Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

דגם Spinotrapezius Murine כדי להעריך את ההשפעה של קשירת arteriolar על תפקוד כלי דם וRemodeling

doi: 10.3791/50218 Published: March 3, 2013
* These authors contributed equally

Summary

אנחנו מדגימים את מודל רומן עורקי קשירה בשריר spinotrapezius עכברי, לרבות הליך צעד אחר צעד ותיאור של מכשור הנדרש. אנו מתארים את הניתוח ומדידות תוצאה רלוונטיות הנוגעות לשיפוץ כלי דם והרחבת כלי דם ברשת פונקציונלית באמצעות מיקרוסקופ intravital וconfocal.

Abstract

Spinotrapezius העכברי הוא שריר רזה, שטחי שלד תמיכה שמשתרע בין T3 לL4, והוא נגיש בקלות דרך חתך בעור גב. האנטומיה הייחודית שלו הופכת את spinotrapezius שימושי לחקירה של פגיעת איסכמית ושיפוץ כלי דם לאחר מכן. הנה, אנחנו מדגימים את מודל קשירת ארטריולות בשריר spinotrapezius העכברי שפותח על ידי צוות המחקר שלנו ושפורסם בעבר 1-3. לזנים מסוימים פגיעים עכבר, כגון עכבר BALB / ג, ניתוח קשירה זו יוצר אמין איסכמיה שרירי שלד ומשמש כפלטפורמה לבירור טיפולים שמגרים revascularization. שיטות של הערכה גם הם הפגינו, כוללים שימוש במיקרוסקופ intravital וconfocal. Spinotrapezius הוא גם מתאים למחקרי הדמיה כאלה בשל נגישותו (האנטומיה הגבה שטחית) והרזון יחסי (60-200 מיקרומטר). שרירי spinotrapezius ניתן להרכיב en פנים, בהנחייתהדמיה של רשתות כלי דם כולו שרירים ללא חתך היסטולוגית. אנו מתארים את השימוש במיקרוסקופ intravital לרכוש מדדים הבאים הליך התרחבות פונקציונלית; במיוחד, גידול בקוטר arterilar כתוצאה מהתכווצות שרירים. אנחנו גם להדגים את הנהלים לקצירה ותיקון הרקמות, מבשר צורך immunostaining מחקרים והשימוש במיקרוסקופיה confocal.

Introduction

מודלים של בעלי חיים של איסכמיה הכרונית הם כלים רבים ערך לחקירת פתופיזיולוגיה של מחל איסכמי, כמו מחלת עורקים היקפיות, מחלת לב כלילית, מחלת כלי דם במוח ו. במכרסמים, כמו אצל בני אדם, חסימת עורקים מובילים לשיפוץ מבני של רשת כלי הדם, כוללת arteriogenesis ואנגיוגנזה. בחולים בריאים וצעירים יותר, שיפוץ זה יכול להיות מספיק כדי להציל את הרקמה מפגיעה מושרה איסכמיה, אבל תחלואות נלוות כגון סוכרת יכולות לפגוע קשות שיפוץ ושחזור. הבנת המנגנונים בבסיס אירועי שיפוץ כלי דם היא חיונית לפיתוח טיפולים שמגרים תהליכי revascularization אנדוגניים אלה.

נכון לעכשיו, קשירת עורק ירך או כריתה בhindlimb היא הטכניקה הסטנדרטית ללימוד השיפוץ וסקולרית הנגרם איסכמיה כרוני בבעלי חיים 4.5 קטנים. ניתוח של הקוטר, קישוריות, ותגובתיות שלאת microvessels שמרכיב את זרם רשת כלי הדם של עורק הירך את הגבעול הוא קשה, עם זאת, בשל העובי של השרירים. פתחנו מודל ארטריולות קשירה בשריר spinotrapezius עכבר: קשירה חד צדדית של עורק ההזנה הרוחבית בשרירים מייצבים זה הגבה 1. את spinotrapezius הדק יחסית (60-200 מיקרומטר) הוא נוח לimmunostaining פן en להערכת טופולוגיית רשת שלמה עם החלטה מתא בודד, המאפשר בחינה מדוקדקת של אירועים וסקולריים שיפוצים בכל רחבי הרקמה. Spinotrapezius גם שטחי ונגיש, ובכך כליו בקלות ניתנים לצפייה על ידי מיקרוסקופ intravital, לאפיון יעיל של ההשפעה של שיפוץ וקשירת ארטריולות על תגובתיות כלי דם.

בדו"ח זה, אנו מתארים בפירוט ונדגים את מודל קשירת ארטריולות spinotrapezius עכבר. שניהם in vivo ו vivo לשעברthods של הניתוח הבא הערכה מתוארת, לרבות מדידה של התרחבות פונקציונלית, אשר הוכחו להיפגע בתנאי איסכמי 6, והדמיה של רשתות כלי דם immunofluorescent שלמי שרירים. אנו גם תוצאות של שני מחקרי טייס נפרדים כדי להדגים את התועלת של המודל. ראשית, אנו מנוצלים מודל קשירת העורקים לגרום לעלייה משמעותית מבחינה סטטיסטית בtortuosity הכלי בC57BL / 6 עכברים (איור 2 ב '). עליות Tortuosity במהלך arteriogenesis בטחונות עורקיק. בזני עכברים אחרים, שהם פגיעים יותר לאיסכמיה עקב היעדר arterioles טחונות (למשל BALB / ג), arterialization נימים נצפתה 10. arterialization נימים הוא זוהה על ידי קטרים ​​מוגברים והפיתוח של תגובתיות יקטין שריר α החלקה. שנית, גירוי חשמלי פונקציונלי של השריר גורם להרחבת כלי דם בarterioles הטרמינל של spinotrapezi(איור 3 ב ').

Protocol

1. ניתוח קשירת עורק הזנת Spinotrapezius

  1. הרדם עכבר באמצעות זריקת intraperitoneal. במזרק מ"ל 0.5, לגבש: 0.06 מ"ל של 100 מ"ג / המ"ל קטמין
    0.03 מ"ל של 20.0 מ"ג / המ"ל Xylazine
    0.01 מ"ל של 0.4 מ"ג / המ"ל אטרופין
    0.30 מ"ל של תמיסת מלח 0.9%.
    מינון: 0.01 * מ"ל למשקל גוף גרם, IP

* מינון משתנה על עכבר זן ומניות, בהתאם כך להתאים התאוששות עכבר נמצאת בתוך שעה מאינדוקציה.

  1. החל משחת עיניים סטנדרטית כדי למנוע התייבשות של קרנית.
  2. הסרת שיער מהחלק האחורי באמצעות קוצץ חיתוך, ואחרי יישום קצר של קרם הסרת שיער.
  3. לחטא את שדה הניתוח בכלורהקסידין או povidone-יוד. החלופי povidone-יוד עם אתנול שלוש פעמים, שהסתיימה עם povidone-יוד.
  4. העבר את העכבר על משטח העבודה כירורגית הכין בעבר, עם כרית חימום וסדין סטריליבמקום.
  5. יצירת חתך יניארי (3-5 מ"מ) דרך העור הגבה כ 5 מ"מ זנב לבליטה הגרמית של השכמה באמצעות מספרי איריס ומלקחי דפוס סטנדרטיים (FST, 11271-30) האהלה ידי הרקמה וגזירה במקביל ל עמוד שדרה. אתר חתך היעד עשוי להיות מזוהה על ידי הדמיה דרך עור של כרית השומן הגבה אם היתרי פיגמנטציה של עור; לחתוך בגבול הזנב של כרית השומן. הרחב את החתך לפי הצורך, ולהאריך דרך שכבות עור משניות באמצעות מספרי האביב.
    1. לב האנטומי - שריר spinotrapezius טמון dorsally ומשתרע בין T4 ל L3 משני צדי עמוד השדרה. הגבול הקדמי משתרע רוחבי של כ השכמה. השריר מתכנס בכיוון הזנב כך שהגבול האחורי ביותר טמון המדיאלי לגבול הקדמי, ועשוי היה צמוד עם עמוד השדרה. שתי רפידות שומן הן חשובות גם לציין, נחת ישירות הגבה וגחון לspinotrapeziusשרירים לקראת מחצית הגולגולת.
    2. דלקת עקב החתך הוכחה כי אין כל השפעה על תגובת שיפוץ כלי הדם, כמו ניתוח קשירת דמה לא הראה כל שינוי בעיצובו מחדש של מערכת כלי דם spinotrapezius. שני גורמים מרחביים לתרום לתוצאה זו. קודם החתך יוסר על ידי 5 מ"מ בכיוון הגולגולת מהאזור של עניין שבו תגובת כלי הדם בשריר נבחנה בדרך כלל. בנוסף, אתר החתך על עור הגב מופרד מאתר קשירת הכלי על ידי כרית שומן הבטנית ששקרים על גבי 3 הגולגולת של שריר spinotrapezius.
  6. להשקות את החתך בתמיסת רינגר המחומם כדי למנוע התייבשות שריר. יישום של חומרי מרחיבי כלי דם כגון papaverine יסייע בהדמית עורק היעד לקשירה.
  7. תחת מיקרוסקופ לנתח, להשתמש במלקחיים כדי להקהות לנתח ולהפריד (אך לא להסיר) את כרית הגב לבן השומן מmusc הבסיסירקמת תואר בלבד כדי להמחיש את מערכת כלי הדם כפי שהוא נכנס ויוצא מspinotrapezius על הקצה לרוחבו.
  8. אתר את עורק היעד, אשר יחד עם אחד או שניים ורידים לזווג, עובר דרך כרית השומן שהוא גחון לspinotrapezius בדרכה לקצה ברוחב של השריר. עורק זה נזון חלק ניכר ממחצית הזנב של השריר, שניתן לאשר על ידי שיקוף והחלפת השריר להתבונן בדרכו של העורק בתוך השריר. מיקום היעד לקשירה הוא הקטע של עורק יציאת כרית שומן הגחון והזנת השרירים, והוא די נגיש באזור זה. זוג עורק הווריד ייתכן שיהיה הצורך להפריד בעדינות מרפידת השומן הבטנית באזור זה. שים לב שspinotrapezius מוזן על ידי זוגות רבים עורקי ורידים, כולל כלים שרוחביות או כריות הגב וגחון השומן. הקפד שלא לפגוע בכלים האלה.
    1. אינדיקטורים מרובים עלולים לשמש כדי להבדיל עורקמוריד. אחת השיטות הטובות ביותר הוא בעדינות כדי לחסום את זרימת דם בmicroprobe ולנוע במעלה זרם משרירים; זרימה לא תתחדש בעורק עד שהחסימה שוחררה. צבע יכול לשמש גם כדפנות וריד מכילות נדן הלבנבן של רקמת חיבור שעורקים חסרים. יתר על כן, ניתן לחשוב קוטר לפני יישום vasodilator כורידים הם בדרך כלל גדולים יותר בגודל.
  9. העורק הוא בדרך כלל בסמיכות לווריד לזווגה; להשתמש נתיחה בוטה עם microprobe ו# 5 מלקחיים לבודד כ 5 קטע מ"מ, על ידי עובר microprobe מאחורי העורק, ובאמצעות הקצה כדי להפוך פער רחב יותר בטבעי שסע בין העורקים והוורידים. זה הפער שדרכו יהיה מושחל התפר.
  10. שימוש 10-0 תפר חוט בודד ומקום בעל מחט קשירה סביב עורק ההזנה (~ 70 מיקרומטר קוטר) לקראת הסוף הפרוקסימלי של המגזר נתח באמצעות הקשר של מנתח. Place קשירה נוספת לקראת הסוף הדיסטלי של עורק הקטע הגזור, עם הפרדה מספקת בין ליגטורות כדי לאפשר לחיתוך רוחב של העורק.
    1. בקנה המידה הקטן הקשורים לעורק הזנת spinotrapezius מוביל לקושי ניתוחי מוגבר, בהשוואה לקשירת כלי גדול יותר, כגון עורק הירך. מנתחים מנוסים במיוחד יהיו שיעור גבוה של avulsion, דימום שלא במתכוון, וסיבוכים כירורגיים אחרים. מדאיג במיוחד הוא הקושי בזיהוי וחיתוך העורק חסר צבע לאחר הזרימה כבר הקשתה ממש לפני החיתוך. מסיבות אלה, צבת 2 ליגטורות מומלצת למי שאינם רגיל להליך, כמנתח יש מדריך חזותי באיתור שבו ויחצה את העורק כמו גם אישור של החתך עם ההפרדה נצפית בקלות את 2 הקשירות. עם זאת, מנתח מנוסה יותר עשוי לגלות קשירה אחת מספיקה, כל עוד הם יכולים באופן ברורלזהות ולחתוך את המורד העורק של המייתר. בעוד טכניקה זו מפחיתה את הסיכון לגניבת ציוד ספינה סמוכה עם תפר הקשירה החד שלא במתכוון, הוא אינו נטול חסרונות, לרבות קשיים מוגברים במאשרים עורק צניעות הצטלבה.
  11. ודא קשירה ידי התבוננות הפחתה של זרימת דם (עמודת RBC חסום) במורד זרם של אתר הקשירה (כלומר לכיוון השרירים).
  12. מספריים מבתרים באמצעות יחצו את עורק הגבעול, בין שתי קשירות. אם רק קשירה אחת הונחה (11a), לחתוך בזהירות רבה בכיוון הזרם.
  13. תרופות טעונות סרט הרגיל (1 מ"מ) עשויות להיות ממוקמות במורד זרם (caudally) כחלק מהליך ניסוי.
  14. מיקום מחדש fascia העקורים ורקמת שומן לכיוון המקורי שלהם.
  15. סגור את החתך בעור באמצעות 8-0 תפרים שאינם resorbable. לאחר מכן הנח את העכבר בכלוב התאוששות מחומם שהוכן תחת השגחה ולנהל appropriate משככי כאבים כגון bupivacaine, 0.25% חדירת 0.02-0.05 מ"ל מקומית.

2. מיקרוסקופיה Intravital Spinotrapezius, באתר

  1. הרדם את העכבר בתא אינדוקציה עם 3-4% isoflurane מתאיידים בחמצן 100% בקצב זרימה של L 3-4 דקות · -1.
    1. השימוש בהרדמה נשימתית עדיף למדידות פונקציונליות, כי יש פחות דיכאון לב וכלי דם מאשר עם הרדמה בזריקות. אם הרדמה נשימתית בהרדמה אינה זמינה, ארוכת טווח בזריקות, כגון נתרן פנטוברביטל הם העדיפו להימנע מהזרקות חוזרות אחת החיה כבר מוצבת.
  2. ברגע שהרדים, לספק הרף isoflurane דרך מסכת הרדמה (חרטום aka) בריכוזי תחזוקה (בדרך ~ 2%) וקצב זרימה של 0.5-1 ליטר · דקות -1.
    1. עכברים ברובה לאוורר דרך מעברי האף שלהם, כך שזה רק לנמ"אessary כדי לכסות את האף שלהם עם סרעפת מסכת ההרדמה.
  3. אם יש צורך, להסיר שיער מהחלק האחורי באמצעות קוצץ זמירה וקרם הסרת שיער.
  4. להעביר את בעל חיים למשטח החום.
    1. זה חשוב כדי לשמור על עכברים במדינת euthermic כדי למנוע התכווצות כלי דם בהשראת קור, זה יכול להיות מושג באמצעות מנורות, מים זורמים רפידות חום, microwavable מתחממים רפידות וכו '
  5. הכנס את בדיקת הטמפרטורה רקטלית ולהגדיר תרם בקר עד 35 ° C.
  6. הפוך חתך בעור בקצה הזנב של spinotrapezius באמצעות מספרי איריס ומלקחי דפוס סטנדרטיים.
  7. הרחב את חתך cranially לכרית שומן, יצירת חתך נעל סוס, ולכסות את דש העור בניילון כדי למנוע התייבשות.
  8. להקהות לנתח את רקמת חיבור תת עורית עם מלקחיים ומספריים, כדי למקסם את נראות האביב.
  9. הנח אלקטרודות גירוי כtoge קרוביש להמשיך ככל האפשר, כדי למזער את הגודל של השדה הנוכחי, ולמקם אותם בסוף הזנב של השריר רק לרוחב לשדרה החשופה.
  10. בצע בדיקת גירוי כדי לאשר מיקום האלקטרודה באמצעות מערכת האלקטרודה נתוני רכישה, מבודד גירוי אלקטרודה, ובקר מחשב, עם גלים רבועים של משך 200 μsec, 2 mA אמפליטודה, נשא ברץ 1.
  11. הנח ניילון מעל השריר החשוף כדי למנוע התייבשות.
  12. עיתוי בגין תקופת 30 דקות שבמהלכו יהיו לאזן כלי קטרים.
  13. מקם את המיקרוסקופ intravital מעל שריר spinotrapezius כדי להציג את הארכיטקטורה וסקולרית.
    1. אם אתם משתמשים בעדשת טבילה, במקום ירידה של PBS בין המטרה והניילון הנצמד.
  14. החל מעל עורקיק הראשי (הכלי הגדול ביותר לעין), לתפעל את הבמה במישור XY כדי לאתר את כלי ריבית.
    1. Visualizing arteriol הקטןes עם מיקרוסקופיה משתקף אור דורש ניגוד גדול יותר המסופק על ידי העמודה אדומה התא. אנו משתמשים בעיקר במיקרוסקופ הדמיה כהה תחום צד זרם כדי לשפר ניגוד כלי דם, אך לעומת זאת גם ניתן לשפר בעזרת מיקרוסקופ משתקף אור ניאון לאחר ההזרקה תוך ורידית של משקל ניאון dextran הגבוה מולקולרי.
  15. לאחר ההתאזנות 30-דקות, ללכוד תמונה / וידאו של כלי השיט של עניין.
  16. לגרות את השריר עם גלים מרובעים של 200 μsec משך, 2 mA אמפליטודה, נשא בהרץ 8, עבור 90 שניות, כפי שתואר לעיל.
  17. צלם עוד תמונה / סרטון גירוי מייד הודעה ולהמשיך ללכוד כל רגע עד שהכלי חזר לקוטר מנוחה, ~ 10 דקות.
  18. חזור על צעדים 6-18 באמצעות שרירים הנגדיים.
  19. ניתוח נתונים יכול להתבצע בזמן אמת עם מחוגה וידאו או לא מחובר עם תוכנת ניתוח תמונה.
  20. להרדים את העכבר לעקובing IACUC פרוטוקול.

3. קציר רקמות Spinotrapezius וקיבוע

  1. הרדם עכברים על ידי הזרקת intraperitoneal; ניסוח כמו בשלב Spinotrapezius הזנת עורקי קשירת 1.
  2. תנו כמה מילימטרי חתך גולגולת לבליטה הגרמית של השכמה של העכבר באמצעות מספרי איריס ומלקחי דפוס סטנדרטיים. הרחב את החתך רוחבי ואז caudally בשני הצדדים.
  3. שחרר את העור מגוף הגבה על ידי המשקף בעדינות את העור וחותך את fascia השטחי.
  4. השתמש נתיחה בוטה להסרת רקמת שומן הגבה באמצעות מלקחיים רגילים, ולאחר מכן משקף את השריר ורקמת שומן בדומה לנתח גחון.
  5. הסר fascia שמעל השרירים באמצעות מלקחיים ומספריים אביב. צעד זה יכול להיות קשה וצורכת זמן, אבל חשוב לשפר מכתים והדמית immunofluorescent. השמירה על רקמת hydrated יכולה להקל על הסרה של רקמת החיבור.
  6. לאתרהגבול לרוחב של השריר, ולהשתמש נתיחה בוטה להפריד שרירי spinotrapezius מכרית השומן שנמצאת גחון אליו.
  7. המשך נתיחה הבוטה בגולגולת לכיוון זנב. שימו לב כי כמה כלי דם להיכנס ולצאת משטח הגחון של השריר, ואם נדרש זלוף, זה צריך להתבצע לפני transecting הכלים האלה. שימו לב גם כי במחצית הזנב של השריר, מוסיף לרוחב גבולה לתוך השריר שוכב גחון אליו. קצת גזירה ייתכן שתידרש לאורך גבול זה כדי להגדיר לחלוטין ולשחרר את הקצה.
  8. בלו שריר spinotrapezius. כדי לעשות זאת:
    1. חינם לקצה הלטרלי של השריר כמתואר לעיל.
    2. לחתוך רוחבי על פני היקף הגולגולת ביותר של השריר.
    3. חותך לאורך הגבול המדיאלי (לאורך עמוד השדרה), במטוס sagittal.
  9. חזור על שלבי 4-9 הליך על השריר הנגדי, ולאחר מכן להרדים מ 'ouse ידי שיטה אושרה IACUC.
  10. לתקן את הרקמות על שקופיות זכוכית מצופית ג'לטין על ידי טבילה במתנול המצונן (4 מעלות צלזיוס) או בתמיסת מי deionized בRT paraformaldehyde 4% / עבור 20 דקות.
    1. לחלופין, קיבעון זלוף יכול להיות מועסק. לפני השלב 2, לבצע פתיחת בית חזה, עושה חתך בעלייה הימנית, ומערכת כלי דם ינקב עם 5 מ"ל של 1 × טריס נאגר מלוח עם 0.1 מ"מ CaCl 2 ו 2% הפרין דרך החדר השמאלי, ואחרי 5 מ"ל של 4 paraformaldehyde% לקיבוע כלי, ולבסוף 5 מ"ל של 1 × טריס נאגר מלוח עם 0.1 מ"מ CaCl 2 7.
  11. מייד הקיבעון הבא, לשטוף דגימה ארבע פעמים במשך 20 דקות באמצעות 0.01 M פוספט שנאגר מלוח (PBS) עם סאפונין 0.1%. כל

Representative Results

נוף כירורגית של העורק הראשי מאכיל את שריר spinotrapezius שעובר קשירה מוצג באיור 1, עם תוויות המצביעות על תחומי העניין. תמונת confocal דוגמה לאזור שנקטף וimmunostained של שריר הממוקם ישירות במורד זרם מעורקי גבעול שבוע לאחר הקשירה מוצגת באיור 2 א. arterioles ביטחונות מוגדלים המכיל שריר אלפא יקטין חלק להביע תאי שריר חלק (אדום) להציג tortuosity האופייני לאחר קשירה. tortuosity כלי, דיווח כיחס בין אורך נתיב כלי ומרחק כבל (כלומר, הקו המשתרע על אותן נקודתי קצה נתיב כולים), בשריר הגבעול (מימין) הוא משופר ביחס לשריר נגדי unligated (התרשים 2B, n = 8) . איור 3 מציג את התוצאות של מחקר פיילוט שבי התרחבות פונקציונלית מסוף עורקיק נמדדה באמצעות מיקרוסקופ intravital. כצפוי, ארטריולות די ameter מגביר באופן משמעותי בעקבות התכווצות שרירי גירוי-Induced חשמל.

איור 1
איור 1. שדה ניתוח של שריר spinotrapezius משתקף ועורק הזנה. עורק הזנת גבעול בשני המקומות שצוינו על ידי A0. בין הקשירות האלה ואחרי החסימה של זרימת דם, עורק הצניעות הצטלב באתר שצוין על ידי א הפלח הממוקד של המעברים העורקים מכרית השומן הבטנית, שמתוארת על ידי C, לתוך שריר spinotrapezius, שתואר על ידי ד ', באתר מצוין עם כיוון זרימת B. חץ מצוין באמצעות חץ המקווקו E.

ghres.jpg "/>
איור 2. תמונת confocal של רשת כלי דם שרירי spinotrapezius למחקר פיילוט של tortuosity. () נקטפה ושריר כולו היה רכוב immunostained לשריר החלק אלפא יקטין והדמיה באמצעות מיקרוסקופיה confocal. שדה הראיה מציג את האזור של שריר הממוקם ישירות במורד זרם של קשירת גבעול עורקיק 1 שבוע הודעה. כולים מפותלים ניכרים בשריר כתוצאה מהקשירה (ב ') תוצאות מחקר פיילוט להראות גדלו באופן משמעותי (p = 0.035; מבחן t של סטודנט זנב 1). tortuosity הפגין microvessels בשריר הגבעול כפי שנמדד על ידי אורך נתיב כלי ל יחס מרחק כבל לניסוי של עכברי C57BL / 6 (n = 8) בהשוואה לשליטה נגדית.

איור 3
Figuמחדש 3. הדמיה מיקרוסקופית Intravital של התרחבות תפקודית בarterioles spinotrapezius, in vivo. () photomicrographs היציג של arterioles המסוף spinotrapezius במנוחה (משמאל) ולאחר הפסקת התכווצות שרירי הרץ 8 (מימין) באופן מיידי. (ב) קוטר המסוף עורקיק במנוחה ( 8.5 ± 0.5 מיקרומטר, משמאל) ומייד בא (11 ± 1 מיקרומטר, באמצע) 90 שניות של התכווצות שרירים, אשר הגדילו באופן משמעותי קוטר ארטריולות (p = 0.032; 1-זנב לזווג מבחן t) בעכברי BALB / C (n = 6). שינוי באחוזים מצוין (מימין).

Discussion

המודל העכברי קשירת spinotrapezius מוצג כאן הוא מודל של בעלי חיים קטן יעיל כדי ללמוד את העיבודים הפונקציונליים ומבניים הנובעים מחסימת עורקים. מודל זה הוא משלים למודל איסכמיה בשימוש הנרחב hindlimb 4, בכך שהוא מספק תצוגה כולו שרירים של רשתות כלי דם שלמות עם רזולוציה מרחבית גבוהה. יתר על כן, בגלל שריר זה נמצא מתחת לעור הגב, הוא נגיש להדמיה סידורית עם מיקרוסקופיה intravital, ועד להפצת סמים מקומיות באמצעות superfusion או השתלת סרט דקה 2. תכונות אלו הופכות את מודל חיה קטן מושך שבכדי לחקור את ההשפעות של מטרות טיפוליות חדשניות בשיפוץ והרחבת כלי דם כלי דם תפקודית בעקבות חסימת עורקים.

שימו לב שיש להשתמש בזהירות כאשר משווים נתונים רכשו במודל הקשירה spinotrapezius לנתונים שנרכשו במודל קשירת hindlimb בשל מספר המפתח דifferences. ראשית, את שרירי spinotrapezius הם ייצוב שרירים, והם שונים מאת שרירי הרגליים במונחים של פונקציה והפצת סוג סיב. הקבוצה שלנו הוכיחה בעבר כי קשירת ארטריולות בשריר spinotrapezius יוצרת היפוקסיה פחות או זניחה בזנים עם רשתות מפותחות טחונות arteriolar, בהשוואה ליפוקסיה נצפתה בhindpaw בעקבות קשירת עורק הירך במודל hindlimb 1,8 - 10. יש לנו גם הראו כי מודל הקשירה spinotrapezius מייצר תגובה שונה שיפוץ בעכברי BALB / ג לעומת C57bl / 6 עכברים, עם שיפוץ רשתות עכברי BALB / ג ידי collateralization נימים ושיפוץ C57bl / 6 על ידי גדלה של קשרים קיימים arteriolar 3. יש מקבילה מעניינת בין תצפיות אלה ואלה נעשו במודלי הקשירה hindlimb, שבו עכברי BALB / ג חווים התאוששות זלוף ממושכת לאחר קשירה לעומת C57bl / 6 עכברים 9,11,12 </ Sup>. בדגמים אחרים של איסכמיה רקמות, גיל 13 עכבר מגדר 14 ונוכחות של מחלה 15 גם להשפיע תגובות ההרקמות אל ארטריולות חסימה, למרות שאנחנו עדיין לא נבחנו עדיין מנבאים אלה במודל הקשירה spinotrapezius.

שנית, בגודל של העורק שאת הגבעול במודל spinotrapezius הוא קטן באופן משמעותי מעורק הירך, ולכן, הקשירה משפיעה נפח רקמה קטנה יותר כי הוא עוד יותר במורד זרם, כלומר ברמה נמוכה של עץ הדם, בspinotrapezius לעומת 3 hindlimb. לפיכך, הבדל אנטומי במיקום של הקשירה בשני דגמים אלה צריכים להילקח בחשבון כאשר משווים את התגובות הפיזיולוגיות המתאימות (למשל שיפוץ כלי דם) להתערבות זו.

שלישית, הרזון של spinotrapezius רשאי להתיר חמצן להגיע unperfused החלק מהרקמה מהשכנותרקמה, בהשוואה לאיסכמיה והיפוקסיה המשולבות במודל hindlimb כאמור לעיל 3. רביעית, ההתאוששות של זרימה לחלק מזרם spinotrapezius של הקשירה היא מהירה יותר מאשר בקשירת hindlimb. מודל הקשירה spinotrapezius הוא מודל ייחודי כרוני ולא צריך להיות מבולבל עם דגמים אחרים של חסימת עורקים זמניים או מודלים של פגיעת reperfusion איסכמיה. אנו רואים את זה אפשרי להתאים את הדגם הזה כדי להכיל סוגים אלה של תנאים, אבל זה מחוץ להיקף העבודה שהוצגה במסמך זה. לבסוף, אנו מזהירים מפני התייחסות ישירה תצפיות קדם קליניות במודל זה לביטויים קליניים של מחלה איסכמית בבני אדם, במיוחד כאשר ניצול צעיר ואחרת עכברים בריאים והן בשל המגבלות הפיזיולוגיות הטבועות, כגון קצב לב גבוה יותר 5. עם זאת, אנו רואים במודל חדש זה ככלי רב ערך לגילוי מנגנונים בסיסיים של תגובות רקמות לקשירה וזיהוי פוטנציאליעדי rapeutic בהגדרת vivo ב.

בנוסף להערות הניתוחיות הניתנות בהליך spinotrapezius הזנת עורק הקשירה (הערת אנטומי (6 א), הבחנת העורק מוריד (9 א), ושימוש בחוט תלייה בודד (11a)), כמה היבטים אחרים של ההליך מהתועלת דיון.

ראשית, החתך הראשוני נעשה מעבר לגבול כרית השומן הגבה (או זנב למ"מ השכמה כמה, אם להדמיה דרך עור היא לא אפשרית) הוא עשה באופן אידיאלי קטן כמו המנתח הוא נוח איתו, והרחיב במהלך ההליך במידת צורך. פרקטיקה זו מצמצמת את התפרים נדרשו כדי לסגור את החתך, שהוא נוח למנתח, מפחיתה את זמן פרוצדורה, וגם פחות מעצבן לבעל החיים במהלך התאוששות. לחלופין, חתך בעור גדול יותר עשוי להיות מתאים בהתאם להעדפת מנתח, שכן השרירים יכולים להיות קלים יותר לאיתור בשדה מורחב. במקרה זה, החתך רשאיליהנות מצורת פרסה עם פנים פתוחים המדיאלי כדי לאפשר קיפול לכיוון עמוד השדרה. בזמן ביצוע החתך בעור ובהרחבה דרך שכבות עור משתיים, אם כלי משטח פגום וגורם לדימומים, להפעיל לחץ קל עם גזה סטרילית ולספק זמן לhemostasis.

כן, יש לציין, חשוב להתמודד עם רקמת הכח המינימאלי הנדרש, ובכל מקום אפשרי להחזיק עם מלקחיים קרובים יותר לגבול הרוחב של השריר והרחק מאזור איסכמי המיועד. נוהג זה עוזר כדי למנוע פציעה למעוך, אשר יכול להוביל לתגובות רקמות דלקתיות בתיווך נוספות שעשויות לבלבל את תגובת כלי דם השיפוץ מעורר על ידי קשירת העורקים.

לסיכום, יש לנו הפגנו שימוש בשרירי spinotrapezius העכבריים כמודל לבחינה כירורגית כלי דם ורקמות תגובות לקשירת ארטריולות. מודל זה מתאים להערכת intravital של שינויים בכלי דם (ללמשל הרחבת כלי דם, תפקודית), ולהערכת vivo לשעבר של שינויים בכלי דם (למשל, הדמיה ולכמת immunofluorescent של רשתות כלי דם). שני מחקרים קדם קליניים וקליניים הראו כי התגובה של פרט לחסימת ארטריולות (למשל באמצעות קשירה בעכברים או פלאק טרשת עורק בבני אדם) תלויה בגיל שלהם נוכחות או עדר של מחלה (למשל סוכרת) בקוטר של העורק החסום , את ההרכב הגנטי של הפרט, והדרישה המטבולית של הרקמה 11-15. מודלים עכבריים, כגון זו שהציגה כאן, לשווא את החוקר של הבדלים אנטומיים זן ספציפי וגנטיים ופנוטיפים מחלה ספציפיים, המאפשרים חקירת היחסים מורכבים אלה.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

אנו מכירים קווין מקלאוד לשימוש במוזיקה המורשית המלאי שלו בוידאו הקשור, לרבות (לפי סדר הופעתם) "טרקלין שדה התעופה," רצועות "טפט," ואת "מלודרמת הערב." אנחנו רוצים גם להודות Ndubisi Okeke ופרדריק Torstrick על סיועם בוידאו הניתוח.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Iris scissors FST 14090-09 Type: Tool
Size 7 forceps FST 11271-30 Type: Tool
Size 5 forceps FST 11251-20 Type: Tool
Spring scissors Roboz RS5671 Type: Tool
Microprobe FST 10140-03 Type: Tool
May be substituted with straight probe
Needle holder FST 12500-12 Type: Tool
Induction chamber JD Medical Dist. Co., Inc. IC-1086 Type: Equipment
Eye Gel Dechra NDC 17033-211-38 Type: Reagent
Heat pad FST 21060-01 Type: Equipment
Rectal temperature probe FST 21060-01 Type: Equipment
Stimulating electrodes FHC UEWSGCSE0N1M Type: Equipment
Artisan's Polymer Clay Polyform N/A Type: Equipment
PowerLab data acquisition system ADInstruments ML 845 Type: Equipment
Stimulus isolator ADInstruments FE 180 Type: Equipment
LabChart ADInstruments ML S060/7 Type: Software
Reflected-light fluorescent microscope Olympus BFXM Type: Equipment
High MW fluorescent dextran Sigma FD250S-100MG Type: Reagent
Video calipers Colorado Video 308 Type: Equipment
Automated Vascular Analysis (AVA) Microvision Medical Type: Software
Anti-αSMA Conjugated Fluorophore Sigma 1A4-Cy3 Type: Reagent
Clonal, 1:100
Fluorescent Microscope Olympus BFXM Type: Equipment
High-molecular weight fluorescent dextran Sigma FD250S-100MG Type: Reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bailey, A. M., O'Neill, T. J., Morris, C. E., Peirce, S. M. Arteriolar Remodeling Following Ischemic Injury Extends from Capillary to Large Arteriole in the Microcirculation. Microcirculation. 15, 389-404 (2010).
  2. Bruce, A. C., Peirce, S. M. Exogenous Thrombin Delivery Promotes Collateral Capillary Arterialization and Tissue Reperfusion in the Murine Spinotrapezius Muscle Ischemia Model. Microcirculation. 19, 143-154 (2012).
  3. Mac Gabhann, F., Peirce, S. M. Collateral capillary arterialization following arteriolar ligation in murine skeletal muscle. Microcirculation. 17, 333-347 (2010).
  4. Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine Model of Hindlimb Ischemia. J. Vis. Exp. (23), e1035 (2009).
  5. Madeddu, P., et al. Murine models of myocardial and limb ischemia: diagnostic end-points and relevance to clinical problems. Vascul. Pharmacol. 45, 281-301 (2006).
  6. Cardinal, T. R., Kurjiaka, D. T., Hoying, J. B. Chronic hindlimb ischemia impairs functional vasodilation and vascular reactivity in mouse feed arteries. Front. Physio. 2, 91 (2011).
  7. Sefcik, L. S., et al. Selective Activation of Sphingosine 1-Phosphate Receptors 1 and 3 Promotes Local Microvascular Network Growth. Tissue Eng. Part A. 17, 617-629 (2011).
  8. Deindl, E., et al. Role of Ischemia and of Hypoxia-Inducible Genes in Arteriogenesis After Femoral Artery Occlusion in the Rabbit. Circulation Research. 89, 779-786 (2001).
  9. Chalothorn, D., Zhang, H., Smith, J. E., Edwards, J. C., Faber, J. E. Chloride Intracellular Channel-4 Is a Determinant of Native Collateral Formation in Skeletal Muscle and Brain. Circulation Research. 105, 89-98 (2009).
  10. Scholz, D., et al. Contribution of Arteriogenesis and Angiogenesis to Postocclusive Hindlimb Perfusion in Mice. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 775-787 (2002).
  11. McClung, J. M., et al. Skeletal muscle-specific genetic determinants contribute to the differential strain-dependent effects of hindlimb ischemia in mice. Am. J. Pathol. 180, 2156-2169 (2012).
  12. Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117, 1207-1215 (2008).
  13. Faber, J. E., et al. Aging causes collateral rarefaction and increased severity of ischemic injury in multiple tissues. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31, 1748-1756 (2011).
  14. Peng, X., et al. Gender differences affect blood flow recovery in a mouse model of hindlimb ischemia. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 300, 2027-2034 (2011).
  15. Li, Y., Guan, H., Hazarika, S., Liu, C., Annex, B. H. Impaired angiogenesis following hind-limb ischemia in diabetes mellitus mice. Chin. Med. Sci. J. 22, 232-237 (2007).
דגם Spinotrapezius Murine כדי להעריך את ההשפעה של קשירת arteriolar על תפקוד כלי דם וRemodeling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guendel, A. M., Martin, K. S., Cutts, J., Foley, P. L., Bailey, A. M., Mac Gabhann, F., Cardinal, T. R., Peirce, S. M. Murine Spinotrapezius Model to Assess the Impact of Arteriolar Ligation on Microvascular Function and Remodeling. J. Vis. Exp. (73), e50218, doi:10.3791/50218 (2013).More

Guendel, A. M., Martin, K. S., Cutts, J., Foley, P. L., Bailey, A. M., Mac Gabhann, F., Cardinal, T. R., Peirce, S. M. Murine Spinotrapezius Model to Assess the Impact of Arteriolar Ligation on Microvascular Function and Remodeling. J. Vis. Exp. (73), e50218, doi:10.3791/50218 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter