Vi viser en ny arteriel ligation model i murine spinotrapezius muskler, herunder en trin-for-trin procedure og beskrivelse af ønsket instrumentering. Vi beskriver kirurgi og relevante resultater målinger af vaskulære netværk remodellering og funktionelle vasodilation med intravital og konfokal mikroskopi.
Den murine spinotrapezius er en tynd, overfladisk skelet support muskel, der strækker sig fra T3 til L4, og er let tilgængeligt via dorsal incision i huden. Dens unikke anatomi gør spinotrapezius anvendelige til undersøgelse af iskæmisk skade og efterfølgende mikrovaskulær remodeling. Her vil vi vise en arteriolær ligation model i den murine spinotrapezius muskel, der blev udviklet af vores forskning team og tidligere offentliggjorte 1-3. For visse udsatte musestammer, såsom Balb / c-mus, pålideligt denne ligering operation skaber skeletmuskulatur iskæmi og tjener som en platform for undersøgelse terapier, der stimulerer revaskularisering. Metoder til vurdering er også demonstreret, herunder brug af intravital og konfokal mikroskopi. Den spinotrapezius er velegnet til sådanne billeddiagnostiske undersøgelser på grund af dens tilgængelighed (overfladisk dorsal anatomi) og relativ tynd (60-200 um). Den spinotrapezius muskel kan monteres en face, lettebilleddannelse af hel-muskel mikrovaskulære netværk uden histologisk sektionering. Vi beskriver anvendelse af intravital mikroskopi at opnå målinger efter en funktionel vasodilation procedure specifikt øgede arterilar diameter som følge af muskelkontraktion. Vi viser også procedurerne for høst og fastsættelse af væv, en nødvendig forløber immunfarvning undersøgelser og brug af konfokal mikroskopi.
Dyremodeller for kronisk iskæmi er værdifulde værktøjer til undersøgelse patofysiologien af iskæmiske sygdomme, såsom perifer arteriesygdom, koronararteriesygdom og cerebrovaskulær sygdom. Hos gnavere, som hos mennesker arterieokklusion fører til strukturel omformning af det vaskulære netværk, herunder arteriogenese og angiogenese. Hos raske og yngre patienter, kan dette remodeling være tilstrækkeligt til at redde væv fra iskæmi-induceret skade, men co-morbiditet, såsom diabetes kan bringes i alvorlig fare remodeling og nyttiggørelse. Forstå mekanismerne bag vaskulær remodellering begivenheder er afgørende for at udvikle behandlinger, der stimulerer disse endogene revaskulariseringsprocedurer processer.
Currently, femorale arterie ligering eller resektion i bagbenet er standard teknik til at studere kronisk iskæmi-induceret vaskulær remodellering i små dyr 4,5. Analyse af diameteren, forbindelse og reaktiviteten afde mikrokar, der udgør det vaskulære netværk nedstrøms for den ligerede femorale arterie er imidlertid vanskeligt på grund af tykkelsen af musklerne. Vi har udviklet en arteriolær ligation model i mus spinotrapezius muskel: unilateral ligering af den laterale foder arterie i denne stabiliserende rygmuskel 1. De relativt tynde spinotrapezius (60-200 um) er modtagelig for en face immunfarvning for vurdering af hele netværkstopologi med encellede opløsning, der giver en detaljeret gennemgang af vaskulær remodellering arrangementer på tværs af hele væv. Det spinotrapezius er også overfladisk og tilgængelig, og dermed dets skibe er let ses af intravital mikroskopi, til effektiv karakterisering af virkningen af remodeling og arteriolær ligation på vaskulær reaktivitet.
I denne rapport beskriver vi i detaljer og demonstrere musen spinotrapezius arteriole ligation model. Både in vivo og ex vivo migthods skøn efter operation er beskrevet, herunder måling af funktionel vasodilation, som har vist sig at være forringet under iskæmiske tilstande 6 og immunofluorescent afbildning af hel-muskel mikrovaskulære netværk. Vi har også omfatte resultaterne af to separate pilotundersøgelser at demonstrere anvendeligheden af modellen. For det første anvendte vi den arterielle ligation model til at inducere en statistisk signifikant stigning i beholderen snoning i C57BL / 6 mus (figur 2B). Tortuositet stiger under arteriogenese i arteriole soeskende. I andre musestammer, er der mere sårbare over for iskæmi på grund af fravær af CSA arterioler (fx Balb / c), er kapillær arterialization observeret 10. Kapillær arterialization detekteres af øgede diametre og udvikling af α-glat muskel-actin reaktivitet. Sekund, funktionel elektrisk stimulering af musklen medfører vasodilatation i terminale arterioler i spinotrapezios (figur 3B).
Den murine spinotrapezius ligation model præsenteres her er en effektiv lille dyremodel til at studere de funktionelle og strukturelle tilpasninger, der skyldes en arteriel okklusion. Denne model er komplementær til den vidt udbredte bagben iskæmimodel 4, idet den tilvejebringer en hel-muskel billede af intakte mikrovaskulære netværk med høj rumlig opløsning. Endvidere, fordi denne muskel er placeret lige under den dorsale hud, er den tilgængelig for seriel billeddannelse med intravital mikroskopi, og til lokal lægemiddelafgivelse via superfusionssystem eller tynd film implantation 2. Disse funktioner gør det et attraktivt lille dyremodel, hvor at studere virkningerne af nye terapeutiske mål for vaskulær remodellering og funktionel vasodilation efter arteriel okklusion.
Bemærk, at forsigtighed bør udvises, når man sammenligner data erhvervet i spinotrapezius ligatur model til data indsamlet i bagbenet ligatur model på grund af flere nøgle differences. Først er de spinotrapezius muskler stabiliserende muskler, og de adskiller sig fra benmusklerne i form af funktion og fibertype distribution. Vores gruppe har tidligere påvist, at arteriolerne ligation i spinotrapezius muskel skaber mindre eller ubetydelig iltsvind i stammer med veludviklede sikkerhedsstillelse arteriolære netværk, sammenlignet med den hypoxi observeret i bagpote efter femoralarterien ligation i bagbenet model 1,8 – 10. Vi har også vist, at spinotrapezius ligation model giver en anden remodeling respons i Balb / c mus sammenlignet med C57BL / 6 mus, med Balb / c-mus net remodeling ved kapillær sikkerhedsstillelse og C57BL / 6 remodeling ved udvidelse af eksisterende arteriolære forbindelser 3. Der er en interessant parallel mellem disse observationer og oplysningerne i bagbenenes ligation modeller, hvor Balb / c-mus oplever en forlænget perfusion genopretning efter ligering sammenlignet med C57BL / 6 mus 9,11,12 </ Sup>. I andre modeller af vævsiskæmi, mus 13 år køn 14 og forekomsten af sygdommen 15 også påvirke de væv svar på arteriolær okklusion, selv om vi endnu ikke har testet disse prædiktorer i spinotrapezius ligation model.
For det andet er størrelsen af arterien, der er ligeret i spinotrapezius model er væsentlig mindre end den femorale arterie, og derfor ligeringen påvirker et mindre vævsvolumen, der er yderligere nedstrøms, dvs ved et lavere niveau af kredsløbet træet, i spinotrapezius sammenlignet med bagbenet 3. Derfor bør den anatomiske forskelle i placeringen af ligering i disse to modeller tages i betragtning, når man sammenligner de respektive fysiologiske reaktioner (f.eks vaskulær remodellering) til dette indgreb.
For det tredje kan tykkelse af spinotrapezius tillade oxygen at nå unperfused del af væv fra tilgrænsendevæv, sammenlignet med den kombinerede iskæmi og hypoksi i bagbenet model som anført ovenfor 3. For det fjerde genvinding af strømning til den del af de spinotrapezius nedstrøms for ligering er større end i bagbenet ligering. Den spinotrapezius ligation model er en enestående kronisk model og bør ikke forveksles med andre modeller af forbigående tillukning af blodkar eller modeller af iskæmisk reperfusionsbeskadigelse. Vi anser det for muligt at tilpasse denne model til at rumme disse typer af betingelser, men dette er uden for omfanget af det arbejde præsenteret heri. Endelig er vi advare mod direkte tilknytning præ-kliniske observationer i denne model til kliniske manifestationer af iskæmisk sygdom hos mennesker, især når der anvendes unge og ellers raske mus og på grund af de iboende fysiologiske grænser såsom højere puls 5. Ikke desto mindre betragter vi denne nye model som et værdifuldt redskab til at afdække grundlæggende mekanismer i vævsreaktioner til ligering og identificere potentielle denrapeutic mål i en in vivo indstilling.
Ud over de kirurgiske noter i spinotrapezius foder arterie ligatur procedure (anatomisk note (6a), adskille arterie fra venen (9a), og brug af en enkelt ligatur (11a)), et par andre aspekter af proceduren gavn af diskussion.
For det første er den indledende indsnit i den dorsale fedtpude kant (eller flere mm caudalt til skulderbladet, hvis transdermal visualisering ikke er mulig) ideelt gjort så lille som kirurgen er fortrolig med, og udvides under proceduren om nødvendigt. Denne praksis minimerer sutur kræves for at lukke snittet, som er praktisk for kirurgen, reducerer fremgangsmåden tid, og er også mindre irriterende for dyret under restitution. Alternativt kan en større hud indsnit være nødvendigt i forhold til kirurg præference, da musklen kan være lettere at finde med et udvidet felt. I dette tilfælde kan indsnittetdrage fordel af en hestesko form med en medial åbent ansigt for at tillade folde mod rygsøjlen. Samtidig med at hudincision og strækker sig gennem de sekundære hudlag, hvis et overfladefartøj er beskadiget og forårsager blødning, et let tryk med steril gaze og give tid til hæmostase.
Også at bemærke er det vigtigt at behandle vævet med det krævede minimum kraft, og så vidt muligt have med pincet tættere på musklens laterale kant og væk fra den tiltænkte iskæmiske zone. Denne praksis med til at undgå knusningsskade, hvilket kan føre til yderligere inflammatorisk-medierede vævsreaktioner, som kan forvirre vaskulær remodellering respons fremkaldt af den arterielle ligering.
Sammenfattende har vi vist, at brug af det murine spinotrapezius musklen som en kirurgisk model til at undersøge kar og væv reaktioner på arteriolær ligering. Denne model er velegnet til intravital vurdering af vaskulære ændringer (forEksempelvis funktionel vasodilation), og til ex vivo-vurdering af vaskulære ændringer (f.eks immunofluorescent afbildning og kvantificering af vaskulære netværk). Både prækliniske og kliniske undersøgelser har vist, at et individs respons på arteriolær obstruktion (fx via ligering hos mus eller atherosclerotiske plaques hos mennesker) afhænger af deres alder af tilstedeværelsen eller fraværet af sygdom (fx diabetes mellitus) diameteren af blokeret arterie , den genetiske sammensætning af individet, og metabolisk behov i vævet 11-15. Murine modeller, som den præsenteres her, benytte forskeren af stamme-specifik anatomiske og genetiske forskelle og sygdomsspecifikke fænotyper, hvilket letter undersøgelse af disse komplicerede forhold.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender Kevin Macleod til brug af hans creative commons licens musik i den tilhørende video, herunder (i rækkefølge efter udseende) hans spor "Airport Lounge", "Baggrund" og "Evening Melodrama." Vi vil også gerne anerkende Ndubisi Okeke og Frederick Torstrick for deres assistance med kirurgi video.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Iris scissors | FST | 14090-09 | Type: Tool |
Size 7 forceps | FST | 11271-30 | Type: Tool |
Size 5 forceps | FST | 11251-20 | Type: Tool |
Spring scissors | Roboz | RS5671 | Type: Tool |
Microprobe | FST | 10140-03 | Type: Tool May be substituted with straight probe |
Needle holder | FST | 12500-12 | Type: Tool |
Induction chamber | JD Medical Dist. Co., Inc. | IC-1086 | Type: Equipment |
Eye Gel | Dechra | NDC 17033-211-38 | Type: Reagent |
Heat pad | FST | 21060-01 | Type: Equipment |
Rectal temperature probe | FST | 21060-01 | Type: Equipment |
Stimulating electrodes | FHC | UEWSGCSE0N1M | Type: Equipment |
Artisan’s Polymer Clay | Polyform | N/A | Type: Equipment |
PowerLab data acquisition system | ADInstruments | ML 845 | Type: Equipment |
Stimulus isolator | ADInstruments | FE 180 | Type: Equipment |
LabChart | ADInstruments | ML S060/7 | Type: Software |
Reflected-light fluorescent microscope | Olympus | BFXM | Type: Equipment |
High MW fluorescent dextran | Sigma | FD250S-100MG | Type: Reagent |
Video calipers | Colorado Video | 308 | Type: Equipment |
Automated Vascular Analysis (AVA) | Microvision Medical | Type: Software | |
Anti-αSMA Conjugated Fluorophore | Sigma | 1A4-Cy3 | Type: Reagent Clonal, 1:100 |
Fluorescent Microscope | Olympus | BFXM | Type: Equipment |
High-molecular weight fluorescent dextran | Sigma | FD250S-100MG | Type: Reagent |