Summary
Простой способ создать первичные мышиные опухоли толстой кишки органоид описано. Этот метод использует функцию, что клетки опухоли толстой кишки выжить и развиваться в органоидов в средах, содержащих ограниченные факторы роста, в то время как нормальные эпителиальные толстой кишки нет.
Abstract
Несколько человеческих и мышиных толстой линии раковых клеток были созданы, физиологической целостности опухоли толстой кишки, таких как несколько слоев клеток, базально-апикальном полярность, способность различать, и аноикис не поддерживаются при раке толстой кишки клеточных линиях. Данное исследование демонстрирует способ для культивирования первичной опухоли толстой кишки мыши органоидами адаптировано из Sato T и соавт. 1, который сохраняет важные физиологические особенности опухолей толстой кишки. Этот метод состоит в толстой кишки мыши опухолевой ткани сбора, прилегающий нормальной толстой кишки эпителия диссоциации, толстой кишки опухолевых клеток пищеварение на отдельные клетки, клетки встраивания опухоли толстой кишки в матригеле, и селективное культуры, основанной на принципе, что опухолевые клетки поддерживать рост на ограничение питательных условий по сравнению с нормальными эпителиальных клеток.
Первичная опухоль органоидами если изолированы от генетически модифицированных мышей обеспечивают очень полезная система для оценки опухоли автономных функцион специфических генов. Кроме того, опухоли органоидами поддаются генетических манипуляций вирусом медитировал доставки генов, поэтому сигнальные пути, участвующие в толстой кишке туморогенез также может быть широко исследованы экспрессией или нокдаун. Первичная опухоль органоидами культура обеспечивает физиологическую актуальны и доступное средство для изучения механизмов и терапевтических методик для туморогенез толстой кишки.
Introduction
Кишечные эпителиальные клетки размножаются и перевернуть на внеочередной скоростью, опережая всех других тканей в теле позвоночных 2,3. Деления клеток, включая стволовые клетки кишечника (ISC) и транзита усиления клетки дифференцируются в секреторных либо (бокал, Панетом и энтероэндокринных) клетки или энтероцитов 3. ISC расположена в основании крипт. Панетом клетки перемещаются вниз к основанию крипт и долговечны, тогда как других линий мигрировать вверх к 3,4 ворсинки. Здесь клетки подвергаются воздействию содержимого кишечника в том числе микробиоты и навес с ворсинок советы через аноикис индуцированный механизм апоптоза. Несмотря на то, толстой кишки не хватает ворсинок и Панетом клетки, механизм для поддержания гомеостаза аналогична 4.
Сигнального пути Wnt участвует в играющих решающую роль в пролиферации и кишечной ISC обслуживание 4. Удаление йэлектронной фактора транскрипции TCF4, нижестоящим эффектором Wnt сигнализации, приводит к потере кишечных стволовых клеток и последующего распада ткани 5. Аналогично, трансгенной экспрессии гена Wnt DKK1 ингибитор снижает пролиферацию эпителиальных и истощает линий секреторными клетками, 6. И наоборот, избыточная экспрессия Wnt агонист R-spondin-1 индуцирует сильный и быстрым распространением кишечных клеток крипты 7.
Учитывая важность Wnt сигнализации для кишечных гомеостаз, Wnt пути мутации часто наблюдается при раке толстой кишки 8. Рак толстой кишки является третьей ведущей причиной смерти от рака в США 9. Избыток пищевого рациона с красным мясом и алкоголем, снижение физической активности, и унаследовал и соматические мутации считаются факторами риска рака толстой кишки 10,11. Аденоматозное полипозу палочка (APC) гена, ключевой фактор Wnt сигнализации, мутирует в большинстве годовыхПациенты с семейным, спорадический характер, и колиты связанных рака толстой кишки 12,13. Мутации других факторов, влияющих на сигнальный путь Wnt включая Axin2 и β-катенина наблюдаются также при раке толстой кишки 14,15. Тем не менее, точный механизм, и эффективная терапия для рака толстой кишки все еще отсутствуют. Для облегчения исследования молекулярных механизмов для рака толстой кишки, рака толстой кишки человека клеточных линий, представляющих различные стадии прогрессии рака от доброкачественных к агрессивному типу клеток были созданы 16-18 лет. Мышь клеток карциномы ободочной кишки линии с различными метастатических свойств также доступны 19,20. Тем не менее, первичные элементы или органоид культур предпочтительнее трансформированные клеточные линии, потому что они точно имитировать в естественных условиях и состоянии генерировать больше физиологически соответствующие данные 21. Большинство рак толстой кишки-клеточных линиях расти как монослой прикреплены к пластине или как клеточная суспензия, lackinг-апикальные базолатеральным ориентации и плотных контактов между клетками. Кроме того, нормальных и опухолевых клеток эпителия кишечника в естественных условиях подвергаются спонтанной формой называется апоптозом аноикис как дифференцированные клетки достигают ворсинок советы и опадает 22. Эти особенности трудно резюмировать в клеточных линиях, но играют важную роль в процессе развития рака толстой кишки 23. Эти функции поддерживаются в первичных органоидов. Кроме того, культуры опухолевых органоидные обеспечить эффективную систему оценки опухоли автономных функций генов по сравнению с в естественных условиях исследования. Генетические манипуляции в естественных условиях кишечника является трудоемким процессом в основном за счет создания трансгенных и / или нокаутом кишечнике мышей с использованием конкретных драйверов. Тем не менее, опухоль органоиды которые несложно вирусных опосредованной генетических манипуляций и таким образом отличный инструмент для оценки точные молекулярные механизмы. Первичные опухоли кишечного культур органоид ВГАэлектронной Было продемонстрировано, что возможно и мощная техника. Первичные культуры клеток кишечного может установить функциональные кишечные органоидами с Crypt-структуры ворсинок в пробирке из одного взрослого Lgr5 + стволовых клеток 24. Эти органоиды можно пересаживать и привиты в поврежденные ткани толстой кишки для регенерации 25. Далее адаптации условий культивирования сделал подобный эпителиальных органоидами из толстой кишки мыши и человека тонкого и толстого кишечника возможным 1. Для первичной культуры нормальных эпителий толстой кишки, основной культуральной среде, а также факторы роста, в том числе EGF, Noggin, R-spondin и Wnt3a являются существенными, в то время как основной культуральной среде и EGF достаточна для выращивания первичной органоидами толстой кишки мыши опухоли 1. Здесь мы опишем подробный протокол, чтобы изолировать, культуры, а также генерировать органоидами опухоли толстой кишки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Колон Изоляция опухоли и клеточная диссоциация
- Кишечных опухолей, могут быть выделены из любого спорадический или лечения модели индуцированного рака толстой кишки. Мыши должны быть умерщвлены с CO 2. Colons затем собирают, промывают холодным фосфатно-солевом буфере (PBS) и открыт в продольном направлении. Определить области, содержащие опухоли с использованием стереомикроскопа, рассекают с ножницами и промывают холодной PBS.
- Инкубируют кишечного фрагменты, содержащие опухоли в буфере комплексообразование ЭДТА (2 мМ ЭДТА, 5,6 ммоль / л Na 2 HPO 4, 8,0 ммоль / л KH 2 PO 4, 96,2 ммоль / л NaCl, 1,6 ммоль / л KCl, 43,4 ммоль / л сахарозы 54,9 ммоль / л D-сорбит, 0,5 ммоль / л DL-дитиотреитола в дистиллированной воде) в течение 60 мин на льду.
- После комплексообразования, большинство нормальных эпителиальных клеток кишечника будут отключены, а опухолевые клетки будут оставаться прикрепленной к мезенхимы. Аспирируйте от отравлений буфера, содержащего нормальные эпителиальные клеткии вымыть остатки фрагментов опухоли еще один раз 5 мл холодного буфера отравлений.
- Аспирируйте от отравлений буфера, мыть фрагментов опухоли с 5 мл холодной 1x PBS.
- Аспирируйте от 1 × PBS, инкубировать фрагментов опухоли в пищеварении буфером (2,5% фетальной бычьей сыворотки, 1 ед / мл пенициллина, 1 мкг / мл стрептомицина и 2,5 нг / мл амфотерицина В, 200 Ед / мл коллагеназы типа IV, 125 мкг / мл тип II диспаза в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла) в течение 2 ч при 37 ° С.
- Разрешить фрагмента опухоли урегулировать при нормальной тяжести в течение 1 мин, и собирают супернатант в 15 мл трубки сокола. Гранул одной клетки опухоли подвески супернатанта центрифугированием при 200 х г в течение 3 мин и промывают один раз 5 мл PBS центрифугированием при 200 х г в течение 3 мин.
2. Культура кишечные опухоли
- Ресуспендируйте опухоли осадок клеток с 500 мкл PBS, считать выделенной отдельной клетки опухоли с помощью гемоцитометра.
- Гранула опухолевых клеток процентаrifuging при 200g в течение 3 мин и ресуспендируют их в дозе 5 мг / мл Матригель на льду и пластины в 24-луночные планшеты при 15000 клеток на 50 мкл Matrigel на лунку.
- Пусть Матригель полимеризацию в течение 15 мин при 37 ° С и добавляют 500 мкл / лунку культуральной среды базальный (1 ед / мл пенициллина, 1 мкг / мл стрептомицина и 2,5 нг / мл амфотерицина В, 10 ммоль / л HEPES , 2 мМ Glutamax, 1x N2 добавка, 1x B27 добавки, 1 ммоль / л N-ацетилцистеина в модифицированной Дульбекко Расширенный Дульбекко Medium/F12), содержащей 50 нг / мл мышиного ЭФР.
3. Поддержанию установленного органоидами
- Изменение основной культуральной среде содержащие EGF каждые 2 дня и проход органоидами 1:05 раз в неделю.
- Для пассирования заменить культуральной среды свежей базальной среды культуры. Механически нарушить органоидов и Матригель использованием P1000 пипетки с советами отрезать и передать в 15 мл трубки сокола. Дальнейшей механической диссоциации достигается с помощью отожженной пастеровской трубыTTE.
- Мытье диссоциированных органоидами с 5 мл основной культуральной среде и центрифугируют при 200 х г в течение 2 мин.
- Жидкость над осадком сливают, ресуспендируют осадок матригелем и добавляют культуральную среду, как описано выше.
4. Хранения и восстановления Основанная органоидами
- Для длительного хранения, замораживания органоидов в жидком N 2, которые являются стабильными в течение не менее 2 лет. Для замораживания органоиды, нарушить использованием P1000 пипетки с советами отрезать и передать в 15 мл трубки сокола.
- Мытье диссоциированных органоидами с 5 мл основной культуральной среде и центрифугируют при 200 х г в течение 2 мин.
- Жидкость над осадком сливают, ресуспендируют осадок с Игла, модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM), содержащей 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 10% диметилсульфоксида (ДМСО).
- Передача клеток в 1,5 мл криопробирок, а затем положить в трубу Nalgene г-н Морозный замораживания контейнер и хранить в -80 ° C морозильник, чтобы достичь скорости охлажденияот 1 ° С / мин. После инкубации в течение ночи трубками в жидкий N 2.
- Для восстановления, замороженные органоидами быстро оттаивают в 37 ° С водяной бане, мыть с основной культуральной среде, спин вниз, ресуспендируют в матригеле и культуры с условиями, описанными выше.
5. Экстракция РНК, белков и добыча Иммуногистохимия
- Экстракция РНК: Клетки собирают, как описано выше для прохода. РНК выделяют с PicoPure TM Выделение РНК комплект в соответствии с инструкциями производителя.
- Белки Экстракция: Клеточный осадок собирают, как описано выше и лизируют в 100 мкл буфера для анализа радиоиммунопреципитации (RIPA; 50 ммоль / л Трис-HCl, рН 7,5, 150 ммоль / л NaCl, 2 ммоль / л ЭДТА, 1% NP-40, 0,1 % SDS) с 1x ингибитор протеазы.
- Иммуногистохимия: Аспирируйте от клеточной культуральной среде, передавать опухоли органоидами с P1000 пипетки с советами нарезают на Cryo-форму и немедленно заморозить в TISсуд среде замораживания (OCT) с сухим льдом. Замороженные срезы на 7 мкм и окрашивали, как описано выше 26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Временной ход органоид опухоли толстой кишки образование из трех-месячного Apc мин / + мышь показано на рисунке 1. В день 0, отдельные клетки можно было наблюдать несколько часов после покрытия (рис. 1А). В 1-й день, выжили опухоли толстой кишки эпителиальных клеток с огнеупорной ядер можно было наблюдать. На 3-й день, размер ячеек в два раза. На 6 день, размер органоид расширен более чем в десять раз и показал признаки апоптоза в середине. На 14-й день orgnoids будет расти в нерегулярные отсеков (рис. 1В). Здесь мы должны были 39,33 ± 22,05 органоидами / лунку формируется под пищеварение состояние 200 Ед / мл коллагеназы в течение 2 ч, по сравнению с отсутствием органоидами формируется под пищеварение состояние 75 Ед / мл коллагеназы в течение 30 мин в этом исследовании (рис. 1в).
Чтобы показать это, органоидные модели культуры могут быть использованы для функциональных исследований, иммунофлуоресцентного окрашивания β-ката Нин, неотъемлемым компонентом сигнального пути Wnt показано на рисунке 2. Положительных клеток, окрашенных в β-катенина расположены в слоях из органоидные, которые подтвердили рост рисунок с центральным просветом предложенный группа доктора Клеверса '24.
Рисунок 1. Представитель формирования органоид, полученных из опухоли толстой кишки, взятых из трех-месячного Apc мин / мышь + культивировали в течение () 0, 1, 3, 6 и (B) 14 дней показано. (C) успешный скорость органоидные образование в двух различных условиях пищеварение коллагеназы.
50210fig2highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50210/50210fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Иммунофлуоресцентного окрашивания β-катенина для органоидов, полученных из опухоли толстой кишки, взятых из трех-месячного Apc мин / + мышь показано. 4 ',6-диамидино-2-фенилиндол, дигидрохлорид (DAPI) был использован для окрашивания ядер.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Экспериментальные процедуры, описанные в данном протоколе позволит обеспечить изоляцию и культуры первичных мышиных опухолей толстой кишки. Протокол адаптирован из семенных работу д-ра Clevers группы 1,24,27. Мы оптимизировали время пищеварения и концентрации коллагеназы, чтобы получить лучший выход опухоли органоидов. Критические шаги включают в себя опухоли пищеварения клетки на отдельные клетки, Матригель ресуспендирование, и селективные культуры. Для опухоли пищеварение клетку, с тем чтобы получить эффективный диссоциации опухолей толстой кишки и поддержания их жизнеспособности, пищеварение и концентрации коллагеназы должны быть эмпирически и оптимизированы. Например, при использовании коллагеназы при 75 Ед / мл и инкубации в течение 30 мин, мы не получили одну опухолевую клетку суспензий и не органоиды были сформированы при этом условии в наших руках. Поддержание межклеточных контактов, как сообщается, критических для культивирования раковых клеток 28, вот при использовании коллагеназы при 300 ЕД / мл и incubatioN время 3 часа, стромальных клетках загрязнения наблюдается. Аналогично, Матригель ресуспендирования, концентрация и время затвердевания должна быть определена эмпирически. Органоидов позволяют точно оценить опухоль эпителия. Органоидами установлено от кишечных опухолей способны долгосрочной культуры. Мы легко использовать установленные органоидов в течение нескольких месяцев без заметного различия в пролиферации и дифференцировке. Установленные органоид может быть генетически модифицированные для нокдауна а избыточная экспрессия. Кроме того, опухоли органоидами могут быть получены из человеческих опухолевых образцах биопсии, поэтому культивирование метод может быть использован для изучения основной механизм у пациента определенным образом. Wnt пути является критической для кишечных эмбрионального развития. В кишечнике взрослого Wnts имеют решающее значение для нормальной пролиферации транзитно-усиливающих элементов и нарушения регуляции Wnt путь имеет решающее значение для толстой кишки туморогенез 29. Селективный культуры Wiй EGF является достаточным для поддержания роста опухоли толстой кишки органоидные. Однако, когда дополнен Wnt3a, органоиды расти более эффективно. Таким образом, клетки реагируют на стимулирующие рост эффекты Wnt лигандов, в отличие от нескольких толстой кишки полученных клеточных линий.
Органоидами более точно имитировать кишечного эпителия, чем установлено рака толстой кишки полученных линий, и мы считаем, обеспечит более точную и физиологически соответствующих данных. Как описано выше, этот метод полезен для исследования инициации и прогрессировании механизмы для рака толстой кишки. Кроме того, опухоли органоидами обеспечит более точные данные при оценке терапевтической эффективности лечения рака толстой кишки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантами для YMS из Национального института здоровья (CA148828), Мичиганский университет Желудочно-кишечный пептид центр, и Джеффри А. Колби исследований рака толстой кишки и Тома Лю Мемориал фондов Мичиганского университета онкологический центр Всеобъемлющее.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 356234 | 5 mg/ml |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | 375U/mg |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | 1.8U/mg |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF), Murine, Natural | Invitrogen | 53003-018 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | 100 x |
| B27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | 50 x |
| Glutamax-I | Gibco | 35050-079 | 100x |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165-5G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965-092 | |
| PicoPureTM RNA Isolation Kit | Invitrogen | KIT0204 |
References
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Creamer, B., Shorter, R. G., Bamforth, J. The turnover and shedding of epithelial cells. I. The turnover in the gastro-intestinal tract. Gut. 2, 110-118 (1961).
- Crosnier, C., Stamataki, D., Lewis, J. Organizing cell renewal in the intestine: stem cells, signals and combinatorial control. Nat. Rev. Genet. 7, 349-359 (2006).
- Medema, J. P., Vermeulen, L. Microenvironmental regulation of stem cells in intestinal homeostasis and cancer. Nature. 474, 318-326 (2011).
- Korinek, V., et al. Depletion of epithelial stem-cell compartments in the small intestine of mice lacking Tcf-4. Nat. Genet. 19, 379-383 (1998).
- Pinto, D., Gregorieff, A., Begthel, H., Clevers, H. Canonical Wnt signals are essential for homeostasis of the intestinal epithelium. Genes Dev. 17, 1709-1713 (2003).
- Kim, K. A., et al. Mitogenic influence of human R-spondin1 on the intestinal epithelium. Science. 309, 1256-1259 (2005).
- Reya, T., Clevers, H. Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature. 434, 843-850 (2005).
- Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A.
- Sesink, A. L., Termont, D. S., Kleibeuker, J. H., Vander Meer, R. Red meat and colon cancer: the cytotoxic and hyperproliferative effects of dietary heme. Cancer Res. 59, 5704-5709 (1999).
- Fearon, E. R.
- Nishisho, I., et al. Mutations of chromosome 5q21 genes in FAP and colorectal cancer patients. Science. 253, 665-669 (1991).
- Xue, X., et al. Hypoxia-inducible factor-2alpha activation promotes colorectal cancer progression by dysregulating iron homeostasis. Cancer Res. 72, 2285-2293 (2012).
- Liu, W., et al. Mutations in AXIN2 cause colorectal cancer with defective mismatch repair by activating beta-catenin/TCF signalling. Nat. Genet. 26, 146-147 (2000).
- Morin, P. J., et al. Activation of beta-catenin-Tcf signaling in colon cancer by mutations in beta-catenin or APC. Science. 275, 1787-1790 (1997).
- Brattain, M. G., Fine, W. D., Khaled, F. M., Thompson, J., Brattain, D. E. Heterogeneity of malignant cells from a human colonic carcinoma. Cancer Res. 41, 1751-1756 (1981).
- Leibovitz, A., et al. Classification of human colorectal adenocarcinoma cell lines. Cancer Res. 36, 4562-4569 (1976).
- Willson, J. K., Bittner, G. N., Oberley, T. D., Meisner, L. F., Weese, J. L. Cell culture of human colon adenomas and carcinomas. Cancer Res. 47, 2704-2713 (1987).
- Brattain, M. G., Strobel-Stevens, J., Fine, D., Webb, M., Sarrif, A. M. Establishment of mouse colonic carcinoma cell lines with different metastatic properties. Cancer Res. 40, 2142-2146 (1980).
- Ikubo, A., Aoki, Y., Nagai, E., Suzuki, T. Highly metastatic variant of a mouse colon carcinoma cell line, LM17 and its response to GM-CSF gene therapy. Clin. Exp. Metastasis. 17, 849-855 (1999).
- Basant, S. K., Rinesh, K. Principles Of Animal Cell Culture. Student Compendium. Textbook Student Edition. 6, 61-96 (2008).
- Vachon, P. H., et al. Differentiation state-selective roles of p38 isoforms in human intestinal epithelial cell anoikis. Gastroenterology. 123, 1980-1991 (2002).
- Darido, C., et al. Defective claudin-7 regulation by Tcf-4 and Sox-9 disrupts the polarity and increases the tumorigenicity of colorectal cancer cells. Cancer Res. 68, 4258-4268 (2008).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Yui, S., et al. Functional engraftment of colon epithelium expanded in vitro from a single adult Lgr5(+) stem cell. Nat. Med. 18, 618-623 (2012).
- Anderson, E. R., Xue, X., Shah, Y. M. Intestinal hypoxia-inducible factor-2alpha (HIF-2alpha) is critical for efficient erythropoiesis. J. Biol. Chem. 286, 19533-19540 (2011).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469, 415-418 (2011).
- Kondo, J., et al. Retaining cell-cell contact enables preparation and culture of spheroids composed of pure primary cancer cells from colorectal cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 6235-6240 (2011).
- Clevers, H., Nusse, R.
