Summary
Um método simples para determinar murino organóide tumor de cólon primário é descrito. Este método utiliza o recurso de que as células tumorais de cólon sobreviver e crescer em Organóides em meios contendo fatores de crescimento limitadas, enquanto cólon normais do epitélio não.
Abstract
Várias linhas celulares de cancro de cólon humano e murino foram estabelecidas, a integridade fisiológica de tumores do cólon, tais como diversas camadas de células, de polaridade apical-basal, a capacidade de diferenciar e anoikis não são mantidos em linhas celulares derivadas do cancro do cólon. O presente estudo demonstra um método para a cultura primária Organóides tumorais de cólon de rato adaptados de Sato T et al. 1, que mantém as características fisiológicas importantes de tumores do cólon. Este método consiste na recolha de tecido de tumor do cólon do rato, do epitélio do cólon normal adjacente dissociação, as células de tumor do cólon de digestão em células individuais, a incorporação de células tumorais de cólon em matrigel e cultura selectivo de acordo com o princípio de que as células tumorais manter o crescimento em condições limitantes de nutrientes em relação ao normal células epiteliais.
Os Organóides tumor primário se isolados de camundongos geneticamente modificados fornecer um sistema muito útil para avaliar Esta função autônoma tumorião de genes específicos. Além disso, os Organóides tumorais são passíveis de manipulação genética de vírus meditado entrega gene, portanto vias de sinalização envolvidas na carcinogênese do cólon também pode ser amplamente investigado pela superexpressão ou knockdown. Principal cultura Organóides tumor fornece um meio fisiológicas relevantes e viáveis para estudar os mecanismos e modalidades terapêuticas para tumorigenesis cólon.
Introduction
As células epiteliais intestinais proliferar e virar a um ritmo extraordinário, superando todos os outros tecidos do corpo dos vertebrados 2,3. As células que se dividem, incluindo as células-tronco intestinais (ISC) e células transit-amplificação diferenciar em qualquer secretora (taça, Paneth e enteroendócrinas) células ou enterócitos 3. A ISC está localizado na base da cripta. Células Paneth mover para a parte inferior das criptas e são de longa duração, ao passo que outras linhagens migrar para cima, para as vilosidades 3,4. Aqui, as células são expostas ao conteúdo, incluindo a microbiota intestinal e são eliminados a partir das pontas das vilosidades, através de um mecanismo de apoptose induzida por anoikis. Embora a falta de vilosidades do cólon e células de Paneth, o mecanismo para manutenção da homeostase é semelhante 4.
A via de sinalização Wnt tem sido implicada em desempenhar um papel fundamental na proliferação intestinal e ISC manutenção 4. Supressão do diae factor de transcrição TCF4, um efector a jusante de sinalização de Wnt, leva à perda de células estaminais intestinais e subsequente degradação do tecido 5. Do mesmo modo, a expressão transgénica do DKK1 inibidor Wnt reduz a proliferação epitelial e esgota 6 linhagens de células secretoras. Por outro lado, a superexpressão do agonista R-spondin Wnt-1 induz a proliferação potente e rápida das células cripta intestinais 7.
Dada a importância da via de sinalização Wnt para a homeostase intestinal, mutações via WNT são freqüentemente observadas no câncer de cólon 8. O cancro do cólon é a terceira principal causa de morte por câncer nos Estados Unidos 9. Ingestão em excesso de carne vermelha e álcool, atividade física reduzida, e herdou e mutações somáticas são considerados fatores de risco de câncer de cólon 10,11. O gene da polipose adenomatosa coli (APC), um factor de sinalização Wnt-chave, está mutado na maioria dos papacientes com DA familial, esporádico, e colite associada ao câncer de cólon 12,13. Mutações de outros fatores envolvidos na via de sinalização Wnt incluindo Axin2 e β-catenina também são observados no câncer de cólon 14,15. No entanto, o mecanismo preciso e tratamento eficaz para o câncer de cólon ainda estão faltando. Para facilitar a investigação sobre os mecanismos moleculares para o cancro do cólon, as linhas celulares de cancro de cólon humano que representam fases diferentes da progressão de um cancro benigno para um tipo de célula agressivo foram estabelecidas 16-18. Rato linhagens celulares de carcinoma de cólon com diferentes propriedades metastáticas também estão disponíveis 19,20. No entanto, as células primárias ou culturas organóide são preferidos sobre linhas de células transformadas, porque eles imitam de perto o estado em vivo e gerar mais fisiologicamente relevante de dados 21. A maioria das linhas de cancro do cólon, células derivadas crescer como monocamadas ligado à placa ou como suspensões de células, lacking de orientação apical-basolateral e junções apertadas entre as células. Além disso, as células epiteliais intestinais normais e tumorais in vivo, sofrem de forma espontânea de apoptose anoikis denominado como as células diferenciadas atingir as pontas das vilosidades e 22 são eliminados. Estas características são difíceis de recapitular em linhas de células, mas são importantes no processo de desenvolvimento de cancro do cólon 23. Estas características são mantidas em Organóides primários. Além disso, as culturas organóide tumor fornecem um sistema eficiente para avaliar as funções autónomas de genes tumorais em comparação com os estudos in vivo. A manipulação genética in vivo do intestino é um processo demorado, principalmente através da criação de transgênicos e / ou camundongos knockout usando drivers específicos de intestino. No entanto, os Organóides tumorais são facilmente passíveis de manipulações genéticas mediadas virais e, portanto, uma ótima ferramenta para avaliar mecanismos moleculares precisos. Primários intestinais culturas organoide tumorais have foi demonstrado ser uma técnica viável e poderosa. Cultura de células intestinal primária pode estabelecer Organóides intestinais funcionais, com estrutura da cripta-vilosidade in vitro a partir de um único adulto Lgr5 + células-tronco 24. Estes Organóides podem ser transplantadas e enxertados no tecido do cólon danificado para a regeneração 25. Além disso adaptação das condições de cultura fez Organóides epiteliais do cólon semelhantes rato e do intestino delgado e do cólon humano 1 viável. Para a cultura primária de cólon normal, epitélio, meio de cultura basal, assim como fatores de crescimento, incluindo EGF, Noggin, R-spondin e Wnt3a são essenciais, enquanto meio de cultura basal e EGF é suficiente para o cultivo de rato cólon Organóides tumores primários 1. Aqui nós descrevemos um protocolo detalhado para isolar, cultura e gerar Organóides tumor do cólon.
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Protocol
1. Colon isolamento do tumor e dissociação celular
- Tumores intestinais podem ser isolados a partir de qualquer modelo de cancro do cólon ou esporádica induzida pelo tratamento. Os ratos devem ser sacrificados com CO 2. Dois pontos são então recolhidos, lavados com solução salina fria tamponada com fosfato (PBS) e abertos longitudinalmente. Identificar as regiões que contêm tumores usando um microscópio estereoscópico, dissecar com um par de tesouras, e lave com água fria PBS.
- Incubar fragmentos intestinais tumores em tampão contendo quelante EDTA (EDTA 2 mM, 5,6 mmol / L de Na 2 HPO 4, 8,0 mmol / l de KH 2 PO 4, 96,2 mmol / L de NaCl, 1,6 mmol / L de KCl, 43,4 mmol / L de sacarose, 54,9 mmol / L de D-sorbitol, 0,5 mmol / L de DL-ditiotreitol em água destilada) durante 60 min em gelo.
- Depois de quelação, a maior parte das células epiteliais intestinais normais serão separadas, enquanto que as células tumorais irão permanecer ligada ao mesênquima. Aspirar fora o tampão de quelação contendo células epiteliais normaise lavar o tumor remanescente fragmentos mais uma vez com 5 ml de tampão frio de quelação.
- Aspirar fora do tampão de quelação, lave fragmentos do tumor com 5 ml frio 1x PBS.
- Aspirar fora da 1x PBS, incubar fragmentos tumorais em tampão de digestão (2,5% de soro fetal bovino, 1 unidade / ml de penicilina, 1 ug / ml de estreptomicina, e 2,5 ng / ml de anfotericina B, 200 U / mL de colagenase tipo IV, 125 ug / ml de tipo II dispase em Meio Eagle Modificado por Dulbecco) durante 2 horas a 37 ° C.
- Permitir que o fragmento de tumor que se contentar com a gravidade normal para 1 min, e recolher o sobrenadante em um tubo falcon de 15 ml. Pellet a única célula do tumor suspensão sobrenadante por centrifugação a 200 xg durante 3 minutos e lavar uma vez com 5 ml de PBS por centrifugação a 200 xg durante 3 min.
2. Cultura de tumor intestinal
- Ressuspender o sedimento de células tumorais com 500 mL PBS, contagem de células tumorais únicas isoladas usando um hemocitômetro.
- Pellet células tumorais por centorifuging a 200 xg durante 3 minutos, e voltar a suspender-los em 5 mg / ml de Matrigel em gelo e a placa em placas de 24 poços a 15.000 células por 50 pi por poço de Matrigel.
- Deixe o Matrigel polimerizar durante 15 minutos a 37 ° C e adicionar 500 uL / poço de meio de cultura basal (1 unidade / ml de penicilina, 1 ug / ml de estreptomicina, e 2,5 ng / ml de anfotericina B, 10 mmol / L de HEPES , Glutamax 2 mM, 1x suplemento N2, 1x suplemento de B27, 1 mmol / L de N-acetilcisteína em Avançado do Medium/F12 Eagle modificado por Dulbecco) que continha 50 ng / ml de EGF murino.
3. Manutenção de Organóides Fundada
- Alterar meio de cultura basal contendo EGF a cada 2 dias e passagem Organóides 01:05 uma vez por semana.
- Para passaging, substituir o meio de cultura com meio de cultura basal fresco. Mecanicamente perturbar Organóides e Matrigel usando uma pipeta P1000 com pontas cortadas e transferir para um tubo falcon de 15 ml. Além disso dissociação mecânica é conseguida usando um tubo de fogo Pasteur polidaTte.
- Lavar Organóides dissociadas com 5 ml de meio de cultura basal e centrifugar a 200 xg durante 2 min.
- Rejeitar o sobrenadante, ressuspender o sedimento com Matrigel e adicionar meio de cultura, tal como descrito acima.
4. Armazenamento e Recuperação de Organóides Fundada
- Para armazenamento a longo prazo, congelar Organóides em N2 líquido, que são estáveis durante pelo menos 2 anos. Para Organóides congelamento, romper com uma pipeta P1000 com as pontas cortadas e transferir para um tubo falcon de 15 ml.
- Lavar Organóides dissociadas com 5 ml de meio de cultura basal e centrifugar a 200 xg durante 2 min.
- Rejeitar o sobrenadante, ressuspender o sedimento com Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) contendo 20% de soro fetal bovino (FBS) e 10% de dimetilsulfóxido (DMSO).
- Transferir as células em 1,5 ml criotubos, em seguida, colocar os tubos em um Mr. Frosty recipiente de congelamento Nalgene e armazenar em um freezer -80 ° C para atingir a taxa de resfriamentode -1 ° C / min. Após incubação durante a noite, para transferir os tubos N2 líquido.
- Para a recuperação, os Organóides congelados são rapidamente descongeladas em 37 ° C em banho-maria, lave com meio de cultura basal, girar, ressuspender em Matrigel e cultura, com as condições descritas acima.
5. Extração de RNA, extração de proteínas e imuno-histoquímica
- Extracção de ARN: as células são colhidas como descrito acima para a passagem. O RNA é isolado com o PicoPure RNA Isolation Kit TM de acordo com as instruções do fabricante.
- Extracção de Proteína: As pelotas de células são recolhidas como descrito acima e foram lisadas em 100 ul de tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA, 50 mmol / L Tris-HCl pH 7,5, 150 mmol / l de NaCl, 2 mmol / L de EDTA, 1% de NP-40, 0,1 % SDS), 1x com inibidor da protease.
- Imunohistoquímica: Aspirar off meio de cultura celular, transferir Organóides tumorais com P1000 pipeta com as pontas cortadas em Cryo-mofo e congelar imediatamente em tisprocessar meio de congelamento (OCT) com gelo seco. Secções congeladas foram cortadas em 7 um e coradas como descrito previamente 26.
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Representative Results
O curso de tempo da formação de um tumor do cólon organóide de um período de três meses de idade, Apc min / rato + é mostrada na Figura 1. No dia 0, as células individuais podem ser observadas várias horas após plaqueamento (Figura 1A). No dia 1, sobreviveu cólon células epiteliais tumorais com núcleos refratário pode ser observado. No dia 3, o tamanho das células duplicou. No dia 6, o tamanho da organóide expandida mais do que dez vezes, e com sinais de apoptose no meio. No dia 14, os orgnoids iria crescer em compartimentos irregular (Figura 1B). Aqui nós tivemos 39,33 ± 22,05 Organóides / poço formado sob a condição de a digestão de 200 U / ml de colagenase durante 2 horas, em comparação com nenhum Organóides formados sob a condição de a digestão de 75 U / ml de colagenase durante 30 minutos neste estudo (Figura 1C).
Para demonstrar este modelo organóide cultura pode ser usado para o estudo funcional, coloração de imunofluorescência de β-cate nin, um componente integral de via de sinalização Wnt é mostrado na Figura 2. As células coradas positivas para β-catenina encontram-se nas camadas para fora da organóide, que confirmou o padrão de crescimento com um lúmen central proposto pelo grupo do Dr. Clevers '24.
Figura 1. Uma formação representativa organóide derivada do tumor do cólon feita a partir de um a três meses de idade, Apc min / rato + foi cultivado para (A) 0, 1, 3, 6 e (B) 14 dias é mostrado. (C) A taxa de sucesso de formação organoide sob diferentes condições de digestão colagenase.
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Figura 2. Coloração por imunofluorescência de β-catenina para Organóides derivadas de um tumor do cólon feita a partir de um a três meses de idade, Apc min / rato + é mostrada. 4 ',6-diamidino-2-fenilindol, Dicloridrato (DAPI) foi utilizado para corar núcleos.
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Discussion
Os procedimentos experimentais descritos no presente protocolo irá permitir o isolamento e cultura de tumores do cólon de murino primários. O protocolo é uma adaptação do trabalho seminal realizado pelo Dr. grupo Clevers 1,24,27. Nós otimizamos o tempo de digestão e da concentração de colagenase para obter um melhor rendimento de Organóides tumorais. As etapas críticas incluem a digestão tumor de células em células individuais, Matrigel ressuspensão e cultura seletiva. Para a digestão de células de tumor, de modo a obter a dissociação eficaz de tumores do cólon e manter a sua viabilidade, a digestão e a concentração de colagenase deve ser derivado empiricamente e optimizadas. Por exemplo, quando usando colagenase a 75 U / ml e tempo de incubação de 30 min, não obter suspensões de células tumorais individuais e não Organóides foram formados sob esta condição em nossas mãos. Manter contato célula-célula é relatado para ser crítico para a cultura de células de câncer de 28, quando aqui com colagenase a 300 U / ml e incubation tempo de 3 horas, as células do estroma de contaminação é também observada. Da mesma forma, Matrigel ressuspensão, a concentração e tempo de solidificação também deve ser determinado empiricamente. Os Organóides permitir uma avaliação precisa do epitélio tumor. Os Organóides estabelecidas a partir de tumores intestinais são capazes de cultura a longo prazo. Nós prontamente usado Organóides estabelecida há vários meses sem diferenças apreciáveis de proliferação e diferenciação. O organoide estabelecido podem ser manipulados geneticamente para knockdown e superexpressão. Além disso, os Organóides tumorais podem ser gerados a partir de amostras de biópsias de tumores humanos, por isso a técnica de cultura podem ser utilizadas para estudar mecanismo básico de um modo específico do paciente. A via Wnt é crítico para o desenvolvimento embrionário intestinal. No intestino adulto Wnts são críticas para a proliferação normal de células de trânsito-amplificação e a desregulação da via Wnt é crítico para a tumorigénese cólon 29. Seletiva cultura wiª EGF é suficiente para manter o crescimento do tumor de cólon organoide. No entanto, quando suplementadas com Wnt3a, os Organóides crescer de forma mais eficiente. Portanto, as células são sensíveis aos efeitos de promoção do crescimento de ligantes Wnt, ao contrário de várias linhas de células derivadas de cólon.
Os Organóides imitar mais de perto o epitélio intestinal de câncer de cólon linhas derivadas estabelecidos, e acreditamos que irá fornecer dados mais precisos e fisiologicamente relevante. Como descrito acima, esta técnica é útil para investigar o mecanismo de iniciação e progressão de cancro do cólon. Também os Organóides tumor irá fornecer dados mais precisos para avaliar a eficácia terapêutica dos tratamentos de câncer de cólon.
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Disclosures
Não temos nada a divulgar.
Acknowledgments
Este estudo foi financiado por subvenções a YMS do National Institutes of Health (CA148828), The University of Michigan Gastrointestinal Peptide Center, e Jeffrey A. Colby Colon Cancer Research e Tom Liu Memorial fundos do Comprehensive Cancer Center da Universidade de Michigan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 356234 | 5 mg/ml |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | 375U/mg |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | 1.8U/mg |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF), Murine, Natural | Invitrogen | 53003-018 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | 100 x |
| B27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | 50 x |
| Glutamax-I | Gibco | 35050-079 | 100x |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165-5G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965-092 | |
| PicoPureTM RNA Isolation Kit | Invitrogen | KIT0204 |
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