我们展示了一种新的动脉导管结扎术模型在小鼠spinotrapezius的肌肉,包括一步一步的程序和所需的仪器的描述。我们描述了外科手术和相关结果的测量,使用活体和共聚焦显微镜的血管网重构和功能的血管扩张有关。
的的小鼠spinotrapezius是薄的,肤浅的骨骼支撑肌肉,从T3到L4,是很容易通过背部皮肤切口。其独特的的解剖spinotrapezius有用的调查缺血性损伤和随后的血管重塑。在这里,我们展示了一个在我们的研究团队,是由先前公布的1-3的的小鼠spinotrapezius肌肉的小动脉结扎模型。对于某些脆弱的小鼠品系,如BALB / c小鼠,结扎手术可靠地创建骨骼肌缺血,作为一个平台,让调查疗法,刺激血管重建术。还证明,评估方法包括使用活体和共聚焦显微镜。非常适合spinotrapezius由于其可访问性(脊髓背解剖)和相对薄(60-200微米)等影像学检查。 spinotrapezius肌肉可以安装连接面,促进成像的无组织学切片的整个肌肉微血管网络。我们描述了使用的活体显微镜获取以下的功能性的血管舒张过程的度量,具体地,作为肌肉收缩的结果的增加在arterilar直径。我们还证明了收获和固定组织的程序,一个必要的前体,以免疫组化研究和激光共聚焦显微镜的使用。
调查缺血性疾病的病理生理过程,如外周动脉疾病,冠状动脉疾病,脑血管疾病,慢性缺血的动物模型是有价值的工具。在啮齿类动物,如人类,动脉闭塞导致的血管网结构重构,包括侧支血管和血管生成。在健康和年轻的患者,重塑足以拯救组织缺血损伤,但疾病,如糖尿病,严重危及重塑和恢复。了解血管重塑事件的机制是必不可少的疗法,刺激这些内源性心肌血运重建术过程。
目前,在后肢股动脉结扎或切除是标准的技术研究慢性缺血诱导的血管重塑的小动物4,5。的直径,连通性和反应性分析微血管,使结扎股动脉的血管网的下游,是困难的,但是,由于厚度的肌肉。我们已经开发了一个小动脉结扎模型中的的鼠标spinotrapezius肌肉:单方面的横向输送动脉结扎术,在这种稳定的背部肌肉1。相对的薄spinotrapezius(60-200微米)适合于连接面染色为评估整个网络的拓扑结构与单细胞分辨率,可以在整个组织中血管重塑事件的详细检查。的的spinotrapezius也是肤浅的访问,并因而它的船只很容易观察活体显微镜,高效的表征重塑和小动脉结扎血管反应性的影响。
在这份报告中,我们详细描述和展示的的鼠标spinotrapezius小动脉结扎模型。无论是在体内和体外我thods评估以下手术进行了描述,包括功能性血管扩张,这已被证明为减值缺血性条件下6,和免疫荧光成像的整个肌肉的微血管网络的测量。我们还包括了两个独立的试验研究为例,证明了该模型的结果。首先,我们利用动脉结扎模型,以诱使统计上的显着增加,血管迂曲,在C57BL / 6小鼠( 图2B)。曲折的增加在动脉形成的动脉的抵押品。在其他小鼠品系,更容易缺血,由于缺乏抵押品动脉( 例如,BALB / C),毛细动脉观察10。毛细管动脉被检测到增加的直径和α-平滑肌肌动蛋白的反应性的发展。二,功能性电刺激的肌肉导致终端小动脉的spinotrapezi的血管舒张功能的,( 图3B)。
这里提出的模型的小鼠spinotrapezius结扎是一种有效的小动物模型,研究动脉闭塞的功能和结构的调整所造成的。此模型是被广泛使用的后肢缺血模型4互补的,因为它提供了一个完整的微血管网络的高空间分辨率的整个肌肉的视图。此外,由于位于下方的背部皮肤肌肉,它是访问序列成像与活体显微镜,并通过灌流局部给药或薄膜植入2。这些特点使它成为一个有吸引力的小动物模型研究新的治疗靶点动脉闭塞的血管重构和功能的血管舒张的影响。
请注意结扎后肢模型获得的数据,由于几个键d的spinotrapezius结扎模型获得的数据进行比较时,应谨慎使用ifferences。首先,spinotrapezius肌肉稳定的肌肉,他们从不同的功能和纤维类型分布的腿部肌肉。我们的组先前已表明,小动脉结扎在spinotrapezius肌创建少或可忽略不计的缺氧菌株具有发达的抵押品小动脉的网络相比,在后肢观察后肢模型1,8股骨动脉结扎后的缺氧– 10。我们还表明,的spinotrapezius结扎模型产生不同的重构在Balb / c小鼠中的响应相比,C57BL / 6小鼠,Balb / c小鼠和C57BL / 6重塑通过扩大现有的小动脉连接3通过毛细管侧支重塑网络。这些意见和后肢结扎模型之间有一个有趣的平行,其中BALB / c小鼠经历长时间的灌注恢复结扎后相比,C57BL / 6小鼠9,11,12 </ SUP>。在组织缺血,鼠标年龄13性别14和存在的疾病15其他型号的,也会影响组织的小动脉闭塞,虽然我们还没有测试这些预测在spinotrapezius结扎模型。
其次,动脉结扎在spinotrapezius模型的大小基本上是小于股动脉,因此,结扎影响较小的组织体积,是进一步的下游, 即在较低的水平循环系统树,在spinotrapezius相比的后肢3。因此,结扎的位置,在这两个模型中的解剖差异时,应考虑本干预比较各自的生理反应( 例如血管重构)。
第三,可准许氧气到达unperfused的部分的组织从邻近的薄的spinotrapezius组织相比,在后肢的模型,如上面指出3合并缺血和缺氧。第四,恢复流的部分结扎下游spinotrapezius是比在后肢结扎更快。结扎模型的spinotrapezius是一个独特的慢性模型,不应该混淆与其他型号的短暂动脉闭塞或缺血再灌注损伤模型。我们认为这是可能的,以适应这种模型,以容纳这些类型的条件,但是,这是本文提出的工作范围之外。最后,我们提醒,反对直接相关的临床观察,在这个模型中,在人类缺血性疾病的临床表现,尤其是在利用年轻,健康的老鼠,由于固有的生理极限,如心脏率5。然而,我们认为这种新的模式作为一个有价值的工具发现的组织反应的基本机制连接和识别潜在的在体内设置rapeutic目标。
除了设置程序(解剖附注(6a)的,区分从静脉动脉(9a)中,并使用一个单一的绑带(11a)的)在spinotrapezius饲料动脉结扎手术票据,其他几个方面的程序受益于的讨论。
首先,边框(或尾到肩胛骨的几mm,如果透皮可视化是不可能的)在背侧脂肪垫的初始切口理想做得尽可能小为外科医生是舒服的,在操作过程中如果需要的话和扩大。这种做法最大限度地减少所需的缝合关闭切口,这是方便的外科医生,降低手术时间,并且也是在恢复过程中的动物的刺激性较小。另外,一个较大的皮肤切口可能是适当的,根据外科医生的偏好,由于肌肉具有扩展字段的定位可以更容易。在这种情况下,切口可受益于一个马蹄形状,内侧开脸,对脊柱进行折叠。同时使皮肤切口和延伸通过二级皮肤层,如果表面容器损坏,并导致出血,用无菌纱布和施加轻的压力,提供时间止血。
另外值得注意的,这是非常重要的处理与所需的最低要求的力的组织,并尽可能形体用钳子接近的肌肉的外侧边缘,并远离预期的缺血区。这种做法可以帮助避免挤压伤,这可能会导致额外的炎症介导的组织的反应,可能会混淆动脉结扎诱发的血管重塑响应。
总之,我们已经展示了作为模型研究血管和组织反应小动脉结扎手术的的小鼠spinotrapezius肌。这种模式是适合活体评估血管的变化(例如,例如,功能性血管舒张),以及用于体外血管变化的评估(例如,免疫荧光成像和定量血管网络)。这两种预-临床和临床研究已经证明,一个人的响应小动脉梗阻( 例如,通过结扎在小鼠或动脉粥样硬化斑块在人类中)是依赖于他们的年龄的存在或不存在的疾病( 如糖尿病)的阻塞动脉的直径,个人的基因构成和代谢需求的组织11-15。小鼠模型中,如这里介绍的,利用应变特定解剖和遗传差异和疾病特异性的表型,这有利于这些复杂的关系调查研究者。
The authors have nothing to disclose.
我们承认凯文·麦克劳德使用他的创作共用授权的音乐相关的视频,包括(按出场顺序),他的曲目“机场贵宾室”,“墙纸”和“晚报情节剧。”我们也想与手术视频他们的协助,承认Ndubisi Okeke和弗雷德里克Torstrick的。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Iris scissors | FST | 14090-09 | Type: Tool |
Size 7 forceps | FST | 11271-30 | Type: Tool |
Size 5 forceps | FST | 11251-20 | Type: Tool |
Spring scissors | Roboz | RS5671 | Type: Tool |
Microprobe | FST | 10140-03 | Type: Tool May be substituted with straight probe |
Needle holder | FST | 12500-12 | Type: Tool |
Induction chamber | JD Medical Dist. Co., Inc. | IC-1086 | Type: Equipment |
Eye Gel | Dechra | NDC 17033-211-38 | Type: Reagent |
Heat pad | FST | 21060-01 | Type: Equipment |
Rectal temperature probe | FST | 21060-01 | Type: Equipment |
Stimulating electrodes | FHC | UEWSGCSE0N1M | Type: Equipment |
Artisan’s Polymer Clay | Polyform | N/A | Type: Equipment |
PowerLab data acquisition system | ADInstruments | ML 845 | Type: Equipment |
Stimulus isolator | ADInstruments | FE 180 | Type: Equipment |
LabChart | ADInstruments | ML S060/7 | Type: Software |
Reflected-light fluorescent microscope | Olympus | BFXM | Type: Equipment |
High MW fluorescent dextran | Sigma | FD250S-100MG | Type: Reagent |
Video calipers | Colorado Video | 308 | Type: Equipment |
Automated Vascular Analysis (AVA) | Microvision Medical | Type: Software | |
Anti-αSMA Conjugated Fluorophore | Sigma | 1A4-Cy3 | Type: Reagent Clonal, 1:100 |
Fluorescent Microscope | Olympus | BFXM | Type: Equipment |
High-molecular weight fluorescent dextran | Sigma | FD250S-100MG | Type: Reagent |