Vi viser en roman arteriell ligation modell i murine spinotrapezius muskel, inkludert en steg-for-steg prosedyre og beskrivelse av ønsket instrumentering. Vi beskriver kirurgi og relevante utfallet målinger knyttet til vaskulær nettverk ombygging og funksjonelle vasodilatasjon med intravital og konfokalmikroskopi.
Murine spinotrapezius er en tynn, overfladisk skjelettlidelser støtte muskel som strekker seg fra T3 til L4, og er lett tilgjengelig via dorsal huden innsnitt. Dens unike anatomi gjør spinotrapezius nyttige for undersøkelse av iskemisk skade og påfølgende mikrovaskulær remodeling. Her viser vi en arteriolar ligation modell i murine spinotrapezius muskel som ble utviklet av vår forskning team og tidligere publisert 1-3. For visse sårbare musestammer, som Balb / c mus, skaper denne ligation kirurgi pålitelig skjelettmuskulatur iskemi og tjener som en plattform for å undersøke terapier som stimulerer revaskularisering. Metoder for vurdering er også vist, inkludert bruk av intravital og konfokalmikroskopi. Den spinotrapezius er godt egnet til slike imaging studier på grunn av sin tilgjengelighet (overflatisk dorsal anatomi) og relativ tynnhet (60-200 um). Den spinotrapezius muskel kan monteres en face, tilretteleggingavbildning av hel-muskel mikrovaskulære nettverk uten histologisk snitting. Vi beskriver bruken av intravital mikroskop for å skaffe beregninger etter en funksjonell vasodilatasjon prosedyre, spesielt økningen i arterilar diameter som følge av muskel sammentrekning. Vi viser også prosedyrene for høsting og fikse vev, en nødvendig forløper til farging studier og bruk av konfokal mikroskopi.
Dyremodeller av kronisk iskemi er verdifulle verktøy for å undersøke patofysiologien av iskemiske sykdommer, for eksempel perifer karsykdom, koronarsykdom, og cerebrovaskulær sykdom. I gnagere, som hos mennesker, fører arteriell okklusjon til strukturell ombygging av vaskulære nettverket, herunder arteriogenesis og angiogenese. Hos friske og yngre pasienter, kan dette remodeling være tilstrekkelig til å redde vev fra iskemi-indusert skade, men komorbiditet som diabetes kan alvorlig kompromittere ombygging og utvinning. Forstå mekanismene bak vaskulær remodellering hendelser er avgjørende for utvikling av terapi som stimulerer disse endogene revaskulariserings prosesser.
Foreløpig er lårarterie ligation eller reseksjon i hindlimb standard teknikk for å studere kronisk iskemi-indusert vaskulær remodellering i små dyr 4,5. Analyse av diameter, tilkoblingsmuligheter, og reaktivitet avde microvessels som utgjør det vaskulære nettverket nedstrøms ligert lårarterie er imidlertid vanskelig, på grunn av tykkelsen av musklene. Vi har utviklet en arteriolar ligation modell i mus spinotrapezius muskler: ensidig ligation av lateral fôr arterien i denne stabiliserende dorsal muskler en. De relativt tynne spinotrapezius (60-200 mikrometer) er mottagelig for en face farging for vurdering av hele nettverkstopologi med encellede oppløsning, slik at en detaljert undersøkelse av vaskulær remodellering hendelser i hele vev. Den spinotrapezius er også overfladisk og tilgjengelig, og dermed dets skip er lett observerbar av intravital mikroskopi, for effektiv karakterisering av virkningen av ombygging og arteriolar ligation på vaskulær reaktivitet.
I denne rapporten beskriver vi i detalj og demonstrere musen spinotrapezius arteriolar ligation modell. Både in vivo og ex vivo megdikk vurderingsform etter kirurgi er beskrevet, inkludert måling av funksjonell vasodilatasjon, som har vist seg å være svekket i henhold iskemiske betingelser 6 og immunofluorescerende avbildning av hel-muskel mikrovaskulære nettverk. Inkluderer vi også resultatene av to separate pilotstudier å demonstrere nytten av modellen. Først utnyttet vi den arterielle ligation modell for å indusere en statistisk signifikant økning i fartøyets tortuosity i C57BL / 6 mus (figur 2B). Tortuosity øker under arteriogenesis i arteriole collaterals. I andre musestammer, som er mer utsatt for ischemi på grunn av fravær av sikkerhetsverdier arterioler (f.eks Balb / c), er kapillar arterialization observert 10. Kapillær arterialization blir oppdaget av økt diameter og utvikling av α-glatt muskulatur aktin reaktivitet. Sekund, fører funksjonell elektrisk stimulering av muskelen til vasodilatasjon i terminal arterioler av spinotrapezioss (Figur 3B).
Murine spinotrapezius ligation modell som presenteres her er en effektiv liten dyremodell å studere de funksjonelle og strukturelle tilpasninger som følger av en arteriell okklusjon. Denne modellen er komplementær til mye brukt hindlimb iskemi modell 4, som gir det en hel-muskel visning av intakte mikrovaskulære nettverk med høy romlig oppløsning. Videre, fordi denne muskelen ligger like under dorsal huden, er det tilgjengelig til seriell bildebehandling med intravital mikroskopi, og til lokal levering av legemidler via superfusjons eller tynn film implantasjon 2. Disse funksjonene gjør det til et attraktivt liten dyremodell for å studere effekten av nye terapeutiske mål på vaskulær remodellering og funksjonell vasodilatasjon etter arteriell okklusjon.
Vær oppmerksom på at forsiktighet bør brukes når du sammenligner data ervervet i spinotrapezius ligation modell til data ervervet i hindlimb ligation modellen på grunn av flere sentrale differences. Først blir spinotrapezius muskler stabilisere musklene, og de skiller seg fra de leggmusklene i form av funksjon og fiber type distribusjon. Vår gruppe har tidligere vist at arteriolar ligering i spinotrapezius muskelen skaper mindre eller ubetydelig hypoksi i stammer med velutviklede collateral arteriolar nettverk, i forhold til den hypoksi observert i hindpaw følge lårarterien ligering i hindlimb modellen 1,8 – 10. Vi har også vist at den spinotrapezius ligation modellen gir en annen remodeling respons i Balb / c mus sammenlignet med C57BL / 6 mus, med Balb / c-mus-nettverk remodeling ved kapillær collateralization og C57BL / 6 remodeling ved utvidelse av eksisterende arteriolar tilkoblinger 3. Det er en interessant parallell mellom disse observasjonene og de gjorde i hindlimb ligation modeller, hvori Balb / c mus oppleve en langvarig perfusjon restitusjon etter ligation forhold til C57BL / 6 mus 9,11,12 </ Sup>. I andre modeller av vev iskemi, mus alder 13 14 kjønn og tilstedeværelse av sykdom 15 også kunne påvirke vev responser på arteriolar okklusjon, selv om vi ennå ikke har testet disse prediktorene i spinotrapezius ligation modell.
Sekund, er størrelsen av arterien som er ligert i spinotrapezius modellen betydelig mindre enn lårarterie, og derfor påvirker ligation et mindre vevvolum som er lenger nedstrøms, dvs. på et lavere nivå av sirkulasjons tre, i spinotrapezius sammenlignet med hindlimb 3. Derfor bør den anatomiske forskjellen i plasseringen av ligering i disse to modellene betraktes når man sammenligner de respektive fysiologiske responser (f.eks vaskulær remodellering) til dette inngrep.
Tredje kan tykkelse på spinotrapezius tillate oksygen å nå unperfused parti av vevet fra nabolandetvev, sammenlignet med den kombinerte iskemi og hypoksi i hindlimb modellen som beskrevet over 3. Fjerde, er utvinning av vannmengde til den delen av spinotrapezius nedstrøms ligation raskere enn i hindlimb ligering. Den spinotrapezius ligation modellen er en unik kronisk modell og må ikke forveksles med andre modeller av forbigående arteriell okklusjon eller modeller av ischemi reperfusjonsskade. Vi anser det mulig å tilpasse denne modellen for å imøtekomme disse typer forhold, men dette er utenfor omfanget av arbeidet presentert heri. Til slutt, advarer vi mot direkte knyttet pre-kliniske observasjoner i denne modellen til kliniske manifestasjoner av iskemisk sykdom hos mennesker, spesielt når utnytte unge og ellers friske mus og på grunn av den iboende fysiologiske grenser som høyere hjertefrekvens 5. Likevel, ser vi denne nye modellen som et verdifullt verktøy for å avdekke grunnleggende mekanismer for vev svar på ligation og identifisere potensialetrapeutic mål i en in vivo-innstillingen.
I tillegg til de kirurgiske notater gitt i spinotrapezius fôr arterien ligation prosedyre (anatomisk note (6a), skille arterien fra blodåre (9a), og bruk av en enkelt ligatur (11a)), noen andre aspekter av prosedyren nytte diskusjon.
Først, er den innledende innsnitt gjort over dorsal fettpute kant (eller flere mm kaudal til skulderbladene, hvis transdermal visualisering er ikke mulig) ideelt laget så liten som kirurgen er komfortabel med, og utvidet under prosedyren hvis det er nødvendig. Denne praksisen minimerer suturering kreves for å lukke innsnitt, som er praktisk for kirurgen, reduserer prosedyre tid, og er også mindre irriterende for dyret under utvinning. Alternativt kan en større hud innsnitt være hensiktsmessig i henhold til kirurgen foretrekker, siden muskel kan være lettere å finne med et utvidet felt. I dette tilfellet, innsnitt kandra nytte av en hestesko form med en medial åpent ansikt for å tillate folding mot ryggraden. Samtidig som huden innsnitt og som strekker seg gjennom de sekundære hudlagene, hvis et overflatefartøy er skadet og forårsaker blødning, pålegges lett trykk med sterilt gasbind og gi tid for hemostase.
Også av notatet, er det viktig å behandle vevet med minimal nødvendig kraft, og hvor mulig hold med pinsett nærmere musklenes laterale kant og bort fra den tiltenkte iskemisk sonen. Denne praksisen bidrar til å unngå klemskade, noe som kan føre til ytterligere provoserende-medierte vev tiltak som kan forvirre den vaskulær remodellering respons fremkalt av den arterielle ligation.
Som konklusjon, har vi vist at bruken av den murine spinotrapezius muskelen som kirurgisk modell for å undersøke vaskulære og vev responser på arteriolar ligering. Denne modellen er egnet for vurdering av intravital vaskulære endringer (foreksempel funksjonelle vasodilatasjon), og for ex vivo vurdering av vaskulære endringer (for eksempel immunofluorescerende avbildning og kvantifisering av vaskulære nettverk). Begge pre-kliniske og kliniske studier har vist at et individs respons på arteriolar obstruksjon (f.eks via ligering i mus eller aterosklerotiske plakk i mennesker) er avhengig av alder deres nærvær eller fravær av sykdom (f.eks diabetes mellitus) diameteren til hindret arterien , den genetiske sammensetningen av den enkelte, og den metabolske etterspørsel av vevet 11-15. Murine modeller, for eksempel den som presenteres her, benytte forskeren av stamme-spesifikke anatomiske og genetiske forskjeller og sykdomsspesifikke fenotyper, noe som letter gransking av disse komplekse relasjoner.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkjenner Kevin Macleod for bruk av sin Creative Commons lisensiert musikk i tilknyttede video, inkludert (i rekkefølgen) sin spor "Airport Lounge", "Wallpaper" og "Evening Melodrama". Vi ønsker også å erkjenne Ndubisi Okeke og Frederick Torstrick for deres hjelp med kirurgi video.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Iris scissors | FST | 14090-09 | Type: Tool |
Size 7 forceps | FST | 11271-30 | Type: Tool |
Size 5 forceps | FST | 11251-20 | Type: Tool |
Spring scissors | Roboz | RS5671 | Type: Tool |
Microprobe | FST | 10140-03 | Type: Tool May be substituted with straight probe |
Needle holder | FST | 12500-12 | Type: Tool |
Induction chamber | JD Medical Dist. Co., Inc. | IC-1086 | Type: Equipment |
Eye Gel | Dechra | NDC 17033-211-38 | Type: Reagent |
Heat pad | FST | 21060-01 | Type: Equipment |
Rectal temperature probe | FST | 21060-01 | Type: Equipment |
Stimulating electrodes | FHC | UEWSGCSE0N1M | Type: Equipment |
Artisan’s Polymer Clay | Polyform | N/A | Type: Equipment |
PowerLab data acquisition system | ADInstruments | ML 845 | Type: Equipment |
Stimulus isolator | ADInstruments | FE 180 | Type: Equipment |
LabChart | ADInstruments | ML S060/7 | Type: Software |
Reflected-light fluorescent microscope | Olympus | BFXM | Type: Equipment |
High MW fluorescent dextran | Sigma | FD250S-100MG | Type: Reagent |
Video calipers | Colorado Video | 308 | Type: Equipment |
Automated Vascular Analysis (AVA) | Microvision Medical | Type: Software | |
Anti-αSMA Conjugated Fluorophore | Sigma | 1A4-Cy3 | Type: Reagent Clonal, 1:100 |
Fluorescent Microscope | Olympus | BFXM | Type: Equipment |
High-molecular weight fluorescent dextran | Sigma | FD250S-100MG | Type: Reagent |