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Medicine

Microvascular 기능 및 리모델링에 Arteriolar 결합의 영향을 평가하기 위해 손쥐 Spinotrapezius 모델

doi: 10.3791/50218 Published: March 3, 2013
* These authors contributed equally

Summary

우리는 단계별 절차와 필요한 장비에 대한 설명을 포함 손쥐 spinotrapezius 근육의 소설 동맥 결합 모델을 보여줍니다. 우리는 수술과 intravital 및 공 촛점 현미경을 사용하여 혈관 네트워크 리모델링 및 기능 vasodilation에 관한 관련 결과 측정을 설명합니다.

Abstract

손쥐 spinotrapezius는 T3에서 L4로 확장하는 얇은 표면 골격 지원 근육이며, 등쪽 피부 절개를 통해 쉽게 접근 할 수 있습니다. 독특한 신체 구조는 허혈성 부상 이후 microvascular 리모델링의 조사를 위해 spinotrapezius이 유용합니다. 여기, 우리는 우리의 연구 팀에 의해 개발 이전에 1-3로 출판 되었음 : 손쥐 spinotrapezius 근육에 arteriolar 결합 모델을 보여줍니다. 예를 Balb / C 마우스와 같은 특정 취약 마우스 변종은이 결합 수술 안정적으로 골격 근육 국소 빈혈을 생성하고 revascularization을 자극 요법을 조사하기위한 플랫폼 역할을합니다. 평가의 방법도 intravital 및 공 촛점 현미경의 사용을 포함하여 시연됩니다. spinotrapezius 잘은 접근성 (표면 등쪽 해부학) 및 상대 두께 (60-200 μm)로 인해 같은 이미징 연구에 적합합니다. spinotrapezius 근육은 촉진, 얼굴 욕실이 장착 될 수있다조직 학적 sectioning없이 전체 - 근육 microvascular 네트워크 이미지. 우리는 기능 vasodilation 절차를 다음과 같은 통계를 얻기위한 intravital 현미경의 사용을 설명 할 수있다; 특히 근육 수축의 결과로 arterilar 직경의 증가. 우리는 또한 조직을 수확하고 해결을위한 절차, 연구 및 공 촛점 현미경의 사용을 immunostaining에 필요한 전구체를 보여줍니다.

Introduction

만성 국소 빈혈의 동물 모델은 주변 동맥 질환, 관상 동맥 질환, 뇌 혈관 질환 및 허혈성 질환 등의 pathophysiology를 조사를위한 유용한 도구입니다. 설치류에 인간에서와 같이 동맥 폐색은 arteriogenesis과 혈관 신생을 포함하여 혈관 네트워크의 구조 리모델링로 연결됩니다. 건강하고 젊은 환자에서이 개조는 국소 빈혈 유발 부상 조직을 구출하기에 충분 수 있지만, 당뇨병과 같은 공동 morbidities는 심각하게 개조 및 복구를 손상 할 수 있습니다. 혈관 리모델링 이벤트를 근간 메커니즘을 이해하는 것은 이러한 내생 revascularization 프로세스를 자극 요법을 개발하는 것이 필수적입니다.

현재 hindlimb의 대퇴 동맥의 결합 또는 절제술은 4,5 작은 동물에서 만성 국소 빈혈 유발 혈관 리모델링을 공부위한 표준 기술이다. 직경, 연결, 그리고 반응성 분석출혈도 잡았 넙 다리 동맥의 혈관 네트워크의 하류를 구성하는 microvessels은 근육의 두께로 인해 그러나, 어렵습니다. 이 안정화 등쪽 근육 1에 측면 피드 동맥의 일방적 결합 : 우리는 마우스 spinotrapezius 근육에 arteriolar 결합 모델을 개발했습니다. 상대적으로 얇은 spinotrapezius (60-200 μm)는 전체 조직에서 혈관 리모델링 이벤트에 대한 자세한 검사를 수 있도록 단일 셀 해상도 전체 네트워크 토폴로지의 평가를위한 실내 얼굴 immunostaining 의무가 있습니다. spinotrapezius는 표면 및 액세스 할 수 있습니다, 그래서 그 혈관은 쉽게 혈관 반응성에 대한 리모델링 및 arteriolar 결합의 영향의 효율적인 특성에 대해 intravital 현미경으로 관찰 할 수 있습니다.

이 보고서에서, 우리는 자세히 설명하고 마우스 spinotrapezius arteriolar의 결합 모델을 보여줍니다. 생체예 생체 내에서 두평가 다음과 같은 수술 thods은 허혈성 조건 6에서 장애인을 할 게재 된 기능 vasodilation, 그리고 전체 - 근육 microvascular 네트워크 immunofluorescent 이미지의 측정을 포함하여 설명되어 있습니다. 우리는 또한 모델의 유틸리티를 설명하기 위해 두 개의 파일럿 연구의 결과가 포함되어 있습니다. 첫째, 우리는 C57BL / 6 마우스 (그림 2B)의 선박 꼬부라 짐에 통계적으로 의미있는 증가를 유도하기 위해 동맥 결합 모델을 활용. arteriole의 민간인 피해에 arteriogenesis 동안 꼬부라 짐이 증가합니다. 다른 마우스 변종에서 그 부수적 인 arterioles의 부재 (예 : Balb / C)에 의한 국소 빈혈에 더 취약 있으며, 모세 혈관 arterialization 10을 관찰하고 있습니다. 모세관 arterialization이 증가 직경과 α-부드러운 근육 고를의 반응성의 개발에 의해 검출된다. 둘째, 근육의 기능 전기 자극은 spinotrapezi의 터미널 arterioles에 vasodilation로 연결우리가 (그림 3B).

Protocol

1. Spinotrapezius 피드 동맥 결합 외과

  1. intraperitoneal 주사하여 마우스를 마취. 0.5 ML의 주사기에서 책정 : 100 밀리그램 / ML 케타민의 0.06 ML을
    20.0 MG / ML Xylazine의 0.03 ML
    0.4 MG / ML 아트로핀의 0.01 ML
    0.9 %의 식염의 0.30 ML.
    용량 : 0.01 ML의 * g 체중 당, IP

마우스 변형 및 주식시 * 복용 변수, 유도에서 한 시간 이내에 마우스 복구가 따라 조정할 수 있습니다.

  1. 각막 건조를 방지하기 위해 표준 안과 연고를 적용합니다.
  2. 탈모 용 크림에 대한 간략한 응용 프로그램에 의해 다음 트리밍 가위를 사용하여 뒤쪽에서 머리를 제거합니다.
  3. chlorhexidine 또는 povidone-요오드와 수술 필드를 소독. povidone - 요오드로 끝나는 에탄올을 세 번으로 대체 povidone - 요오드.
  4. 가열 패드와 무균 드레이프으로, 이전에 준비 수술 작업 표면에 마우스를 전송장소 인치
  5. tenting하여 조직을 홍채 가위 및 표준 패턴 포셉 (예를 들면 FST, 11271-30)를 사용하여 평행하게 절단 어깨 블레이드의 뼈 부각에 꼬리 약 5mm의 등쪽 피부를 통해 선형 절개 (3~5밀리미터)를 만들기 척추. 대상 절개 사이트는 피부 착색을 허용하는 경우 등쪽의 지방 패드의 transdermal 시각화에 의해 식별 될 수 있으며, 지방 패드의 꼬리 경계에 자른다. 필요에 따라 절개를 확장하고 봄 가위를 사용하여 보조 피부 층을 통해 확장됩니다.
    1. 해부학 참고 - spinotrapezius 근육이 dorsally 위치해 있으며, 척추의 양쪽을 따라 L3에 T4에서 확장됩니다. 앞 국경은 약 어깨 블레이드 측면 확장합니다. 근육은 가장 뒤쪽 경계는 앞 국경에 안쪽 자리 잡고 있으며, 척추와 수세식하다 할 수 있도록 꼬리 방향으로 tapers. 두 지방 패드 spinotrapezius에 직접 등쪽과 복부 누워도 유의하는 것이 중요합니다 아르두개골 이분의 일에 대한 근육.
    2. 절개로 인해 염증이 사기의 결합 수술은 spinotrapezius의 vasculature의 리모델링에 변화를 보여주지로 혈관 리모델링 응답에 영향을 미치지 않습니다 것을 보여줘왔다. 두 공간 요소는이 결과에 기여합니다. 먼저 절개는 근육의 혈관 응답이 일반적으로 심사 관심 지역에서 두개의 방향으로 5mm에 의해 제거됩니다. 또한, 등쪽의 피부에 절개 사이트는 spinotrapezius 근육의 두개골 셋째 상단에 자리 잡고 있습니다 복부 지방 패드로 선박 결합 사이트에서 분리되어 있습니다.
  6. 근육 탈수를 방지하기 위해 따뜻하게 벨소리의 솔루션으로 절개를 관개. 같은 papaverine 등 vasodilators의 응용 프로그램은 결합의 대상 동맥을 시각화에 도움이 될 것입니다.
  7. 해부 현미경 아래에서 기본 musc에서 (제거 만) 해부 무딘과 분리 등쪽의 흰색 지방 패드를 집게를 사용하여이 입력과 측면 가장자리에 spinotrapezius을 떠난로 vasculature을 시각화하기 위해 ular 조직.
  8. 하나 또는 두 개의 쌍으로 정맥과 함께 근육의 외측 가장자리에에서의 길에 spinotrapezius에 복부있는 지방 패드를 통과 대상 동맥을 찾습니다. 이 동맥은 반영 및 근육 내 동맥의 경로를 관찰하기 위해 근육을 대체하여 확인 할 수있는 근육의 꼬리 반 상당한 부분을 피드. 결합의 대상 위치는 동맥은 복부 지방 패드를 종료하고 근육을 입력의 세그먼트이며,이 지역의 매우 액세스 할 수 있습니다. 동맥 - 정맥 쌍 부드럽게이 지역에 복부 지방 패드에서 분리해야 할 수 있습니다. spinotrapezius이 가로 등쪽과 복부 지방 패드 중 그 선박을 포함하여 여러 동맥 - 정맥 쌍으로 공급된다합니다. 이 선박를 중단 않도록주의보십시오.
    1. 여러 지표는 동맥을 구별하는 데 사용할 수 있습니다정맥에서. 가장 좋은 방법 중 하나는 부드럽게 microprobe와 혈액의 흐름을 방해하고 근육 멀리 상류로 이동하는 것입니다, 방해가 출시 될 때까지 흐름이 동맥에 다시 시작되지 않습니다. 정맥 벽은 동맥 부족하는 결합 조직의 약간 흰 드레스를 포함으로 색상도 사용할 수 있습니다. 정맥은 일반적으로 크기가 큰만큼 또한, 하나는 vasodilator의 응용 전에 직경을 고려해 볼 수 있습니다.
  9. 동맥은 짝을 정맥 가까이에 일반적이며, 동맥 뒤에 microprobe을 통과하고, 자연의 넓은 격차를 만들기 위해 팁을 사용하여, microprobe과 약 5mm 세그먼트를 분리하기 위해 # 5 포셉과 무딘 절개를 사용하여 동맥과 정맥 사이에 갈라진 틈. 이것은 봉합이 스레드 될 통해 격차입니다.
  10. 10-0 단일 스레드 봉합과 바늘 홀더 장소 외과 의사의 매듭을 사용하여 해부 세그먼트의 근위 끝 부분 피드 동맥 (~ 70 μm의 직경) 주위 결합을 사용합니다. PLA동맥의 절개를 허용 할 수 ligatures 사이에 충분한 분리와 해부 동맥 세그먼트의 말단부에 대한 CE는 추가 결합.
    1. spinotrapezius 피드 동맥과 관련된 소규모는 대퇴 동맥과 같은 큰 혈관의 결합에 비해 증가 수술 난이도로 연결됩니다. 경험이없는 의사는 특히 무리하게 떼어 냄, 부주의 출혈 등 수술 합병증의 높은 속도를해야합니다. 특히 우려 파악하고 흐름이 바로 절단하기 전에 방해 된 후 무색 동맥을 절단의 어려움입니다. 외과 의사가 동맥뿐만 아니라 2 ligatures의 쉽게 관찰 분리와 컷의 확인을 가로로 쪼개다 위치를 찾기위한 안내서를 가지고 이러한 이유로, 2 ligatures을 배치하여, 절차 익숙 사람들을 위해 권장됩니다. 그러나, 경험 많은 외과 의사는 오랫동안 사람들이 명확하게 할 수있는 등 하나의 끈이 충분 될 수 있습니다파악하고 끈의 동맥 하류를 잘라. 이 기술의 아니게 날카로운 결합의 봉합과 주변 혈관을 nicking의 위​​험을 줄일 수 있지만,이 동맥은 가로로 된 확인 증가 어려움 등의 단점없이하지 않습니다.
  11. 혈액 흐름의 감소 (방해 RBC 열) 결합 사이트의 하류 (근육에 대한 예) 관찰에 의해 결합을 확인합니다.
  12. 사용 해부 가위는 두 ligatures 사이의 출혈도 잡았 동맥을 가로로 쪼개다. 하나의 끈이 배치 된 경우 (11A), 하류 방향으로 극단적 인주의 자른다.
  13. 일반 필름로드 의약품 (1mm)이 실험 절차의 일환으로 (caudally) 하류 게재 할 수 있습니다.
  14. 원래 방향으로 변위 근막과 지방 조직을 변경할 수 있습니다.
  15. 8-0 비 resorbable 봉합을 사용하여 피부 절개를 닫습니다. 그런 관찰 준비 온수 복구 케이지에 마우스를 놓고 AP를 관리이러한 bupivacaine, 0.02-0.05 ML 0.25 % 지역 침투 등의 진통제를 propriate.

2. 현장에서 Spinotrapezius Intravital 현미경,

  1. 3~4%는 isoflurane 3-4 L의 유량 · 분 -1에서 100 % 산소로 기화로 유도 챔버에 마우스를 마취.
    1. injectable anesthetics보다 적은 유산소 운동 우울증이 있기 때문에 흡입 마취의 사용은 기능 측정을위한 바람직합니다. 같은 pentobarbital 나트륨 등을 사용할 수 없습니다, 오래 연기 injectable anesthetics에 흡입 마취는 동물이 위치 된 후에 반복 주사를 피하기 위해 선호하는 경우.
  2. 일단 anesthetized, 지속적으로 유지 보수 농도 (일반적으로 ~ 2 %) 및 0.5-1 L · 분 -1의 유속으로 마취 마스크 (일명 코 콘)를 통해 isoflurane 제공합니다.
    1. 마우스는 주로 자신의 비강을 통해 환기 때문에 만 NEC입니다마취 마스크 다이어프램 자신의 코를 충당 할 essary.
  3. 필요한 경우, 트리밍 가위와 탈모 크림을 사용하여 뒤쪽에서 머리를 제거합니다.
  4. 열 패드로 동물을 운송.
    1. 그것은 감​​기 유발 혈관 수축을 방지하기 위해 euthermic 상태의 생쥐를 유지하는 것이 중요합니다,이 방법은 램프를 통해 수행 할 수, 물 열 패드를 순환 microwavable는 패드 등을 가열
  5. 직장 온도 프로브를 넣고 35 온도 컨트롤러를 설정 ° C.
  6. 홍채 가위 및 표준 패턴 집게를 사용하여 spinotrapezius의 꼬리 끝에 피부 절개를합니다.
  7. , 지방 패드에 cranially 절개를 확장 말 신발 절개를 생성하고, 탈수를 방지하기 위해 플라스틱 랩과 함께 피부 플랩을 다룹니다.
  8. 노출을 극대화 할 수 포셉, 봄 가위로 피하 결합 조직을 해부 퉁명.
  9. 가까운 toge 등의 자극 전극을 삽입합니다가능한 한 군터, 현재 필드의 크기를 최소화하고, 척추에 불과 측면 노출 된 근육의 꼬리 끝에서 그들을 배치합니다.
  10. 1 Hz에서 제공되는 200 μsec 기간, 2mA 진폭의 제곱 파도와 함께, 전극 데이터 수집 시스템, 전극 자극 아이솔레이터, 컴퓨터 컨트롤러를 사용하여 전극 위치를 확인하기 위해 테스트 자극을 수행합니다.
  11. 탈수를 방지하기 위해 노출 근육 위에 플라스틱 랩을 놓습니다.
  12. 선박 직경이 평형되는 동안 30 분 기간을 타이밍 시작합니다.
  13. 혈관 구조를 볼 수 있습니다 spinotrapezius 근육 위에 intravital 현미경를 배치합니다.
    1. 이머 션 렌즈를 사용하는 경우, 대상과 랩 사이의 PBS 한 방울 넣습니다.
  14. 메인 arteriole (가장 큰 선박 표시) 위에 시작하면, 관심있는 혈관을 찾습니다 XY 평면에 무대를 조작.
    1. 작은 arteriol을 표시반사 - 빛 현미경과 에스는 붉은 세포 열이 제공하는 것보다 더 큰 대비를해야합니다. 우리는 주로 microvascular 대비를 향상시키기 위해 사이드 스트림 어두운 현장 영상 현미경을 사용하지만, 반대로도 높은 분자량 형광 dextran의 정맥 주사 후 반영 - 빛 형광 현미경으로 향상시킬 수 있습니다.
  15. 30 분 평균 후, 관심있는 선박의 이미지 / 비디오를 캡처합니다.
  16. 90 초 8 Hz에서에서 배달 200 μsec 시간, 2mA 진폭, 위에서 설명한 평방 파도와 함께 근육을 자극한다.
  17. 다른 이미지 / 동영상 바로 후 자극을 캡처하여 선박의 휴식 직경으로 돌아 때까지 분마다 캡처 계속 10 분 ~.
  18. contralateral 근육을 사용하여 단계 6-18를 반복합니다.
  19. 데이터 분석은 이미지 분석 소프트웨어와 비디오 캘리퍼스 또는 오프라인으로 실시간으로 수행 할 수 있습니다.
  20. 마우스가 따라 안락사시켜야ING IACUC 프로토콜입니다.

3. Spinotrapezius 조직 수확 및 고정

  1. Spinotrapezius 피드 동맥 결합 단계 1로 배합, intraperitoneal 주사로 쥐를 마취.
  2. 홍채 가위 및 표준 패턴 집게를 사용하여 마우스의 어깨 블레이드의 뼈 부각에 두개골 절개 몇 mm하십시오. 양쪽에 caudally 측면 후 절개를 확장합니다.
  3. 부드럽게 피부를 반영하고 얕은 근막을 절단하여 등쪽의 몸에서 피부를 놓습니다.
  4. 표준 집게를 사용하여 등쪽 지방 조직을 제거하고 근육을 반영하고 유사 복부 지방 조직을 해부하기 위해 무딘 절개를 사용하십시오.
  5. 집게 및 스프링 가위를 사용하여 근육 위에 놓인 근막을 제거합니다. 이 단계는 어렵고 시간이 많이 걸릴하지만, immunofluorescent 착색 및 이미징을 향상하는 것이 중요합니다 수 있습니다. 조직은 수화하는 것은 근막의 제거를 쉽게 할 수 있습니다.
  6. 찾기측면 근육의 경계, 그리고 거기에 복부 자리 잡고 지방 패드에서 spinotrapezius 근육을 분리하는 무딘 절개를 사용합니다.
  7. 꼬리 방향으로 두개의 무딘 절개을 계속합니다. 여러 혈관이 근육이 복부 표면을 입력하고 떠나 있습니다, 재관류가 필요한 경우, 이러한 혈관을 끊어 버렸네하기 전에 수행해야합니다. 그 근육의 꼬리 반으로, 그 측면 테두리 삽입을 거기에 복부 거짓말을 근육으로도합니다. 일부 절단이 완전히 가장자리를 정의하고 해방이 경계해야 할 수 있습니다.
  8. 소비세 spinotrapezius 근육. 이 작업을 수행하려면 :
    1. 무료 위에서 설명한대로 근육의 외측 가장자리.
    2. 근육의 가장 두개 정도에 걸쳐 횡 방향 자른다.
    3. 시상면에서, 안쪽 테두리 (척추를 따라)을 따라 잘라.
  9. 반복 절차는 contralateral 근육에 4-9 단계를 한 다음 m를 안락사시켜야IACUC 승인 방식에 의한 ouse.
  10. 차가운 메탄올 (4 ° C) 또는 20 분의 4 % paraformaldehyde / RT의 탈 이온수 솔루션에 빠져있는 젤라틴 코팅 유리 슬라이드에 조직 문제를 해결했습니다.
    1. 또한, 재관류 고정이 채용 될 수있다. 2 단계 이전에, 1의 5 ML × 4의 5 ML 다음, 0.1 MM CaCl 2, 왼쪽 심실을 통해 2 %의 헤파린과 생리 트리스 버퍼로 오른쪽 아트리움에 절개를 만들어 thoracotomy을 수행하고 perfuse의 vasculature %의 선박 고정 용 paraformaldehyde, 1의 마지막 5 ML × 0.1 MM CaCl 2 7과 생리 트리스 버퍼.
  11. 바로 다음과 같은 고정, 네 번 20 분을 위해 표본을 씻어 각 0.1 % 사포닌을 0.01 M 인산 버퍼 생리 (PBS)를 사용하여.

Representative Results

결합을 거쳐 spinotrapezius 근육 먹이를 주요 동맥의 수술 전망은 관심 분야를 나타내는 레이블과 함께 그림 1에 표시됩니다. 결합은 그림 2A에 표시 한 후 바로 하류에 출혈도 잡았 동맥 일주에 위치한 근육의 수확과 immunostained 지역의 예를 들어 공 촛점 이미지입니다. 평활근 세포 (적색)을 표현 평활근 알파 - 고를를 포함하는 확대 된 부수적 인 arterioles이 결합 다음과 같은 특성 꼬부라 짐을 표시합니다. 출혈도 잡았 근육의 혈관 경로 길이와 코드 거리 (즉, 동일한 선박 경로 끝점으로 연장 선) 사이의 비율로보고 선박 꼬부라 짐은, (오른쪽) (; N = 8 그림 2B) unligated contralateral 근육에 상대적으로 향상 . 그림 3은 터미널 arteriole 기능 vasodilation은 intravital 현미경을 사용하여 측정 된에 파일럿 연구의 결과를 보여줍니다. 예상대로, arteriolar 디 ameter 크게 전기 자극을 유발 근육 수축에 따라 증가합니다.

그림 1
1 그림. 반영 spinotrapezius 근육 피드 동맥 수술 분야. 피드 동맥이 A0로 표시 두 곳에서 출혈도 잡았 있습니다. 이 ligatures 사이 bloodflow의 방해 후 동맥이 표시 사이트에서, D에 의해 명시된 바와 같이, spinotrapezius 근육에, A.에 의해 C에 의해 설명 된 복부 지방 패드에서 동맥 전환의 대상 세그먼트를 표시 현장에서 었어요 화살표 B. 흐름 방향 점선 화살표 E.로 표시됩니다와

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그림 2. 꼬부라 짐의 파일럿 연구 spinotrapezius 근육의 microvascular 네트워크의 공 촛점 이미지. (A) 수확 및 전체 - 장착 근육이 공 촛점 현미경을 사용하여 평활근 알파 - 고를 및 이미징을위한 immunostained되었습니다. 보기의 필드는 근육의 영역이 바로 하류 출혈도 잡았 arteriole 1 주 후 결합의 위치 보여줍니다. 고통스러운 혈관 결합의 결과로 근육에 증거들이 (B) 파일럿 연구 결과는 크게 (P는 = 0.035, 1 꼬리 학생의 t-테스트) 증가를 나타냅니다. 꼬부라 짐이에 선박 경로 길이에 의해 측정으로 출혈도 잡았 근육에 microvessels에 의해 전시 C57BL / 6 마​​우스의 시험에 대한 코드를 거리 비율 (N = 8) contralateral 제어에 비해.

그림 3
Figu3 다시. 생체 내 spinotrapezius의 arterioles의 기능 vasodilation의 Intravital 현미경 이미징. 휴식 (A) 대표 휴식 (왼쪽)에서 spinotrapezius 터미널 arterioles의 photomicrographs 즉시 8 Hz에서 근육의 수축 (오른쪽)의 정지를 따라가. (B) 터미널 arteriole 직경 ( 8.5 ± 0.5 μm, 왼쪽)와 바로 다음의 (11 ± 1 μm, 중) 크게 arteriolar 직경 (증가 근육 수축의 90 초, P = 0.032, 1 꼬리)가 Balb / C 마우스에서 t-테스트 짝 (n은 = 6). 비율 변화 (오른쪽) 지적했다.

Discussion

여기에 제시된 손쥐 spinotrapezius의 결합 모델은 동맥 폐색의 기능 및 구조 적응이 결과를 연구 할 수있는 효과적인 작은 동물 모델입니다. 이 모델은 광범위하게 사용되는 hindlimb의 국소 빈혈 모델 4 보완입니다 점에서 높은 공간적 해상도 그대로 microvascular 네트워크 전체 - 근육의 전망을 제공합니다. 이 근육은 단지 등쪽 피부 아래에 자리 잡고 있기 때문에 또한, 그것은 intravital 현미경과 시리얼 이미징에, 그리고 superfusion 또는 박막 주입이를 통해 지역 약물 투여에 액세스 할 수 있습니다. 이러한 기능은 동맥 폐색에 따라 혈관 리모델링 및 기능 vasodilation에 소설 치료 목표의 효과를 연구하기에 매력적인 작은 동물 모델하십시오.

때문에 몇 가지 주요 D에 hindlimb 결합 모델에서 얻은 데이터에 spinotrapezius 결합 모델에서 얻은 데이터를 비교 때주의를 사용해야합니다ifferences. 첫째, spinotrapezius 근육은 근육을 안정화하고 있으며, 그들은 기능과 섬유 유형 분포의 측면에서 다리 근육 다릅니다. 우리 그룹은 이전에 spinotrapezius 근육의 arteriolar 결합이 아니라 hindlimb 모델 1,8에있는 대퇴 동맥의 결합에 따라 hindpaw에서 관찰 hypoxia에 비해 잘 발달 부수적 인 arteriolar 네트워크와 긴장에 작거나 무시할 hypoxia를 만들어 보여주었습니다 - 10. 우리는 또한 spinotrapezius 결합 모델은 기존 arteriolar 연결 3의 확대에 의해 모세관 collateralization 및 C57bl / 6 개조로 Balb / C 마우스 네트워크 리모델링과 C57bl / 6 마우스에 비해 Balb / C 마우스에서 다른 리모델링 응답을 생성하는 것으로 나타났습니다. 이러한 관찰과 hindlimb 결합 모델에서 만든 그 사이에 재미있는 평행가 있습니다 항에있어서, 상기 Balb / C 마우스 C57bl / 6 마우스 9,11,12에 비해 결합에 따라 연장 재관류 복구를 경험 </>를 논의하게 될 것입니다. 우리가 아직 spinotrapezius 결합 모델에서 이러한 predictors을 테스트하지 않은 있지만 조직 국소 빈혈, 마우스 13 세 성별 14(15)의 존재의 다른 모델도 arteriolar 가림으로 조직의 반응에 영향을 미칠 수.

둘째, spinotrapezius 모델에 출혈도 잡았되는 동맥의 크기는 대퇴 동맥보다 실질적으로 작이며, 따라서 결합은 spinotrapezius에 순환 트리의 낮은 수준에서 즉, 더 하류있는 작은 조직 볼륨에 미치는 영향 hindlimb 3 비교했다. 이 개입에 해당 생리적 반응 (예를 들면 혈관 리모델링)과 비교했을 때 따라서,이 두 모델의 결합의 위치에있는 해부학 적 차이는 고려되어야한다.

셋째, spinotrapezius의 두께는 산소가 이웃에서 조직의 unperfused 부분에 도달 할 수 있습니다3 위 명시된대로 hindlimb 모델의 결합 된 국소 빈혈과 hypoxia에 비해 조직. 넷째, 결합의 spinotrapezius 하류 부분에 흐름의 복구 hindlimb 결합보다 빠릅니다. spinotrapezius 결합 모델은 고유 한 만성 모델이며, 국소 빈혈 reperfusion의 부상 과도 동맥 폐색이나 모델의 다른 모델과 혼동해서는 안됩니다. 우리는 조건의 이러한 유형을 수용 할이 모델을 적용하는 것이 가능 고려해야하지만,이 여기에 제시 작업의 범위를 넘어입니다. 마지막으로, 우리는 젊은 쥐 달리 건강하고 높은 심장 박동 5와 고유의 생리적 한계로 인해를 활용 특히 직접 인간의 허혈성 질환의 임상 적 발현이 모델에 사전 임상 관찰과 관련된에 대한주의. 그럼에도 불구하고, 우리는 결합에 조직 반응의 기본 메커니즘을 잠복하고 잠재적 인을 식별하기위한 중요한 도구로이 새로운 모델을 간주의 생체 설정에 rapeutic 목표.

spinotrapezius 피드 동맥 결합 절차 (해부학 정맥 (9A)에서 동맥을 구별 노트 (6A), 그리고 하나의 끈 (11A)의 사용)에서 제공하는 수술 노트에서 프로 시저 혜택의 몇 가지 측면뿐만 아니라 토론.

첫째, 등쪽의 지방 패드 국경 (또는 transdermal 시각화 할 수없는 경우 어깨 블레이드에 꼬리 몇 mm)으로 만든 최초의 절개는 이상적으로 외과 의사가있는 편안한 작게했고, 필요한 경우 절차를 수행하는 동안 확장됩니다. 이러한 행위는 외과 의사에 편리합니다 절개를 닫 필요한 suturing을 최소화 절차 시간을 단축하고, 또한 복구시 동물에 덜 자극적입니다. 근육이 확장 필드를 찾을 수 쉬울 수 있기 때문에 또한, 큰 피부 절개는 외과 의사 환경 설정에 따라 적합 할 수 있습니다. 이 경우 절개는 할 수있다척추를 향해 개고 수 있도록 중간 개방 얼굴 말 - 신발 모양 혜택을 누리 실 수 있습니다. 피부 절개를 만들고 표면 혈관이 손상 및 출혈의 원인이되는 경우 보조 피부 층을 통해 확장하는 동안 멸균 거즈로 빛을 압력을 적용하고 지혈 시간을 제공합니다.

또한 참고로,이 최소 힘으로 조직을 처리하는 것이 중요하며, 가능한 가까운 근육의 측면 국경과 거리 의도 허혈성 영역에서 집게로 누르고 있습니다. 이 연습은 동맥 결합에 의해 evoked 혈관 리모델링 응답을 먹이고 수있는 추가 염증성로 인한 조직 반응을 일으킬 수 호감 부상을 방지하는 데 도움이됩니다.

결론적으로, 우리는 arteriolar 결합에 혈관과 조직 반응을 조사를위한 수술 모델로 손쥐 spinotrapezius 근육의 사용을 보여주고 있습니다. 이 모델은 (대한 혈관 변경 intravital 평가에 적합합니다예를 들어, 기능 vasodilation), 그리고 혈관 변경 전 생체 평가 (예를 들어, 혈관 네트워크 immunofluorescent 이미징 및 quantitation 개). 두 사전 임상 및 임상 연구 arteriolar 장애물 (인간의 생쥐 또는 atherosclerotic 액자의 결합을 통해 예를 들어)에 대한 개인의 반응은 나이에 따라 달라집니다 것을 증명 한 질병의 유무 (예 : 당뇨병) 방해 동맥의 직경 , 개인, 그리고 조직 11-15의 대사 요구의 유전 메이크업. 이러한 여기에 제시된 것과 손쥐 모델은 이러한 복잡한 관계에 대한 조사를 용이하게 스트레인 특정 해부학 적 및 유전 차이점과 질병 특정 phenotypes의 연구원 소용.

Disclosures

제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없습니다 선언합니다.

Acknowledgments

우리는 그의 트랙 '공항 라운지', '배경 화면'및 '야간 멜로 드라마 (외관의 순서)를 포함하여, 관련 동영상에 자신의 크리에이티브 커먼즈 라이센스 음악의 사용을 위해 케빈 Macleod을 인정합니다. " 우리는 또한 수술 동영상의 도움을 Ndubisi Okeke와 프레 더릭 Torstrick을 인정하고 싶습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Iris scissors FST 14090-09 Type: Tool
Size 7 forceps FST 11271-30 Type: Tool
Size 5 forceps FST 11251-20 Type: Tool
Spring scissors Roboz RS5671 Type: Tool
Microprobe FST 10140-03 Type: Tool
May be substituted with straight probe
Needle holder FST 12500-12 Type: Tool
Induction chamber JD Medical Dist. Co., Inc. IC-1086 Type: Equipment
Eye Gel Dechra NDC 17033-211-38 Type: Reagent
Heat pad FST 21060-01 Type: Equipment
Rectal temperature probe FST 21060-01 Type: Equipment
Stimulating electrodes FHC UEWSGCSE0N1M Type: Equipment
Artisan's Polymer Clay Polyform N/A Type: Equipment
PowerLab data acquisition system ADInstruments ML 845 Type: Equipment
Stimulus isolator ADInstruments FE 180 Type: Equipment
LabChart ADInstruments ML S060/7 Type: Software
Reflected-light fluorescent microscope Olympus BFXM Type: Equipment
High MW fluorescent dextran Sigma FD250S-100MG Type: Reagent
Video calipers Colorado Video 308 Type: Equipment
Automated Vascular Analysis (AVA) Microvision Medical Type: Software
Anti-αSMA Conjugated Fluorophore Sigma 1A4-Cy3 Type: Reagent
Clonal, 1:100
Fluorescent Microscope Olympus BFXM Type: Equipment
High-molecular weight fluorescent dextran Sigma FD250S-100MG Type: Reagent

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References

  1. Bailey, A. M., O'Neill, T. J., Morris, C. E., Peirce, S. M. Arteriolar Remodeling Following Ischemic Injury Extends from Capillary to Large Arteriole in the Microcirculation. Microcirculation. 15, 389-404 (2010).
  2. Bruce, A. C., Peirce, S. M. Exogenous Thrombin Delivery Promotes Collateral Capillary Arterialization and Tissue Reperfusion in the Murine Spinotrapezius Muscle Ischemia Model. Microcirculation. 19, 143-154 (2012).
  3. Mac Gabhann, F., Peirce, S. M. Collateral capillary arterialization following arteriolar ligation in murine skeletal muscle. Microcirculation. 17, 333-347 (2010).
  4. Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine Model of Hindlimb Ischemia. J. Vis. Exp. (23), e1035 (2009).
  5. Madeddu, P., et al. Murine models of myocardial and limb ischemia: diagnostic end-points and relevance to clinical problems. Vascul. Pharmacol. 45, 281-301 (2006).
  6. Cardinal, T. R., Kurjiaka, D. T., Hoying, J. B. Chronic hindlimb ischemia impairs functional vasodilation and vascular reactivity in mouse feed arteries. Front. Physio. 2, 91 (2011).
  7. Sefcik, L. S., et al. Selective Activation of Sphingosine 1-Phosphate Receptors 1 and 3 Promotes Local Microvascular Network Growth. Tissue Eng. Part A. 17, 617-629 (2011).
  8. Deindl, E., et al. Role of Ischemia and of Hypoxia-Inducible Genes in Arteriogenesis After Femoral Artery Occlusion in the Rabbit. Circulation Research. 89, 779-786 (2001).
  9. Chalothorn, D., Zhang, H., Smith, J. E., Edwards, J. C., Faber, J. E. Chloride Intracellular Channel-4 Is a Determinant of Native Collateral Formation in Skeletal Muscle and Brain. Circulation Research. 105, 89-98 (2009).
  10. Scholz, D., et al. Contribution of Arteriogenesis and Angiogenesis to Postocclusive Hindlimb Perfusion in Mice. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 775-787 (2002).
  11. McClung, J. M., et al. Skeletal muscle-specific genetic determinants contribute to the differential strain-dependent effects of hindlimb ischemia in mice. Am. J. Pathol. 180, 2156-2169 (2012).
  12. Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117, 1207-1215 (2008).
  13. Faber, J. E., et al. Aging causes collateral rarefaction and increased severity of ischemic injury in multiple tissues. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31, 1748-1756 (2011).
  14. Peng, X., et al. Gender differences affect blood flow recovery in a mouse model of hindlimb ischemia. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 300, 2027-2034 (2011).
  15. Li, Y., Guan, H., Hazarika, S., Liu, C., Annex, B. H. Impaired angiogenesis following hind-limb ischemia in diabetes mellitus mice. Chin. Med. Sci. J. 22, 232-237 (2007).
Microvascular 기능 및 리모델링에 Arteriolar 결합의 영향을 평가하기 위해 손쥐 Spinotrapezius 모델
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Guendel, A. M., Martin, K. S., Cutts, J., Foley, P. L., Bailey, A. M., Mac Gabhann, F., Cardinal, T. R., Peirce, S. M. Murine Spinotrapezius Model to Assess the Impact of Arteriolar Ligation on Microvascular Function and Remodeling. J. Vis. Exp. (73), e50218, doi:10.3791/50218 (2013).More

Guendel, A. M., Martin, K. S., Cutts, J., Foley, P. L., Bailey, A. M., Mac Gabhann, F., Cardinal, T. R., Peirce, S. M. Murine Spinotrapezius Model to Assess the Impact of Arteriolar Ligation on Microvascular Function and Remodeling. J. Vis. Exp. (73), e50218, doi:10.3791/50218 (2013).

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