Vi visar en ny arteriell ligering modell i murin spinotrapezius muskel, inklusive en steg-för-steg och beskrivning av instrumentering som krävs. Vi beskriver operationen och relevanta mätningar utfall avseende vaskulär nätverk ombyggnad och funktionell vasodilatation med intravital och konfokalmikroskopi.
Den murina spinotrapezius är en tunn, ytlig skelett stöd muskel som sträcker sig från T3 till L4, och är lätt åtkomliga via rygghuden snitt. Dess unika anatomi gör spinotrapezius användbara för undersökning av ischemisk skada och efterföljande mikrovaskulär ombyggnad. Här visar vi en arteriolär ligering modell i murina spinotrapezius muskeln som utvecklades av vår forskargrupp och tidigare publicerade 1-3. För vissa utsatta musstammar, såsom Balb / c-mus, skapar ligering operation tillförlitligt skelettmuskulaturen ischemi och fungerar som en plattform för att undersöka terapier som stimulerar revaskularisering. Metoder för bedömning är också visat, bland annat användning av intravital och konfokalmikroskopi. Den spinotrapezius lämpar sig väl för sådana imaging studier på grund av dess tillgänglighet (ytlig dorsala anatomi) och relativa tunnhet (60-200 nm). Den spinotrapezius muskeln kan monteras en face, vilket underlättaravbildning av hela muskler mikrovaskulära nätverk utan histologisk snittning. Vi beskriver användning av intravital mikroskopi att förvärva mått efter en funktionell vasodilatation förfarande, särskilt ökningen av arterilar diameter som en följd av muskelkontraktion. Vi visar också de förfaranden för skörd och fastställande av vävnader, en nödvändig förelöpare till immunfärgning studier och användning av konfokalmikroskopi.
Djurmodeller av kronisk ischemi är värdefulla verktyg för att undersöka patofysiologin för ischemiska sjukdomar, såsom perifer kärlsjukdom, kranskärlssjukdom, och cerebrovaskulär sjukdom. Hos gnagare som hos människor leder arteriell ocklusion till strukturell omdaning av det vaskulära nätverket, inklusive arteriogenes och angiogenes. Hos friska och yngre patienter, kan denna ombyggnad vara tillräckligt för att rädda vävnad från ischemi-inducerad skada, men komorbiditet såsom diabetes kan allvarligt äventyra ombyggnad och återhämtning. Förstå mekanismerna bakom kärlremodellering händelser är viktigt för att utveckla behandlingar som stimulerar dessa endogena revaskularisering processer.
För närvarande är lårbensartären ligering eller resektion i bakbenet standard teknik för att studera kronisk ischemi-inducerad kärlremodellering i små djur 4,5. Analys av diametern, konnektivitet och reaktivitetde mikrokärl som utgör det vaskulära nätverket nedströms ligerade lårbensartären är dock svårt, beroende på tjockleken av musklerna. Vi har utvecklat en arteriolär ligering modell i mus spinotrapezius muskeln: ensidig ligering av den laterala foder artär i denna stabiliserande ryggmuskeln 1. De relativt tunna spinotrapezius (60-200 nm) är mottaglig för en face immunfärgning för bedömning av hela nätverkstopologi med encelliga upplösning, vilket gör en grundlig undersökning av kärlremodellering händelser över hela vävnaden. Den spinotrapezius är också ytlig och tillgänglig, och därmed dess fartyg är lätt iakttas av intravital mikroskopi, för effektiv karakterisering av effekterna av ombyggnad och arteriolär ligering på vaskulär reaktivitet.
I denna rapport beskriver vi i detalj och demonstrera mus spinotrapezius arteriolära ligering modell. Både in vivo och ex vivo migthods bedömning efter operation beskrivs, inklusive mätning av funktionell vasodilatation, som har visat sig vara nedsatt enligt ischemiska tillstånd 6, och immunofluorescerande avbildning av hela muskel mikrovaskulära nätverk. Vi inkluderar även resultaten av två separata pilotstudier att visa användbarheten av modellen. Först, utnyttjade vi den arteriella ligering modellen att inducera en statistiskt signifikant ökning i kärlet slingrighet i C57BL / 6 möss (Figur 2B). Slingrighet ökar under arteriogenes i arteriole säkerheter. I andra musstammar, som är mer utsatta för ischemi på grund av frånvaron av kollaterala arterioler (t.ex. Balb / c), är kapillär arterialization observeras 10. Kapillär arterialization detekteras av ökade diametrar och utveckling av α-glattmuskelaktin reaktivitet. Andra leder funktionell elektrisk stimulering av muskeln till vasodilation i terminal arterioler i spinotrapezioss (Figur 3B).
Den murina spinotrapezius ligering modell som presenteras här är ett effektivt liten djurmodell för att studera de funktionella och strukturella anpassningar som följer av en arteriell ocklusion. Denna modell är komplementär till utbredd bakben ischemi modell 4, genom att det ger en hel-muskel vy av intakta mikrovaskulära nät med hög rumslig upplösning. Dessutom, eftersom denna muskel ligger precis under den dorsala huden, är det tillgängligt för seriell avbildning med intravital mikroskopi, och till lokal läkemedelstillförsel genom superfusion eller tunn film implantation 2. Dessa funktioner gör det till en tilltalande liten djurmodell för att studera effekterna av nya terapeutiska mål för kärlremodellering och funktionell vasodilatation efter arteriell ocklusion.
Observera att försiktighet bör användas när man jämför data som förvärvats i spinotrapezius lige-modellen till data som förvärvats i bakben lige-modellen på grund av flera viktiga differences. Först är de spinotrapezius musklerna stabiliserande muskler, och de skiljer sig från benmusklerna när det gäller funktion och fibertyp distributionen. Vår grupp har tidigare visat att arteriolär ligering i spinotrapezius muskeln skapar mindre eller försumbar hypoxi i stammar med välutvecklade nätverk säkerheter arteriolära, jämfört med syrebrist observerades i baktassen efter femoralartären ligering i bakben modell 1,8 – 10. Vi har också visat att den spinotrapezius ligering modellen producerar en annan ombyggnad svar i Balb / c-möss jämfört med C57BL / 6 möss, med Balb / c-möss nätverk remodellering genom kapillärverkan collateralization och C57BL / 6 remodellering av utvidgningen av befintliga arteriolära förbindelser 3. Det finns en intressant parallell mellan dessa iakttagelser och de görs i bakbenen ligering modeller, där Balb / c-möss upplever en förlängd perfusion återhämtning efter ligering jämfört med C57BL / 6 möss 9,11,12 </ Sup>. I andra modeller av vävnadsischemi, mus ålder 13 kön 14 och närvaron av sjukdomen 15 också att påverka vävnader svar på arteriolär ocklusion, även om vi ännu inte har testat dessa prediktorer i spinotrapezius ligering modellen.
Det andra är storleken på artären som ligeras i spinotrapezius modellen väsentligt mindre än den femorala artären, och därför påverkar ligeringen en mindre vävnadsvolym som är längre nedströms, dvs en lägre nivå i cirkulationssystemet trädet, i spinotrapezius jämfört med bakbenet 3. Därför bör den anatomiska skillnaden i placeringen av ligering i dessa två modeller beaktas när man jämför respektive fysiologiska responser (t ex vaskulär remodellering) till detta ingripande.
Tredje kan tunnhet av spinotrapezius tillåta syre att nå unperfused delen av vävnaden från angränsandevävnad, jämfört med den kombinerade ischemi och hypoxi i bakben modellen enligt ovan 3. Det fjärde, är återvinningen av flödet till den del av den spinotrapezius nedströms ligeringen snabbare än i bakben ligering. Den spinotrapezius ligering modellen är en unik kronisk modell och bör inte förväxlas med andra modeller av övergående arteriell ocklusion eller modeller av ischemi reperfusionsskada. Vi anser att det är möjligt att anpassa denna modell för att tillgodose dessa typer av förhållanden, men det är utanför omfattningen av arbetet som presenteras här. Slutligen varnar vi mot direkt samband prekliniska observationer i denna modell till kliniska manifestationer av ischemisk sjukdom hos människor, speciellt när man använder unga och i övrigt friska möss och på grund av de inneboende fysiologiska begränsningar såsom högre hjärtfrekvens 5. Ändå ser vi denna nya modell som ett värdefullt verktyg för att avslöja grundläggande mekanismer vävnad svar på ligering och identifiera potentialrapeutic mål i en in vivo-miljö.
Förutom de kirurgiska noter som avses i spinotrapezius foder artär ligation förfarande (anatomisk anmärkning (6a), skilja artären från ven (9a), och användning av en enda ligatur (11a)), några andra aspekter av förfarandet nytta diskussion.
Först den inledande snitt över den dorsala fettkudden gränsen (eller flera mm kaudalt till skulderbladen, om transdermal visualisering inte är möjligt) idealt göras så liten som kirurgen är bekväm med, och expanderade under förfarandet om det behövs. Denna praxis minimerar suturering som krävs för att stänga snittet, vilket är praktiskt för kirurgen, minskar procedur tid och är också mindre irriterande för djuret under återhämtning. Alternativt, kan en större hudsnitt vara lämpligt enligt kirurg önskemål, eftersom muskeln kan vara lättare att lokalisera med en expanderad fält. I detta fall, snittet kandra nytta av en hästsko form med en medial öppet ansikte så att vikning mot ryggraden. Samtidigt göra huden snitt och som sträcker sig genom de sekundära hudskikten, om ett ytfartyg skadas och orsakar blödningar, använd lätt tryck med steril gasväv och ge tid för hemostas.
Också av notera är det viktigt att hantera vävnaden med ett minimum kraft och om möjligt hålla med pincett närmare muskeln i sidled gränsen och bort från den avsedda ischemisk zonen. Denna praxis bidrar till att undvika krosskada, vilket kan leda till ytterligare inflammatoriska-medierade vävnadssvar som kan förbrylla kärlremodellering responsen framkallad av den arteriella ligering.
Sammanfattningsvis har vi visat användning av murina spinotrapezius muskler som en kirurgisk modell för att undersöka vaskulära och vävnader svar på arteriolär ligering. Denna modell är lämplig för intravital bedömning av kärlförändringar (förExempelvis funktionella vasodilatation), och för ex vivo-bedömning av kärlförändringar (t.ex. immunofluorescerande avbildning och kvantifiering av vaskulära nätverk). Både prekliniska och kliniska studier har visat att en individs reaktion på arteriolär obstruktion (t.ex. via ligering hos möss eller aterosklerotiska plack hos människa) är beroende på deras ålder närvaro eller frånvaro av sjukdom (t.ex. diabetes mellitus) diametern på den blockeras artären , den genetiska sammansättningen hos individen, och den metaboliska efterfrågan hos vävnaden 11-15. Musmodeller, såsom en som presenteras här, utnyttja forskaren av stamspecifika anatomiska och genetiska skillnader och sjukdomsspecifika fenotyper, vilket underlättar utredning av dessa komplexa förhållanden.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner Kevin Macleod för användning av hans kreativa allmänningar licensierad musik i den tillhörande video, inklusive (i beställa av utseendemässigt) hans spår "Airport Lounge", "Bakgrund" och "Evening Melodrama." Vi vill också erkänna Ndubisi Okeke och Frederick Torstrick för deras hjälp med operationen videon.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Iris scissors | FST | 14090-09 | Type: Tool |
Size 7 forceps | FST | 11271-30 | Type: Tool |
Size 5 forceps | FST | 11251-20 | Type: Tool |
Spring scissors | Roboz | RS5671 | Type: Tool |
Microprobe | FST | 10140-03 | Type: Tool May be substituted with straight probe |
Needle holder | FST | 12500-12 | Type: Tool |
Induction chamber | JD Medical Dist. Co., Inc. | IC-1086 | Type: Equipment |
Eye Gel | Dechra | NDC 17033-211-38 | Type: Reagent |
Heat pad | FST | 21060-01 | Type: Equipment |
Rectal temperature probe | FST | 21060-01 | Type: Equipment |
Stimulating electrodes | FHC | UEWSGCSE0N1M | Type: Equipment |
Artisan’s Polymer Clay | Polyform | N/A | Type: Equipment |
PowerLab data acquisition system | ADInstruments | ML 845 | Type: Equipment |
Stimulus isolator | ADInstruments | FE 180 | Type: Equipment |
LabChart | ADInstruments | ML S060/7 | Type: Software |
Reflected-light fluorescent microscope | Olympus | BFXM | Type: Equipment |
High MW fluorescent dextran | Sigma | FD250S-100MG | Type: Reagent |
Video calipers | Colorado Video | 308 | Type: Equipment |
Automated Vascular Analysis (AVA) | Microvision Medical | Type: Software | |
Anti-αSMA Conjugated Fluorophore | Sigma | 1A4-Cy3 | Type: Reagent Clonal, 1:100 |
Fluorescent Microscope | Olympus | BFXM | Type: Equipment |
High-molecular weight fluorescent dextran | Sigma | FD250S-100MG | Type: Reagent |