Summary
En enkel metode for å etablere primær murine colon tumor organoid er beskrevet. Denne metoden benytter den funksjonen som kolon kreftceller overleve og vokse inn organoids i media som inneholder begrensede vekstfaktorer, mens normal kolon epitel ikke.
Abstract
Flere menneskelige og murine tykktarm kreft cellelinjer er etablert, er fysiologisk integritet colontumorer eksempel flere cellelag, basal-apikal polaritet, evne til å skille, og anoikis ikke vedlikeholdes i tykktarm kreft avledet cellelinjer. Denne studien viser en metode for dyrking primære mus kolon svulst organoids tilpasset fra Sato T et al. En, som beholder viktige fysiologiske funksjoner av tykktarmskreft. Denne metoden består av mus kolon svulstvev samling, ved normal kolon epitel dissosiasjon, colon tumor celler fordøyelsen i enkeltceller, embedding kolon kreftceller inn matrigel, og selektiv kultur basert på prinsippet om at kreftceller opprettholde veksten på å begrense næringsforhold i forhold til normal epitelceller.
Den primære svulst organoids hvis isolert fra genmodifiserte mus gir en svært nyttig system for å vurdere svulst autonome funksjonsion av spesifikke gener. Videre svulst organoids er mottagelig for genetisk manipulasjon av virus mediterte genet levering, derfor signalveier involvert i tykktarmen tumorigenesis kan også bli grundig undersøkt av overexpression eller knockdown. Primærtumor organoids kultur gir en fysiologisk relevante og gjennomførbare måter å studere mekanismer og terapeutiske modaliteter for kolon tumorigenesis.
Introduction
Intestinal epitelceller sprer og slå over på en ekstraordinær rate, overgår alle andre vev i virveldyr kroppen 2,3. Skillelinjene celler, inkludert intestinal stamceller (ISC) og transitt-forsterke celler differensieres til enten sekretoriske (pokal, Paneth og enteroendocrine) celler eller enterocytter tre. ISC ligger ved foten av krypten. Paneth celler flytte ned til bunnen av krypter og lever lenge, mens andre linjene vandrer oppover til villi 3,4. Her cellene er utsatt for gut-innhold, inkludert bakterieflora og er utgytt fra villus tips gjennom en anoikis-indusert apoptose mekanisme. Selv om kolon mangler villi og Paneth celler, er mekanismen for å opprettholde homeostase lignende fire.
Wnt signalveien har vært innblandet i å spille en avgjørende rolle i intestinal spredning og ISC vedlikehold fire. Sletting av the transkripsjonsfaktor TCF4, en nedstrøms effektor av Wnt signalering, fører til tap av intestinal stamceller og påfølgende nedbryting av vevet fem. Tilsvarende reduserer transgene uttrykk for Wnt inhibitor DKK1 epiteliale spredning og utarmer sekretoriske celle linjene seks. Omvendt, induserer overuttrykte Wnt agonist R-spondin-en potent og rask spredning av intestinal krypten celler 7.
Gitt betydningen av Wnt signalering for intestinal homeostase, er Wnt veien mutasjoner ofte observert i tykktarmskreft åtte. Tykktarmskreft er den tredje største årsaken til død av kreft i USA ni. Overflødig inntak med rødt kjøtt og alkohol, redusert fysisk aktivitet, og arvet og somatiske mutasjoner anses å være risikofaktorer for tykktarmskreft 10,11. Den adenomatøs polypose coli (APC) genet, en viktig Wnt signalering faktor, er mutert i et flertall av patients med familiær, sporadisk, og kolitt-assosiert tykktarmskreft 12,13. Mutasjoner av andre faktorer involvert i Wnt signalveien inkludert Axin2 og β-catenin er også observert i tykktarmskreft 14,15. Imidlertid er den nøyaktige mekanismen og effektiv behandling for tykktarmskreft fortsatt mangler. For å lette etterforskningen av de molekylære mekanismer for tykktarmskreft, har menneskets tykktarm kreft cellelinjer som representerer ulike stadier av kreft progresjon fra en godartet til en aggressiv celletype er etablert 16-18. Mus kolon cellelinjer med ulike metastatisk egenskaper er også tilgjengelig 19,20. Likevel er primære celler eller organoid kulturer foretrukket over transformerte cellelinjer fordi de tett etterligne in vivo staten og generere mer fysiologisk relevante data 21. De fleste tykktarm-kreft avledet cellelinjer vokse som monolag festet til platen eller som en cellesuspensjon, ha hørg av apikal-basolateral orientering og trange veikryss mellom celler. Også, normal og svulst intestinal epitelceller in vivo gjennomgå en spontan form av apoptose betegnet anoikis som de differensierte cellene nå villus tips og er utgytt 22. Disse funksjonene er vanskelig å rekapitulere i cellelinjer, men er viktig i utviklingsprosessen av tykktarmskreft 23. Disse funksjonene er opprettholdt i grunnskolen organoids. I tillegg er de tumor organoid kulturer gi et effektivt system for å vurdere tumor autonome funksjoner av gener i forhold til in vivo studier. Genetisk manipulering in vivo av tarmen er en tidkrevende prosess hovedsakelig gjennom å skape transgen og / eller knockout mus ved hjelp av tarmen-spesifikke drivere. Men svulsten organoids er lett mottagelig for virus-medierte genetiske manipulasjoner og dermed et flott verktøy for å vurdere presise molekylære mekanismer. Primære intestinal tumor organoid kulturer have vist seg å være en mulig og kraftfull teknikk. Primær intestinal cellekultur kan etablere funksjonelle tarm organoids med krypten-villi struktur in vitro fra en enslig voksen Lgr5 + stamcelle 24. Disse organoids kan transplanteres og innpodet i skadet tykktarmen vev for regenerering 25. Ytterligere tilpasning av kultur forholdene hadde gjort lignende epiteliale organoids fra mus tykktarm og menneskelig tynntarm og tykktarm gjennomførbart en. For primære normal kolon epitel kultur, basal kultur medium samt vekstfaktorer inkludert EGF, Noggin, R-spondin og Wnt3a er avgjørende, mens basal kultur medium og EGF er tilstrekkelig for dyrking primære mus kolon svulst organoids en. Her beskriver vi en detaljert protokoll for å isolere, kultur, og generere kolon svulst organoids.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Colon Tumor Isolasjon og Cell Dissosiasjon
- Tarmsvulster kan isoleres fra noen sporadiske eller behandling-indusert tykktarmskreft modell. Musene bør avlives med CO 2. Kolon blir deretter oppsamlet, skylt med kald fosfatbuffret saltoppløsning (PBS) og åpnet langsetter. Identifisere områder som inneholder svulster ved hjelp av en stereomikroskop, dissekere ut med en saks, og vask med kaldt PBS.
- Inkuber intestinal fragmenter inneholdende tumorer i chelatering EDTA-buffer (2 mM EDTA, 5,6 mmol / L Na HPO 2 4, 8,0 mmol / l KH PO 2 4, 96.2 mmol / l NaCl, 1,6 mmol / l KCl, 43,4 mmol / L sukrose, 54,9 mmol / L D-sorbitol, 0,5 mmol / L DL-ditiotreitol i destillert vann) i 60 min på is.
- Etter chelation, vil de fleste av normal intestinal epitelceller tas av, mens kreftceller vil forbli festet til mesenchyme. Sug av chelation buffer som inneholder normale epitelcellerog vaske rest tumor fragmenter enda en gang med 5 ml kald buffer chelatering.
- Sug av chelation buffer, vaske svulst fragmenter med 5 ml kald 1x PBS.
- Aspirer utenfor 1X PBS, inkuberes tumor fragmenter i fordøyelsen buffer (2,5% føtalt bovint serum, 1 enhet / ml av penicillin, 1 ug / ml streptomycin, og 2,5 ng / ml amfotericin B, 200 U / ml type IV kollagenase 125 ug / ml type II dispase i Dulbeccos modifiserte Eagle Medium) i 2 timer ved 37 ° C.
- Tillat den tumor-fragment for å slå seg under vanlig tyngdekraft i 1 min, og samle supernatanten i et 15 ml Falcon-røret. Pellet enkelt celle tumor suspensjon supernatant ved sentrifugering ved 200 x g i 3 min og vaskes en gang med 5 ml PBS ved sentrifugering ved 200 x g i 3 min.
2. Culture of Intestinal Tumor
- Resuspender svulst celle pellet med 500 mL PBS, telle isolerte enkelt kreftceller ved hjelp av en hemocytometer.
- Pellet kreftceller ved ørerifuging ved 200 x g i 3 min, og resuspender dem i 5 mg / ml Matrigel på is og plate i 24-brønners plater ved 15 000 celler pr 50 ul av Matrigel per brønn.
- Let Matrigel polymerisere i 15 min ved 37 ° C, og tilsett 500 ul / brønn basal kulturmediet (1 enhet / ml av penicillin, 1 ug / ml streptomycin, og 2,5 ng / ml amfotericin B, 10 mmol / l HEPES , 2mm Glutamax, 1x N2 supplement, 1x B27 supplement, 1 mmol / L N-acetylcystein i Advanced Dulbeccos Modified Eagle Medium/F12) som inneholder 50 ng / ml murine EGF.
3. Vedlikehold av etablerte Organoids
- Endre basal kultur medium som inneholder EGF hver 2 dager og passage organoids 01:05 en gang i uken.
- For passaging, erstatte kultur medium med frisk basal kultur medium. Mekanisk forstyrre organoids og matrigel ved hjelp av en P1000 pipette med tips avskåret og overføre til en 15 ml falk tube. Ytterligere mekanisk dissosiasjon skjer ved hjelp av en brann polert rør PasteurTTE.
- Vask dissosiert organoids med 5 ml av basal kulturmedium og sentrifuger ved 200 xg i 2 min.
- Kast supernatanten, resuspender pelleten med Matrigel og tilsett dyrkningsmedium som beskrevet ovenfor.
4. Lagring og gjenoppretting av Etablert Organoids
- For langtidslagring, fryse organoids i flytende N 2 som er stabile i minst to år. For frysing organoids, forstyrre med en P1000 pipette med tips avskåret og overføre til en 15 ml falk tube.
- Vask dissosiert organoids med 5 ml av basal kulturmedium og sentrifuger ved 200 xg i 2 min.
- Kast supernatanten, resuspender pelleten med Dulbeccos modifiserte Eagle Medium (DMEM) inneholdende 20% føtalt bovint serum (FBS) og 10% dimetylsulfoksid (DMSO).
- Overfør celler i 1,5 ml kryorør, og deretter sette rørene i en Nalgene Mr. Frosty frysing beholder og oppbevar i en -80 ° C fryser for å oppnå en kjølende renteav 1 ° C / min. Etter inkubasjon over natten, overføre rør til flytende N 2.
- For utvinning, er de frosne organoids raskt tint i en 37 ° C vannbad, vask med basal kultur medium, spinner ned, resuspender i Matrigel og kultur med forholdene som er beskrevet ovenfor.
5. RNA Utvinning, Protein Extraction og Immunohistochemistry
- RNA Utvinning: Celler blir innsamlet som beskrevet ovenfor for passasje. RNA er isolert med PicoPure TM RNA Isolation Kit i henhold til produsentens instruksjoner.
- Protein Extraction: Cellepelleter er samlet som beskrevet ovenfor, og lysert i 100 pl radioimmunopresipitasjonsanalyse analysebuffer (RIPA, 50 mmol / L Tris-HCl pH 7,5, 150 mmol / l NaCl, 2 mmol / l EDTA, 1% NP-40, 0,1 % SDS) med 1x proteasehemmer.
- Immunhistokjemi: Sug off celledyrkingsmediet overføre svulst organoids med P1000 pipette med tips avskåret i Cryo-mold og fryse umiddelbart i tissaksøke frysemedium (OCT) med tørris. Frosne snitt ble kuttet på 7 mikrometer og farget som beskrevet tidligere 26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Klokka løpet av et kolon svulst organoid formasjon fra en tre måneder gammel APC min / + mus er vist i figur 1. På dag 0, kan enkeltceller observeres flere timer etter plating (figur 1A). På dag 1, overlevde kolon svulst epitelceller med ildfast kjerner kunne observeres. På dag 3, doblet størrelsen på cellene. På dagen seks, utvidet størrelsen på organoid mer enn ti ganger og viste tegn til apoptose i midten. På dag 14, ville orgnoids vokse i uregelmessige seksjoner (figur 1 B). Her hadde 39,33 ± 22,05 organoids / brønn dannet under fordøyelsen tilstand på 200 E / ml kollagenase i 2 timer, sammenlignet med ingen organoids dannet under fordøyelsen tilstand av 75 U / ml kollagenase i 30 minutter i denne undersøkelsen (figur 1C).
For å vise dette organoid kulturen modell kan brukes for funksjonell undersøkelse, immunofluorescerende farging av β-cate nin, en integrert komponent for Wnt signalveien er vist i figur 2.. De positive fargede celler for β-catenin er plassert i ut lag av organoid, som bekreftet vekstmønster med en sentral lumen foreslått av Dr. Clevers 'gruppe 24.
Figur 1. En representant organoid dannelsen avledet fra kolon svulst tatt fra en tre måneder gammel APC min / + mus ble dyrket for (A) 0, 1, 3, 6 og (B) 14 dager er vist. (C) Den vellykkede rate på organoid formasjon under to forskjellige kollagenaseklassene fordøyelsen forhold.
50210fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50210/50210fig2.jpg "/>
Figur 2. Immunofluorescent farging av β-catenin for organoids avledet fra et kolon svulst tatt fra en tre måneder gammel APC min / + mus er vist. 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole, dihydroklorid (DAPI) ble anvendt for å farge kjerner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De eksperimentelle prosedyrene som er beskrevet i denne protokollen vil gi rom for isolasjon og kultur av primære murine tykktarmskreft. Protokollen er tilpasset fra banebrytende arbeid utført av Dr. Clevers gruppe 1,24,27. Vi optimalisert fordøyelse tid og collagenase konsentrasjon for å få et bedre utbytte av tumor organoids. De kritiske trinnene omfatter svulst celle fordøyelsen i enkeltceller, Matrigel resuspensjon, og selektiv kultur. For tumorcelle fordøyelsen, for å oppnå effektiv dissosiasjon av colontumorer og beholder sin levedyktighet, bør fordøyelse og konsentrasjon av kollagenase blir utledet empirisk og optimalisert. For eksempel ved bruk av collagenase på 75 U / ml og inkubasjonstid på 30 min, hadde vi ikke få enkelt svulst cellesuspensjoner og ingen organoids ble dannet under denne tilstanden i våre hender. Opprettholdelse celle-celle kontakt er rapportert å være kritisk for dyrkning av kreftceller 28, her ved bruk av kollagenase ved 300 U / ml og incubation tid på 3 timer, stromal celler forurensning er også observert. Likeledes bør Matrigel resuspensjon, konsentrasjonen, og størkning tid også bestemmes empirisk. De organoids tillater presis vurdering av svulsten epitel. De organoids etablert fra tarmsvulster er i stand til langsiktig kultur. Vi har lett brukt etablerte organoids i flere måneder uten nevneverdige forskjeller i spredning og differensiering. Den etablerte organoid kan være genetisk manipulert for knockdown og overexpression. Videre kan de tumor organoids bli generert fra humane tumor-biopsier, og derfor ved dyrkingen teknikken kan brukes til å studere grunnleggende mekanisme i en pasient spesifikk måte. Wnt veien er kritisk for intestinal embryonal utvikling. I den voksne tarmen Wnts er kritiske for normal spredning av transitt-forsterke celler og feilregulering av Wnt veien er kritisk for kolon tumorigenesis 29. Selektiv kultur with EGF er tilstrekkelig for å opprettholde kolon svulst organoid vekst. Imidlertid, når supplert med Wnt3a, de organoids vokse mer effektivt. Derfor, cellene er tilpasset de vekstfremmende effekter av Wnt ligander, i motsetning til flere kolon-avledede cellelinjer.
De organoids nærmere etterligne intestinal epitel enn etablerte tykktarm kreft avledet linjer, og vi tror vil gi mer nøyaktige og fysiologisk relevante data. Som beskrevet ovenfor, er denne teknikken nyttig for å undersøke initiering og progresjon mekanismer for tykktarmskreft. Også svulsten organoids vil gi mer nøyaktige data når man vurderer den terapeutiske effekten av tykktarm kreft behandlinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet med tilskudd til YMS fra National Institutes of Health (CA148828), The University of Michigan Gastrointestinal Peptide Center og Jeffrey A. Colby Colon Cancer Research og Tom Liu Memorial Funds ved University of Michigan Comprehensive Cancer Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 356234 | 5 mg/ml |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | 375U/mg |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | 1.8U/mg |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF), Murine, Natural | Invitrogen | 53003-018 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | 100 x |
| B27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | 50 x |
| Glutamax-I | Gibco | 35050-079 | 100x |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165-5G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965-092 | |
| PicoPureTM RNA Isolation Kit | Invitrogen | KIT0204 |
References
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Creamer, B., Shorter, R. G., Bamforth, J. The turnover and shedding of epithelial cells. I. The turnover in the gastro-intestinal tract. Gut. 2, 110-118 (1961).
- Crosnier, C., Stamataki, D., Lewis, J. Organizing cell renewal in the intestine: stem cells, signals and combinatorial control. Nat. Rev. Genet. 7, 349-359 (2006).
- Medema, J. P., Vermeulen, L. Microenvironmental regulation of stem cells in intestinal homeostasis and cancer. Nature. 474, 318-326 (2011).
- Korinek, V., et al. Depletion of epithelial stem-cell compartments in the small intestine of mice lacking Tcf-4. Nat. Genet. 19, 379-383 (1998).
- Pinto, D., Gregorieff, A., Begthel, H., Clevers, H. Canonical Wnt signals are essential for homeostasis of the intestinal epithelium. Genes Dev. 17, 1709-1713 (2003).
- Kim, K. A., et al. Mitogenic influence of human R-spondin1 on the intestinal epithelium. Science. 309, 1256-1259 (2005).
- Reya, T., Clevers, H. Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature. 434, 843-850 (2005).
- Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A.
- Sesink, A. L., Termont, D. S., Kleibeuker, J. H., Vander Meer, R. Red meat and colon cancer: the cytotoxic and hyperproliferative effects of dietary heme. Cancer Res. 59, 5704-5709 (1999).
- Fearon, E. R.
- Nishisho, I., et al. Mutations of chromosome 5q21 genes in FAP and colorectal cancer patients. Science. 253, 665-669 (1991).
- Xue, X., et al. Hypoxia-inducible factor-2alpha activation promotes colorectal cancer progression by dysregulating iron homeostasis. Cancer Res. 72, 2285-2293 (2012).
- Liu, W., et al. Mutations in AXIN2 cause colorectal cancer with defective mismatch repair by activating beta-catenin/TCF signalling. Nat. Genet. 26, 146-147 (2000).
- Morin, P. J., et al. Activation of beta-catenin-Tcf signaling in colon cancer by mutations in beta-catenin or APC. Science. 275, 1787-1790 (1997).
- Brattain, M. G., Fine, W. D., Khaled, F. M., Thompson, J., Brattain, D. E. Heterogeneity of malignant cells from a human colonic carcinoma. Cancer Res. 41, 1751-1756 (1981).
- Leibovitz, A., et al. Classification of human colorectal adenocarcinoma cell lines. Cancer Res. 36, 4562-4569 (1976).
- Willson, J. K., Bittner, G. N., Oberley, T. D., Meisner, L. F., Weese, J. L. Cell culture of human colon adenomas and carcinomas. Cancer Res. 47, 2704-2713 (1987).
- Brattain, M. G., Strobel-Stevens, J., Fine, D., Webb, M., Sarrif, A. M. Establishment of mouse colonic carcinoma cell lines with different metastatic properties. Cancer Res. 40, 2142-2146 (1980).
- Ikubo, A., Aoki, Y., Nagai, E., Suzuki, T. Highly metastatic variant of a mouse colon carcinoma cell line, LM17 and its response to GM-CSF gene therapy. Clin. Exp. Metastasis. 17, 849-855 (1999).
- Basant, S. K., Rinesh, K. Principles Of Animal Cell Culture. Student Compendium. Textbook Student Edition. 6, 61-96 (2008).
- Vachon, P. H., et al. Differentiation state-selective roles of p38 isoforms in human intestinal epithelial cell anoikis. Gastroenterology. 123, 1980-1991 (2002).
- Darido, C., et al. Defective claudin-7 regulation by Tcf-4 and Sox-9 disrupts the polarity and increases the tumorigenicity of colorectal cancer cells. Cancer Res. 68, 4258-4268 (2008).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Yui, S., et al. Functional engraftment of colon epithelium expanded in vitro from a single adult Lgr5(+) stem cell. Nat. Med. 18, 618-623 (2012).
- Anderson, E. R., Xue, X., Shah, Y. M. Intestinal hypoxia-inducible factor-2alpha (HIF-2alpha) is critical for efficient erythropoiesis. J. Biol. Chem. 286, 19533-19540 (2011).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469, 415-418 (2011).
- Kondo, J., et al. Retaining cell-cell contact enables preparation and culture of spheroids composed of pure primary cancer cells from colorectal cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 6235-6240 (2011).
- Clevers, H., Nusse, R.
