화 매체를 추가합니다.
4. 보관 및 설립 Organoids의 복구
- 장기 저장을 위해, 최소 2 년간 안정 액체 N 2 organoids을 동결. 냉동 organoids를 들어, 팁 잘라 15 ML 팔콘 튜브로 전송과 P1000 피펫을 사용하여 중단.
- 2 분 200 XG에 기초 배지와 원심 분리기 5 ㎖와 해리 organoids을 씻으십시오.
- 상층 액을 버리고, Dulbecco의 수정 이글 중간 (DMEM)는 20 % 태아 소 혈청 (FBS)와 10 % 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)를 함유 펠렛을 resuspend을.
- 1.5 ML의 cryotubes로 전송 세포는 다음 ° C 냉동고 냉각 속도를 달성하기 위해 -80에서 나르 겐 씨 서리가 내린 냉동 컨테이너 및 저장소에 튜브를 넣어-1 ° C / 분. 하룻밤 배양 한 후, 액체 N 2에 튜브를 전송합니다.
- 복구, 냉동 organoids 급속하게 37 ° 위에서 설명한 조건 리겔과 문화에 resuspend을 C 물 목욕, 스핀 다운, 기초 배지로 세척.에서 해동
5. RNA 추출, 단백질 추출 및 면역
- RNA 추출 : 통과를 위해 위에서 설명한대로 세포가 수집됩니다. RNA는 제조 업체의 지침에 따라 PicoPure TM RNA 분리 키트에 격리됩니다.
- 단백질 추출 : 위에서 설명한 (100 μL radioimmunoprecipitation 분석 버퍼에 RIPA를 용해으로 세포 펠렛을 수집, 50 mmol / L 트리스 - 염산 산도 7.5, 150 mmol / L 염화나트륨, 2 mmol / L EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 % NP-40, 0.1 1X 단백 분해 효소 억제제 % SDS).
- 면역 : 세포 배양 매체를 대기음, 극저온 주조로 잘라 팁 P1000 피펫 종양 organoids를 전송 및 TIS 즉시 정지드라이 아이스로 냉동 매체 (OCT를) 고소. 냉동 섹션은 7 μm의에서 잘라 이전 26 설명 된대로 염색 하였다.
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Representative Results
/ + 마우스가 그림 1에 나타나있다 3 개월 송출 분에서 대장 종양 organoid 형성의 시간 경과. 0 일에서 단일 세포 도금 (그림 1A)에 따라 몇 시간을 관찰 할 수 있습니다. 1 일에, 내화물 핵을 가진 대장 종양의 상피 세포가 관찰 될 수있다 살아 남았다. 3 일에서 세포의 크기가 두 배로. 매일 6시, organoid의 크기가 10 배 이상 확대하고 중간에 세포 사멸의 흔적을 보여 주었다. 하루에 14에서 orgnoids 불규칙한 구획 (그림 1B)로 성장할 것입니다. 여기에서 우리는 39.33가 있었다 ± 22.05 organoids / 물론이 연구에서 30 분 (그림 1C) 75 U / ㎖ 콜라의 소화 조건 하에서 형성없이 organoids에 비해, 2 시간 동안 200 U / ML 콜라의 소화 조건 하에서 형성했다.
이 organoid 문화 모델은 기능 연구, β-케이트의 면역 형광 염색에 사용될 수 표시하려면 닌, Wnt 신호 전달 경로에 대한 필수 구성 요소는 그림 2에 표시됩니다. β-catenin에 대한 긍정적 인 스테인드 세포는 박사 Clevers '그룹 (24)에 의해 제안 된 중앙 루멘과 성장 패턴을 확인 organoid의 아웃 레이어에 있습니다.
그림 1. 3 개월 송출 분 / + 마우스에서 촬영 결장 종양에서 파생 된 대표 organoid 형성은 (A) 0, 1, 3, 6, 배양되었다 (B) 14 일은 표시됩니다. 두 개의 서로 다른 콜라 소화 조건 organoid 형성 (C) 성공률.
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그림 2. / + 마우스가 표시됩니다 3 개월 송출 분에서 찍은 결장 종양에서 파생 organoids에 대한 β-catenin의 면역 형광 염색의. 4 ',6-Diamidino-2-페닐 인돌, 디 히드로 (DAPI)은 핵을 염색하는 데 사용되었다.
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Discussion
이 프로토콜에 설명 된 실험 절차는 기본 생쥐 대장 종양의 분리 및 문화하실 수 있습니다. 프로토콜은 박사 Clevers 그룹 1,24,27 수행 정액 직장에서 적응하고 있습니다. 우리가 종양 organoids의 더 나은 수율을 얻을 수있는 소화 시간과 콜라 농도를 최적화. 중요한 단계는 종양의 단일 세포로 세포의 소화, 마트 리젤의 부유하고, 선택적 문화를 이용하실 수 있습니다. 종양 세포 소화 순서대로 결장 종양의 효율적인 분리를 얻고 자신의 생존을 유지하기 위해, 콜라게나 제의 소화 농도는 경험적으로 도출하고 최적화해야한다. 예를 들어 30 분 75 U / ㎖와 배양 시간에 콜라게나 제를 사용하는 경우, 우리는 하나의 종양 세포 현탁액없이 organoids를 얻을하지 않았다가 우리 손에이 조건에서 형성되었다. 세포 - 세포 접촉을 유지하는 것은 300 U / ML 및 incubatio에서 콜라게나 제를 사용하는 경우 여기 배양 암 세포 28 중요한 것으로보고3 시간, 기질 세포 오염의 N 시간도 관찰된다. 마찬가지로, 마트 리젤의 부유, 농도 및 응고 시간은 경험적으로 결정되어야한다. organoids는 종양 상피 세포의 정확한 평가를 할 수 있습니다. 장내 종양에서 설립 organoids 장기 배양 할 수있다. 우리는 쉽게 증식과 분화에 상당한 차이가없이 몇 달 동안 설립 organoids를 사용했습니다. 설립 organoid는 유전자 최저 및 발현에 대한 조작 할 수 있습니다. 또한, 종양 organoids 인간 종양 생검 샘플에서 생성 할 수 있으므로 배양 기술은 환자가 특정 방식으로 기본 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. Wnt의 통로가 장 배아 발달에 중요합니다. 성인 소장에서 Wnts는 대중 교통 증폭 세포와 Wnt의 경로의 조절 장애 결장 종양 29 중요한의 정상적인 확산을 위해 중요하다. 선택적 문화 위스콘신일 EGF는 대장 종양의 organoid 성장을 유지하기 위해 충분하다. 그러나 Wnt3a으로 보충 할 때, organoids보다 효율적으로 성장한다. 따라서 세포는 여러 콜론 유래 세포주와 달리, Wnt는 리간드의 효과를 증진 성장에 반응한다.
organoids 더 밀접 설립 대장 암 유래 라인보다 장내 상피 세포를 모방하고, 우리는 더 정확하고 생리 학적으로 관련 데이터를 제공 할 것으로 판단된다. 위에서 설명한대로,이 기술은 대장 암 개시 및 진행 메커니즘을 조사하는 데 유용합니다. 대장 암 치료의 치료 효과를 평가하는 경우에도 종양 organoids 더 정확한 데이터를 제공합니다.
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Disclosures
우리는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
이 연구는 건강의 국립 연구소 (CA148828), 미시간 위장 펩티드 센터의 대학과 미시간 대학 종합 암 센터의 제프리 A. 콜비 대장 암 연구와 톰 리우 기념 기금에서 YMS에 교부금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 356234 | 5 mg/ml |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | 375U/mg |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | 1.8U/mg |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF), Murine, Natural | Invitrogen | 53003-018 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | 100 x |
| B27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | 50 x |
| Glutamax-I | Gibco | 35050-079 | 100x |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165-5G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965-092 | |
| PicoPureTM RNA Isolation Kit | Invitrogen | KIT0204 |
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