Summary
Un método simple para establecer organoide del tumor de colon murino primaria se describe. Este método utiliza la característica de que las células de tumor de colon sobrevivir y crecer en organoides en medios que contienen factores de crecimiento limitadas, mientras que el colon normal epiteliales no lo hacen.
Abstract
Varias líneas celulares de cáncer de colon humano y murino se han establecido, la integridad fisiológica de los tumores de colon tales como múltiples capas de células, de polaridad basal-apical, la capacidad para diferenciar, y anoikis no se mantienen en el cáncer de colon líneas celulares derivadas. El presente estudio demuestra un método para el cultivo de ratón primarios de colon organoides tumorales adaptadas de Sato, T. et. Al 1, que conserva importantes funciones fisiológicas de los tumores de colon. Este método consiste en la recopilación ratón de tumor de colon tejido, adyacente normal del colon epitelio disociación, las células de tumor de colon digestión en células individuales, la incorporación de células de tumor de colon en matrigel, y cultivo selectivo basado en el principio de que las células tumorales mantener el crecimiento en condiciones de limitación de nutrientes en comparación a la normalidad células epiteliales.
Los organoids tumor primario si aisladas de ratones modificados genéticamente ofrecen un sistema muy útil para evaluar func autónoma tumoriones de genes específicos. Por otra parte, los organoides tumorales son susceptibles a la manipulación genética de virus meditado entrega de genes, por lo tanto, las vías de señalización implicadas en la tumorigénesis de colon podrían ser investigados exhaustivamente por la sobreexpresión o derribo. Organoids Primary cultura tumor proporciona un medio fisiológico pertinentes y viables para el estudio de los mecanismos y modalidades terapéuticas para la tumorigénesis de colon.
Introduction
Las células epiteliales intestinales proliferan y se entreguen a un ritmo extraordinario, superando a todos los otros tejidos en el cuerpo vertebrado 2,3. Las células que se dividen como las células madre intestinales (ISC) y células de tránsito de amplificación se diferencian en cualquiera de las células o los enterocitos 3 secretora (copa, Paneth y enteroendocrinas). El ISC se encuentra en la base de la cripta. Células de Paneth se mueven hacia abajo a la parte inferior de las criptas y son de larga vida, mientras que otros linajes migran hacia arriba a las vellosidades 3,4. Aquí las células se exponen a los contenidos del intestino, incluyendo la microbiota y se desprenden de las puntas de las vellosidades a través de un mecanismo de apoptosis inducida por la anoikis. Aunque el colon carece de vellosidades y células de Paneth, el mecanismo para el mantenimiento de la homeostasis es similar 4.
La vía de señalización de Wnt se ha implicado en jugar un papel crucial en la proliferación intestinal y mantenimiento ISC 4. Supresión de the TCF4 factor de transcripción, un efector corriente abajo de la señalización de Wnt, conduce a la pérdida de las células madre intestinales y posterior descomposición del tejido 5. Del mismo modo, la expresión transgénica de la DKK1 inhibidor de Wnt reduce la proliferación epitelial y agota linajes de células secretoras 6. Por el contrario, la sobreexpresión de Wnt el agonista R-espondina-1 induce la proliferación rápida y potente de células de las criptas intestinales 7.
Dada la importancia de la señalización de Wnt para la homeostasis intestinal, las mutaciones vía Wnt se observan frecuentemente en cáncer de colon 8. El cáncer de colon es la tercera causa principal de muerte por cáncer en Estados Unidos 9. El exceso de ingesta de la dieta con la carne roja y el alcohol, la reducción de la actividad física, y hereda y mutaciones somáticas se considera que son factores de riesgo de cáncer de colon 10,11. La coli (APC) gen poliposis adenomatosa, un factor clave de la señalización de Wnt, se encuentra mutado en la mayoría de los palos pacientes con familiar, esporádica, y el cáncer de colon asociado con la colitis 12,13. Las mutaciones de otros factores implicados en la vía de señalización Wnt incluyendo AXIN2 y β-catenina se observan también en cáncer de colon 14,15. Sin embargo, el mecanismo exacto y un tratamiento eficaz para el cáncer de colon todavía no existen. Para facilitar la investigación de los mecanismos moleculares para el cáncer de colon, colon humano líneas celulares de cáncer que representan diferentes etapas de la progresión del cáncer de un benigna a un tipo de célula agresiva se han establecido 16-18. Ratón de carcinoma de colon líneas celulares con diferentes propiedades metastásicas también están disponibles 19,20. Sin embargo, se prefieren las células primarias o cultivos de organoides a través de líneas celulares transformadas, ya que imitan el estado in vivo y generan más fisiológicamente relevante de datos 21. La mayoría de las líneas celulares derivadas de cáncer de colon crecen como monocapa unida a la placa o como suspensiones de células, lacking de la orientación apical-basolateral y uniones estrechas entre las células. Además, las células epiteliales intestinales normales y tumorales in vivo se someten a una forma espontánea de la apoptosis anoikis denominado como las células diferenciadas alcanzan las puntas de las vellosidades y se desprenden 22. Estas características son difíciles de recapitular en líneas celulares, pero son importantes en el proceso de desarrollo de cáncer de colon 23. Estas características se mantienen en organoides primarios. Además, los cultivos de organoides tumorales proporcionan un sistema eficaz para evaluar las funciones autónomas tumorales de genes en comparación con los estudios in vivo. La manipulación genética in vivo del intestino es un proceso que consume tiempo principalmente a través de la creación de transgénicos y / o ratones knockout el uso de controladores delgado-específicos. Sin embargo, los organoides tumorales son fácilmente susceptible de manipulaciones genéticas mediadas virales y por lo tanto una gran herramienta para la evaluación de los mecanismos moleculares precisos. Intestinales culturas organoides tumorales primarias VHAe ha demostrado ser una técnica segura y eficaz. Cultivo celular intestinal primaria puede establecer organoids intestinales funcionales, con estructura de las criptas-vellosidades in vitro a partir de un solo adulto LGR5 + células madre 24. Estos organoides pueden ser trasplantados y implantadas en tejido de colon dañado para la regeneración 25. Además la adaptación de las condiciones de cultivo había hecho organoides epiteliales similares de colon de ratón y el intestino delgado y el colon factible 1 humana. Para el cultivo primario de colon normal epitelio, medio de cultivo basal, así como factores de crecimiento, incluyendo EGF, Noggin, R-espondina y Wnt3a son esenciales, mientras que el medio de cultivo basal y EGF es suficiente para el cultivo de ratón de colon organoides tumor primario 1. Aquí se describe un protocolo detallado para aislar, la cultura, y generar organoids tumor de colon.
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Protocol
1. Aislamiento del tumor de colon y de disociación celular
- Tumores intestinales se pueden aislar a partir de cualquier modelo de cáncer de colon esporádico o inducida por el tratamiento. Los ratones deben ser sometidos a eutanasia con CO 2. A continuación se recogen dos puntos, enrojecida por el frío salina tamponada con fosfato (PBS) y se abren longitudinalmente. Identificar las regiones que contienen los tumores utilizando un microscopio estereoscópico, diseccionar con un par de tijeras, y lavar con PBS frío.
- Incubar los fragmentos que contienen los tumores intestinales en tampón de quelación con EDTA (2 mM de EDTA, 5,6 mmol / L de Na 2 HPO 4, 8,0 mmol / L de KH 2 PO 4, 96.2 mmol / l de NaCl, 1,6 mmoles / L de KCl, 43,4 mmol / L de sacarosa, 54,9 mmol / L de D-sorbitol, 0,5 mmoles / L de DL-ditiotreitol en agua destilada) durante 60 min en hielo.
- Después de quelación, la mayor parte de las células epiteliales intestinales normales será separado, mientras que las células tumorales se permanecer unidos a la mesénquima. Aspirar el tampón de quelación que contiene las células epiteliales normalesy lavar el tumor remanente fragmenta una vez más con Buffer 5 quelación frío ml.
- Aspirar el tampón de quelación, lavar fragmentos tumorales con 5 ml 1x PBS frío.
- Aspirar el PBS 1x, se incuban fragmentos de tumor en tampón de digestión (2,5% de suero bovino fetal, 1 unidad / ml de penicilina, 1 mg / ml de estreptomicina, y 2,5 ng / ml de anfotericina B, 200 U / ml de colagenasa de tipo IV, 125 g / ml de tipo II en dispasa de Eagle modificado por Dulbecco) durante 2 horas a 37 ° C.
- Deje que el fragmento de tumor se asiente por gravedad normal, durante 1 minuto, y recoger el sobrenadante en un tubo de 15 ml halcón. Se precipitan los sola célula tumoral suspensión sobrenadante por centrifugación a 200 xg durante 3 min y lavar una vez con 5 ml de PBS por centrifugación a 200 xg durante 3 min.
2. Cultura de tumor intestinal
- Resuspender el sedimento de células del tumor con 500 l de PBS, contar las células tumorales individuales aislados usando un hemocitómetro.
- Pellet células tumorales por cientorifuging a 200 xg durante 3 minutos, y volver a suspender en 5 mg / ml de Matrigel en hielo y la placa en placas de 24 pocillos a 15.000 células por 50 l de Matrigel por pocillo.
- Deje que el Matrigel polimerizar durante 15 min a 37 ° C, y añadir 500 l / pocillo basal medio de cultivo (1 unidad / ml de penicilina, 1 mg / ml de estreptomicina, y 2,5 ng / ml de anfotericina B, 10 mmol / L de HEPES , Glutamax 2 mM, 1x suplemento N2, 1x suplemento B27, 1 mmol / L de N-acetilcisteína en Avanzada de Eagle modificado por Dulbecco medium/F12) que contiene 50 ng / ml de EGF murino.
3. Mantenimiento de Organoides establecidos
- Cambio de medio de cultivo basal conteniendo EGF cada 2 días y paso organoides 1:05 una vez a la semana.
- Para pases, sustituir el medio de cultivo con medio de cultivo basal fresco. Mecánicamente interrumpir organoids y Matrigel utilizando una pipeta P1000 con puntas cortadas y transferir a un tubo de 15 ml halcón. Además disociación mecánica se realiza mediante un tubo de Pasteur pulida al fuegotte.
- Lavar organoides disociadas con 5 ml de medio de cultivo basal y se centrifuga a 200 xg durante 2 min.
- Descartar el sobrenadante, resuspender el precipitado con Matrigel y añadir medio de cultivo como se describe anteriormente.
4. Almacenamiento y recuperación de Organoides establecidos
- Para el almacenamiento a largo plazo, congelar organoides en N2 líquido que son estables durante al menos 2 años. Para organoids congelación, interrumpir el uso de una pipeta P1000 con puntas cortadas y transferir a un tubo de 15 ml halcón.
- Lavar organoides disociadas con 5 ml de medio de cultivo basal y se centrifuga a 200 xg durante 2 min.
- Descartar el sobrenadante, resuspender el precipitado con de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía 20% de suero bovino fetal (FBS) y 10% de dimetilsulfóxido (DMSO).
- Células de transferencia en criotubos de 1,5 ml, a continuación, poner los tubos en un recipiente Mr. Frosty congelación Nalgene y guardar en un congelador de -80 º C para alcanzar una velocidad de enfriamientode -1 º C / min. Después de la incubación durante la noche, traslado tubos en N2 líquido.
- Para la recuperación, los organoides congelados se descongelan rápidamente en un 37 ° C baño de agua, lavar con medio de cultivo basal, la desaceleración, resuspender en Matrigel y la cultura de las condiciones descritas anteriormente.
5. Extracción de ARN, extracción de proteínas y Inmunohistoquímica
- Extracción de ARN: Las células se recogen como se ha descrito anteriormente para el paso. Se aísla el ARN con PicoPure TM ARN kit de aislamiento de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Extracción de proteínas: Los sedimentos celulares se recolectan como se describió anteriormente y se lisaron en 100 l de tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA; 50 mmol / l de Tris-HCl pH 7,5, 150 mmol / l de NaCl, 2 mmol / l de EDTA, 1% NP-40, 0.1 % SDS) con 1 inhibidor de la proteasa.
- Inmunohistoquímica: Aspirar el medio de cultivo celular, transferir organoids tumorales con P1000 pipeta con puntas cortadas en Cryo-molde y congelar inmediatamente en tisdemandar medio de congelación (OCT) con hielo seco. Las secciones congeladas se cortaron a 7 micras y se tiñeron como se ha descrito previamente 26.
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Representative Results
El curso temporal de la formación de un tumor de colon organoide a partir de una de tres meses de edad, APC Min / + ratón se muestra en la Figura 1. En el día 0, las células individuales se pudieron observar varias horas después de chapado (Figura 1A). En el día 1, sobrevivieron de colon células epiteliales tumorales con núcleos refractario se pudo observar. En el día 3, el tamaño de las células se duplicó. En el día 6, el tamaño de organoide expandido más de diez veces y mostró signos de apoptosis en el medio. En el día 14, los orgnoids crecerían en compartimentos irregulares (Figura 1B). Aquí tuvimos 39,33 ± 22,05 organoides / pocillo formado en virtud de la condición de digestión de 200 U / ml de colagenasa durante 2 horas, en comparación con ningún organoides formados bajo la condición de digestión de 75 U / ml de colagenasa durante 30 min en este estudio (Figura 1C).
Para mostrar este modelo de cultivo organoide podría ser utilizado para el estudio funcional, la tinción de inmunofluorescencia de β-cate Nin, un componente integral para la vía de señalización Wnt se muestra en la Figura 2. Las células teñidas positivas para β-catenina se encuentran en las capas fuera de la organoide, que confirmó patrón de crecimiento con un lumen central propuesto por el grupo del Dr. Clevers '24.
Figura 1. Una formación de representante organoide derivada de tumor de colon tomado de un niño de tres meses de edad, APC Min / + ratón se cultivó para (A) 0, 1, 3, 6 y (B) 14 días se muestra. (C) La tasa de éxito de la formación de organoide bajo dos condiciones de digestión de colagenasa diferentes.
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Figura 2. Inmunofluorescencia tinción de β-catenina para organoides derivadas de un tumor de colon tomado de un niño de tres meses de edad, APC Min / + ratón se muestra. 4 ',6-diamidino-2-fenilindol, dihidrocloruro (DAPI) se usa para teñir los núcleos.
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Discussion
Los procedimientos experimentales descritos en este protocolo permitirán para aislamiento y cultivo de los tumores de colon primarios murinos. El protocolo es una adaptación del trabajo seminal realizado por el Dr. grupo Clevers 1,24,27. Hemos optimizado el tiempo de digestión y la concentración de colagenasa para obtener un mejor rendimiento de organoides tumorales. Los pasos críticos incluyen la digestión tumor de células en células individuales, Matrigel resuspensión, y cultivo selectivo. Para la digestión de células tumorales, con el fin de obtener la disociación eficiente de los tumores de colon y mantener su viabilidad, la digestión y la concentración de colagenasa se deben derivar empíricamente y optimizarse. Por ejemplo, al utilizar la colagenasa a 75 U / ml, y el tiempo de incubación de 30 minutos, no se obtuvieron suspensiones de células tumorales individuales y hay organoides se formaron bajo esta condición en nuestras manos. Mantener el contacto célula-célula se informó a ser crítico para el cultivo de células de cáncer de 28, cuando se utiliza aquí colagenasa a 300 U / ml y incubatioTambién se observa n tiempo de 3 horas, la contaminación de las células del estroma. Del mismo modo, Matrigel resuspensión, la concentración, y el tiempo de solidificación también deben ser determinadas empíricamente. Los organoids permiten evaluar con precisión el epitelio tumoral. Los organoides establecidas a partir de tumores intestinales son capaces de cultivo a largo plazo. Hemos utilizado fácilmente organoides establecido desde hace varios meses sin diferencias apreciables en la proliferación y la diferenciación. El organoide establecido puede ser manipulada genéticamente para la caída y la sobreexpresión. Por otra parte, los organoides tumorales pueden ser generados a partir de muestras de biopsias de tumores humanos, por lo que la técnica de cultivo puede ser utilizado para estudiar mecanismo básico de una manera específica del paciente. La vía Wnt es crítico para el desarrollo embrionario intestinal. En el intestino adulto Wnts son críticos para la proliferación normal de las células de tránsito-amplificación y la desregulación de la vía Wnt es crítico para la tumorigénesis de colon 29. Selectivo cultura wiª EGF es suficiente para mantener el crecimiento de colon organoide tumor. Sin embargo, cuando se complementa con Wnt3a, los organoides crecen de manera más eficiente. Por lo tanto, las células son sensibles a la promoción del crecimiento efectos de ligandos Wnt, a diferencia de varias líneas de células de colon-derivados.
Los organoids imitar más de cerca el epitelio intestinal de líneas derivadas de cáncer de colon establecidos, y creemos que va a proporcionar datos más precisos y fisiológicamente relevante. Como se describió anteriormente, esta técnica es útil para la investigación de la iniciación y la progresión de los mecanismos para el cáncer de colon. También los organoides tumorales proporcionarán datos más precisos para evaluar la eficacia terapéutica de los tratamientos de cáncer de colon.
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Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por becas a YMS de los Institutos Nacionales de Salud (CA148828), la Universidad de Michigan Gastrointestinal Peptide Center, y Jeffrey A. Colby Colon Cancer Research y los Fondos Liu Tom Memorial del Centro Integral del Cáncer de la Universidad de Michigan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 356234 | 5 mg/ml |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | 375U/mg |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | 1.8U/mg |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF), Murine, Natural | Invitrogen | 53003-018 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | 100 x |
| B27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | 50 x |
| Glutamax-I | Gibco | 35050-079 | 100x |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165-5G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965-092 | |
| PicoPureTM RNA Isolation Kit | Invitrogen | KIT0204 |
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