Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Modelo murino Spinotrapezius para evaluar el impacto de la ligadura arteriolar en la función microvascular y Remodelación

doi: 10.3791/50218 Published: March 3, 2013
* These authors contributed equally

Summary

Demostramos un nuevo modelo ligadura arterial en el músculo spinotrapezius murino, incluyendo un procedimiento paso a paso y la descripción de la instrumentación requerida. Se describe la cirugía y las medidas de resultado relevantes relacionados con la remodelación de la red vascular y vasodilatación funcional utilizando microscopía intravital y confocal.

Abstract

El spinotrapezius murino es un músculo delgado y superficial soporte del esqueleto que se extiende desde T3 a L4, y es fácilmente accesible a través de incisión en la piel dorsal. Su anatomía única hace que los spinotrapezius útil para la investigación de la lesión isquémica microvascular y la remodelación posterior. Este sentido, demostrar un modelo de la ligadura de las arteriolas en el músculo murino spinotrapezius que fue desarrollado por nuestro equipo de investigación y publicado previamente 1-3. Para ciertas cepas de ratón vulnerables, tales como el ratón Balb / c, esta cirugía de ligadura crea de forma fiable la isquemia del músculo esquelético y sirve como plataforma para la investigación de terapias que estimulan la revascularización. Métodos de evaluación también se ha demostrado, incluyendo el uso de la microscopía intravital y confocal. El spinotrapezius se adapta bien a los estudios de imagen tales debido a su accesibilidad (anatomía dorsal superficial) y delgadez relativa (60-200 micras). El músculo spinotrapezius se puede montar en face, facilitandoformación de imágenes de músculo entero redes microvasculares sin seccionar histológico. Se describe el uso de la microscopía intravital para adquirir siguientes mediciones un procedimiento vasodilatación funcional; específicamente, el aumento en el diámetro arterilar como resultado de la contracción muscular. También demuestran los procedimientos para la recolección y la fijación de los tejidos, un precursor necesario para la inmunotinción estudios y el uso de la microscopía confocal.

Introduction

Los modelos animales de isquemia crónica son herramientas valiosas para la investigación de la fisiopatología de las enfermedades isquémicas, tales como enfermedad arterial periférica, enfermedad de la arteria coronaria y enfermedad cerebrovascular. En los roedores, como en los seres humanos, la oclusión arterial conduce a la remodelación estructural de la red vascular, incluyendo la arteriogénesis y la angiogénesis. En pacientes sanos y jóvenes, esta remodelación puede ser suficiente para rescatar el tejido de la isquemia inducida por la lesión, pero comorbilidades tales como la diabetes puede comprometer gravemente la remodelación y la recuperación. La comprensión de los mecanismos subyacentes a los eventos vasculares remodelación es esencial para el desarrollo de terapias que estimulan estos procesos endógenos de revascularización.

Actualmente, la ligadura de la arteria femoral o la resección en la extremidad posterior es la técnica estándar para el estudio crónica inducida por isquemia remodelación vascular en animales pequeños 4,5. Análisis del diámetro, la conectividad y la reactividad de loslos microvasos que forman aguas abajo de la red vascular de la arteria femoral ligada es difícil, sin embargo, debido al grosor de los músculos. Hemos desarrollado un modelo de ligadura arteriolar en el músculo de ratón spinotrapezius: ligadura unilateral de la arteria de alimentación lateral en este músculo dorsal estabilizador 1. Los spinotrapezius relativamente delgadas (60-200 micras) es susceptible de inmunotinción en face para la evaluación de la topología de toda la red con una sola célula de resolución, lo que permite un examen detallado de los acontecimientos de remodelación vascular a través de todo el tejido. El spinotrapezius es también superficial y accesible, y por lo tanto sus buques son fácilmente observables por microscopía intravital, para la caracterización eficiente de los efectos de la remodelación y la ligadura arteriolar en la reactividad vascular.

En este reporte se describe en detalle y demostrar el ratón spinotrapezius modelo ligadura arteriolar. Tanto in vivo y ex vivo methods de la cirugía de evaluación siguiente se describen, incluyendo la medición de la vasodilatación funcional, que se ha demostrado que se deteriora bajo condiciones isquémicas 6, y las imágenes de inmunofluorescencia de redes microvasculares de músculo entero. También incluimos los resultados de dos estudios piloto por separado para demostrar la utilidad del modelo. En primer lugar, se utilizó el modelo de ligadura arterial para inducir un aumento estadísticamente significativo en la tortuosidad buque en C57BL / 6 ratones (Figura 2B). Aumenta la tortuosidad durante arteriogénesis colaterales en las arteriolas. En otras cepas de ratón, que son más vulnerables a la isquemia debido a la ausencia de las arteriolas colaterales (por ejemplo, Balb / c), se observa arterialización capilar 10. Arterialización capilar se detecta por el aumento de los diámetros y el desarrollo de α-actina de músculo liso reactividad. En segundo lugar, la estimulación eléctrica funcional del músculo conduce a la vasodilatación en las arteriolas terminales de la spinotrapezinosotros (Figura 3B).

Protocol

1. RSS Spinotrapezius Ligadura Arteria Cirugía

  1. Se anestesia el ratón por inyección intraperitoneal. En una jeringa de 0,5 ml, formular: 0,06 ml de 100 mg / ml de ketamina
    0,03 ml de 20,0 mg / ml de xilazina
    0,01 ml de 0,4 mg / ml de atropina
    0,30 ml de solución salina 0,9%.
    Dosis: 0,01 * ml por gramo de peso corporal, ip

* Variable en dosis cepa de ratón y de valores, los ajustes necesarios para la recuperación del ratón está dentro de una hora de inducción.

  1. Aplique ungüento oftálmico estándar para evitar la desecación corneal.
  2. Eliminar el pelo de la parte posterior usando las podadoras recorte, seguido de breve aplicación de la crema depilatoria.
  3. Desinfectar el campo quirúrgico con clorhexidina o povidona yodada. Alternate povidona-yodo con etanol tres veces, terminando con povidona-yodo.
  4. Transferir el ratón hacia la superficie de trabajo previamente preparado quirúrgica, con el cojín de calefacción y campo estérilen su lugar.
  5. Crear una incisión lineal (3-5 mm) a través de la piel dorsal de aproximadamente 5 mm caudal a la prominencia ósea de la escápula con unas tijeras y pinzas iris patrón estándar (por ejemplo, FST, 11271-30) por tenting el tejido y corte paralelo a la columna vertebral. El sitio de la incisión de destino pueden ser identificadas por visualización transdérmica de la almohadilla de grasa dorsal si lo permite la pigmentación de la piel; cortado en el borde caudal de la almohadilla de grasa. Expandir la incisión, según sea necesario, y se extienden a través de capas de la piel secundarias utilizando tijeras resorte.
    1. Nota anatómica - El músculo spinotrapezius encuentra dorsalmente y se extiende desde T4 a L3 a lo largo de cada lado de la columna vertebral. El borde anterior se extiende lateralmente hasta aproximadamente el omóplato. El músculo se estrecha en la dirección caudal de modo que el borde más posterior se encuentra medial al borde anterior, y puede poner al ras con la columna vertebral. Dos almohadillas de grasa son también importante tener en cuenta, por el que se directamente dorsal y ventral de los spinotrapeziusmúsculo hacia la mitad del cráneo.
    2. La inflamación debida a la incisión se ha demostrado no tener ningún efecto sobre la respuesta de la remodelación vascular, como la ligadura de cirugía simulada no mostraron ningún cambio en la remodelación de la vasculatura spinotrapezius. Dos factores espaciales contribuyen a este resultado. En primer lugar de la incisión se elimina por 5 mm en la dirección craneal de la región de interés en la que típicamente la respuesta vascular en el músculo examinado. Además, el sitio de la incisión en la piel dorsal se separa del sitio de ligadura de los vasos por una almohadilla ventral grasa que se encuentra en la parte superior de la tercera craneal del músculo spinotrapezius.
  6. Lavar la herida con solución de Ringer caliente para evitar la desecación del músculo. Aplicación de los vasodilatadores tales como la papaverina ayudará en la visualización de la arteria diana para la ligación.
  7. Bajo un microscopio de disección, utilice pinzas para mitigar diseccionar y separar (pero no eliminar) el dorsal blanca almohadilla de grasa de la musc subyacenteular tejido con el fin de visualizar la vasculatura a medida que entra y sale de la spinotrapezius en su borde lateral.
  8. Localizar la arteria objetivo, que junto con uno o dos pares de venas, pasa a través de la almohadilla de grasa que es ventral al spinotrapezius en su camino en el borde lateral del músculo. Esta arteria alimenta una parte sustancial de la mitad caudal del músculo, que se puede confirmar mediante la reflexión y reemplazando el músculo para observar el trayecto de la arteria dentro del músculo. La ubicación de destino para la ligadura es el segmento de la arteria que sale de la almohadilla de grasa ventral y entrar en el músculo, y es bastante accesible en esta región. El par arteria-vena puede necesitar ser suavemente separadas de la almohadilla de grasa ventral en esta región. Tenga en cuenta que la spinotrapezius es alimentado por múltiples pares de vena arteria, incluyendo los vasos que atraviesan tanto las almohadillas de grasa dorsal y ventral. Tenga cuidado de no alterar estos vasos.
    1. Indicadores múltiples pueden ser utilizados para distinguir la arteriade la vena. Uno de los mejores métodos es suavemente obstruir el flujo de sangre con la microsonda y moverse aguas arriba lejos del músculo; flujo no se reanudará en la arteria hasta que la obstrucción se libera. El color también se puede utilizar, como paredes de las venas contienen una vaina blanquecina de tejido conectivo que carecen de las arterias. Además, se puede considerar el diámetro antes de la aplicación de vasodilatador como venas son típicamente más grandes en tamaño.
  9. La arteria se encuentra típicamente en las proximidades de su vena emparejado, el uso de una disección roma con una microsonda y # 5 fórceps para aislar un segmento de aproximadamente 5 mm, haciendo pasar la microsonda detrás de la arteria, y con la punta para hacer un hueco más amplio en el natural hendidura entre la arteria y la vena. Este es el espacio a través del cual se realizará la sutura enhebrada.
  10. Uso de 10-0 sutura de un solo hilo y aguja lugar titular de una ligadura alrededor de la arteria de alimentación (~ 70 m de diámetro) hacia el extremo proximal del segmento de disección usando un nudo de cirujano. Place una ligadura adicional hacia el extremo distal del segmento de arteria disecada, con una separación suficiente entre las ligaduras para permitir la sección de la arteria.
    1. La pequeña escala asociada a la arteria de alimentación spinotrapezius conduce a una mayor dificultad quirúrgica, en comparación con la ligadura de un vaso más grande tal como la arteria femoral. Cirujanos sin experiencia en particular que tienen altas tasas de avulsión, hemorragia accidental, y otras complicaciones quirúrgicas. De especial preocupación es la dificultad de identificar y cortando la arteria incoloro después de flujo ha sido impedida justo antes de cortar. Por estas razones, colocando ligaduras 2 se recomienda para quienes no están acostumbrados al procedimiento, ya que el cirujano tiene una guía visual en la localización donde para seccionar la arteria, así como una confirmación del corte con la separación fácilmente observable de los 2 ligaduras. Sin embargo, un cirujano más experimentado puede encontrar una ligadura sola suficiente, siempre y cuando sean capaces de claridadidentificar y cortar las arterias corriente abajo de la ligadura. Mientras que esta técnica reduce el riesgo de mellar involuntariamente un vaso cercano con la ligadura de sutura fuerte, no está exento de inconvenientes, incluyendo la dificultad mayor en la confirmación de la arteria se cortó transversalmente.
  11. Verificar la ligadura mediante la observación de la disminución de flujo de sangre (obstruida columna RBC) aguas abajo del sitio de la ligadura (es decir, hacia el músculo).
  12. Utilizando unas tijeras de disección seccionar la arteria ligado, entre las dos ligaduras. Si sólo uno de ligadura se colocó (11a), se cortó con cuidado extremo en la dirección de aguas abajo.
  13. Cargado con fármaco llanura de película (1 mm) se puede colocar aguas abajo (caudalmente) como parte del procedimiento experimental.
  14. Cambiar la posición de la fascia y el tejido adiposo desplazada a su orientación original.
  15. Cierre la incisión de la piel con 8-0 suturas no reabsorbibles. A continuación, coloque el ratón en una jaula de recuperación climatizada preparada bajo observación y administrar un apapropiados analgésico tal como bupivacaína, 0.02-0.05 ml 0,25% infiltración local.

2. Microscopía intravital Spinotrapezius, in situ

  1. Se anestesia el ratón en una cámara de inducción con isoflurano 3-4% vaporizado en 100% de oxígeno a una velocidad de flujo de 3-4 L · min -1.
    1. El uso de anestesia inhalante es preferible para las mediciones funcionales porque hay una menor depresión cardiovascular que con anestésicos inyectables. Si la anestesia inhalante en no disponibles, de acción prolongada anestésicos inyectables, tales como sodio pentobarbital se prefieren para evitar repetir las inyecciones una vez que el animal ha sido colocado.
  2. Una vez anestesiadas, continuamente entregar isoflurano a través de una mascarilla de anestesia (cono de nariz aka) en concentraciones de mantenimiento (generalmente ~ 2%) y la tasa de flujo de 0,5-1 L -1 · min.
    1. Ratones predominantemente ventilar a través de sus fosas nasales, por lo que es necsario para cubrir su nariz con el diafragma máscara de anestesia.
  3. Si es necesario, quitar el pelo de la parte posterior usando las podadoras recorte y la crema depilatoria.
  4. Transportar el animal a la almohadilla de calor.
    1. Es importante mantener los ratones en un estado euthermic para evitar la vasoconstricción inducida por frío; esto se puede lograr a través de las lámparas, de circulación de agua almohadillas de calor, apto para microondas calienta almohadillas, etc
  5. Insertar la sonda de temperatura rectal y establecer termo-controlador a 35 ° C.
  6. Hacer una incisión en la piel en el extremo caudal de los spinotrapezius utilizando tijeras iris y pinzas estándar del patrón.
  7. Extienda la incisión cranealmente a la almohadilla de grasa, la creación de una incisión de herradura, y cubrir el colgajo de piel con una envoltura de plástico para evitar la desecación.
  8. Blunt disecar el tejido conectivo subcutáneo con pinzas y tijeras de primavera para maximizar la visibilidad.
  9. Coloque los electrodos estimulantes como toge cercather como sea posible, para minimizar el tamaño de la corriente de campo, y la posición en el extremo caudal del músculo expuesto justo lateral a la columna vertebral.
  10. Lleve a cabo una estimulación de prueba para confirmar la colocación de electrodos utilizando un sistema de adquisición de datos electrodo, aislador de estímulo del electrodo, y el controlador de ordenador, con ondas cuadradas de 200 microsegundos de duración, 2 mA amplitud, entregada a 1 Hz.
  11. Coloque una envoltura de plástico sobre el músculo expuesto para evitar la desecación.
  12. Empezar a cronometrar un periodo de 30 minutos durante el cual diámetros de los vasos se equilibre.
  13. Coloque el microscopio intravital sobre el músculo spinotrapezius para ver la arquitectura vascular.
    1. Si se utiliza un lente de inmersión, coloque una gota de PBS entre el objetivo y la envoltura de plástico.
  14. Comenzando por encima de la arteriola principal (el recipiente más grande visible), la etapa de manipular en el plano XY para localizar el vaso de interés.
    1. Visualización pequeña arterioles con microscopía de luz reflejada requiere mayor contraste que proporciona la columna de glóbulos rojos. Usamos principalmente una corriente lateral de campo oscuro microscopio de imagen para mejorar el contraste microvascular, pero el contraste también se puede mejorar con un microscopio de luz reflejada fluorescente después de la inyección intravenosa de un alto peso molecular fluorescente dextrano.
  15. Después de la equilibración 30-min, capturar una imagen / vídeo del vaso de interés.
  16. Estimular el músculo con ondas cuadradas de 200 microsegundos duración, amplitud 2 mA, entregado en 8 Hz, durante 90 segundos, como se describe anteriormente.
  17. Capturar otra estimulación imagen / vídeo inmediatamente después y continuar para capturar cada minuto hasta buque ha vuelto al diámetro de reposo, ~ 10 min.
  18. Repetir los pasos 6-18 utilizando el músculo contralateral.
  19. El análisis de datos se puede realizar en tiempo real con pinzas de vídeo o fuera de línea con el software de análisis de imagen.
  20. Sacrificar al ratón seguirING IACUC protocolo.

3. Cosecha de tejidos Spinotrapezius y fijación

  1. Anestesiar los ratones por inyección intraperitoneal, la formulación como en la etapa de ligación Spinotrapezius RSS Arteria 1.
  2. Hacer una incisión de varios milímetros craneales a la prominencia ósea del omóplato del ratón usando tijeras iris y pinzas estándar del patrón. Expandir la incisión lateralmente y luego caudalmente en ambos lados.
  3. Suelte la piel dorsal del torso suavemente reflejando la piel y cortar la fascia superficial.
  4. Use disección roma para eliminar el tejido adiposo dorsal usando fórceps estándar y, a continuación reflejan el músculo y de manera similar diseccionar tejido adiposo ventral.
  5. Retire la placa que cubre el músculo utilizando pinzas y tijeras de primavera. Este paso puede ser difícil y consumir mucho tiempo, pero es importante para mejorar la tinción de inmunofluorescencia y de imagen. Manteniendo el tejido hidratado puede facilitar la extracción de la fascia.
  6. Localizarel borde lateral del músculo, y el uso de una disección roma para separar el músculo spinotrapezius de la almohadilla de grasa que se encuentra ventral a la misma.
  7. Continuar la disección roma en una dirección craneal a caudal. Tenga en cuenta que varios vasos sanguíneos entrar y salir de esta superficie ventral del músculo; perfusión si es necesario, se debe realizar antes de seccionar estos vasos. Tenga en cuenta también que en la mitad caudal del músculo, sus insertos borde lateral en el músculo acostado ventral a la misma. Algunos de corte puede ser requerido a lo largo de esta frontera para definir completamente y liberar el borde.
  8. Impuestos Especiales del músculo spinotrapezius. Para hacer esto:
    1. Libre el borde lateral del músculo como se ha descrito anteriormente.
    2. Cortar transversalmente a través de medida más craneal del músculo.
    3. Corte a lo largo del borde medial (a lo largo de la columna vertebral), en el plano sagital.
  9. Repita los pasos del procedimiento de 4-9 sobre el músculo contralateral, y luego sacrificar al mouse por un método aprobado IACUC.
  10. Fijar los tejidos sobre portaobjetos de vidrio recubiertos de gelatina por inmersión en metanol frío (4 ° C) o en un 4% de paraformaldehído / solución de agua desionizada a temperatura ambiente durante 20 min.
    1. Alternativamente, la fijación de la perfusión puede ser empleado. Antes del paso 2, realizar una toracotomía, hacer una incisión en la aurícula derecha, y la vasculatura perfundir con 5 ml de 1 × Tris-solución salina tamponada con 0,1 mM CaCl 2 y 2% de heparina a través del ventrículo izquierdo, seguido por 5 ml de 4 % de paraformaldehído para la fijación recipiente, y, finalmente, 5 ml de 1 × Tris-solución salina tamponada con 0,1 mM de CaCl 2 7.
  11. Inmediatamente posterior a la fijación, se lava la muestra cuatro veces durante 20 minutos cada uno. 0,01 M usando tampón fosfato salino (PBS) con 0,1% de saponina

Representative Results

Una vista quirúrgica de la arteria principal que alimenta el músculo spinotrapezius que sufre de ligación se muestra en la Figura 1, con etiquetas que indiquen las áreas de interés. Una imagen confocal ejemplo de la región recogieron y se inmunotiñeron de músculo situado directamente aguas abajo de la arteria se ligó una semana después de la ligadura se muestra en la Figura 2A. Agrandamiento de las arteriolas colaterales que contienen músculo liso alfa-actina de músculo liso de las células que expresan (rojo) muestran tortuosidad característica después de la ligadura. Tortuosidad buque, informa como la proporción entre la longitud del recipiente de ruta y la distancia de cable (es decir, la línea que se extiende a través de los extremos de los vasos mismo camino), en el músculo ligado (derecha) se ha mejorado con respecto a músculo contralateral no ligado (Figura 2B, n = 8) . Figura 3 muestra los resultados de un estudio piloto en el que se midió la terminal de vasodilatación arteriolar funcional mediante microscopía intravital. Como era de esperar, arteriolar di ámetro aumenta significativamente después de la contracción muscular eléctrica estimulación inducida.

Figura 1
Figura 1. Campo quirúrgico de músculo refleja spinotrapezius y la arteria de alimentación. La arteria de alimentación se ligó en los dos lugares indicados por A0. Entre estas ligaduras y después de la obstrucción de flujo de sangre, la arteria se secciona en el sitio indicado por A. El segmento objetivo de las transiciones de la arteria ventral de la almohadilla de grasa, se indica por C, en el músculo spinotrapezius, esbozado por D, en el lugar indicado con la flecha de dirección de flujo B. se indica con trazos flecha E.

ghres.jpg "/>
Figura 2. Imagen confocal de red spinotrapezius microvascular del músculo para estudio piloto de tortuosidad. (A) recogidos y músculo entero montado se inmunotiñó para músculo liso alfa-actina y formado la imagen mediante microscopía confocal. El campo de visión se muestra la región del músculo que se encuentra directamente ligado aguas abajo de la arteriola 1 semana después de la ligadura. Vasos tortuosos son evidentes en el músculo como resultado de la unión (B) los resultados del estudio piloto muestran significativamente mayor (p = 0,035; 1 Estudiante de cola de la t-test). Tortuosidad exhibido por microvasos en el músculo ligado medida por la eslora del barco camino a relación de la distancia para un cable de prueba de ratones C57BL / 6 (n = 8) en comparación con el control contralateral.

Figura 3
Figure 3. Imagen de microscopía intravital de la vasodilatación funcional en las arteriolas spinotrapezius, in vivo. (A) microfotografías representativas de las arteriolas terminales spinotrapezius en reposo (izquierda) e inmediatamente después del cese de la contracción muscular 8 Hz (derecha). (B) Terminal diámetro arteriolar en reposo ( 8,5 ± 0,5 m, a la izquierda) e inmediatamente después (11 ± 1 m, centro) 90 seg de la contracción muscular, lo que aumenta significativamente diámetro arteriolar (p = 0,032; 1-cola prueba t pareada) en ratones Balb / C (n = 6). Variación porcentual indicado (derecha).

Discussion

El modelo murino spinotrapezius ligadura aquí se presenta es un modelo efectivo de pequeños animales para estudiar las adaptaciones funcionales y estructurales que resultan de una oclusión arterial. Este modelo es complementario al modelo de isquemia ampliamente utilizado miembro posterior 4, en que proporciona una vista de músculo entero de redes microvasculares intactas con alta resolución espacial. Además, dado que este músculo se encuentra justo debajo de la piel dorsal, que es accesible para formación de imágenes en serie con microscopía intravital, y para administración local de fármacos a través de superfusión o implantación de película delgada 2. Estas características lo convierten en un modelo atractivo de pequeños animales para estudiar los efectos de las nuevas dianas terapéuticas en el remodelado vascular y vasodilatación funcional después de la oclusión arterial.

Tenga en cuenta que se debe tener precaución cuando se comparan los datos obtenidos en el modelo de la ligadura spinotrapezius a los datos adquiridos en el modelo de la ligadura patas traseras debido a varios d claveL as diferencias. En primer lugar, los músculos spinotrapezius se están estabilizando los músculos, y se diferencian de los músculos de las piernas en términos de función y distribución del tipo de fibra. Nuestro grupo ha demostrado que la ligadura arteriolar en el músculo spinotrapezius crea hipoxia menor o insignificante en cepas con bien desarrolladas redes colaterales arteriolares, en comparación con la hipoxia observada en la pata trasera después de la ligadura de la arteria femoral en el modelo de extremidades traseras 1,8 - 10. También hemos demostrado que el modelo de ligadura spinotrapezius produce una respuesta diferente remodelación en ratones Balb / c en comparación con ratones C57BL / 6, con ratones Balb / c remodelación redes por colateralización capilar y remodelación C57bl / 6 por la ampliación de las actuales conexiones arteriolares 3. Hay un paralelo interesante entre estas observaciones y las realizadas en modelos de ligadura del miembro posterior, en el que ratones Balb / c experimentar una recuperación de la perfusión prolongada después de la ligadura en comparación con ratones C57BL / 6 9,11,12 </ Sup>. En otros modelos de isquemia tisular, la edad del ratón género 13 14 y la presencia de la enfermedad 15 también afectar las respuestas de los tejidos a la oclusión arteriolar, aunque todavía no hemos probado estos predictores en el modelo de la ligadura spinotrapezius.

En segundo lugar, el tamaño de la arteria que se ligó en el modelo spinotrapezius es sustancialmente menor que la arteria femoral, y por lo tanto, la ligadura impacta un volumen de tejido más pequeño que es más aguas abajo, es decir, a un nivel inferior del árbol circulatorio, en el spinotrapezius en comparación con la pata trasera 3. Por lo tanto, la diferencia anatómica en la ubicación de la ligadura en estos dos modelos se debe considerar cuando se comparan las respectivas respuestas fisiológicas (por ejemplo, la remodelación vascular) para esta intervención.

En tercer lugar, la delgadez de las spinotrapezius puede permitir que el oxígeno alcance la porción unperfused del tejido de la vecinatejido, en comparación con la isquemia y la hipoxia combinada en el modelo de extremidades posteriores como se señaló anteriormente 3. En cuarto lugar, la recuperación del flujo a la porción de aguas abajo spinotrapezius de la ligadura es más rápido que en la ligadura de las extremidades traseras. El modelo de ligadura spinotrapezius es un modelo crónico único y no debe ser confundido con otros modelos de oclusión arterial transitoria o modelos de lesión por isquemia reperfusión. Consideramos que es posible la adaptación de este modelo para acomodar estos tipos de condiciones, pero esto está fuera del ámbito de aplicación de trabajo que se presenta en este documento. Por último, advertimos en contra de relación directa con las observaciones preclínicas en este modelo a las manifestaciones clínicas de la enfermedad isquémica en los seres humanos, especialmente cuando se utilizan joven y por lo demás ratones sanos y debido a las limitaciones inherentes fisiológicos como la frecuencia cardíaca superior 5. No obstante, consideramos que este nuevo modelo como una herramienta valiosa para el descubrimiento de los mecanismos básicos de las respuestas tisulares a la ligadura y la identificación del potencialpéuticas objetivos en un entorno en vivo.

Además de las notas quirúrgicos proporcionados en el procedimiento de ligadura de la arteria de alimentación spinotrapezius (nota anatómica (6a), distinguiendo la arteria de la vena (9a), y el uso de una ligadura única (11a)), algunos otros aspectos de la prestación procedimiento desde discusión.

En primer lugar, la incisión inicial realizada por la frontera almohadilla grasa dorsal (o varios mm caudal de la escápula, si la visualización transdérmico no es posible) está muy bien hecho tan pequeño como el cirujano se sienta cómodo, y se expandió durante el procedimiento si es necesario. Este método minimiza la sutura necesaria para cerrar la incisión, lo cual es conveniente para el cirujano, reduce el tiempo de procedimiento, y es también menos irritante para el animal durante la recuperación. Alternativamente, una incisión en la piel más grande puede ser apropiado de acuerdo con las preferencias del cirujano, ya que el músculo puede ser más fácil de localizar con un campo expandido. En este caso, la incisión puedebeneficiarse de una forma de herradura con una cara medial abierta para permitir el plegado hacia la columna. Al hacer la incisión en la piel y que se extiende a través de las capas de la piel secundarias, si un buque de superficie está dañado y causa hemorragia, aplicar una ligera presión con una gasa estéril y proporcionar tiempo para la hemostasia.

También de la nota, es importante para manejar el tejido con un mínimo de fuerza, y siempre que sea posible mantener con fórceps más cerca de borde lateral del músculo y lejos de la zona isquémica previsto. Esta práctica ayuda a evitar la lesión por aplastamiento, que puede conducir a otras respuestas tisulares inflamatorias mediadas que pueden confundir la respuesta de remodelado vascular provocada por la ligadura arterial.

En conclusión, hemos demostrado el uso de la spinotrapezius músculo murino como un modelo quirúrgico para examinar las respuestas vasculares y el tejido de la ligadura de las arteriolas. Este modelo es adecuado para la evaluación intravital de cambios vasculares (porejemplo, la vasodilatación funcional), y para la evaluación ex vivo de los cambios vasculares (por ejemplo, formación de imágenes de inmunofluorescencia y la cuantificación de las redes vasculares). Ambos estudios preclínicos y clínicos han demostrado que la respuesta de un individuo a la obstrucción arteriolar (por ejemplo, a través de la ligadura en los ratones o de placas ateroscleróticas en los seres humanos) depende de su edad la presencia o ausencia de la enfermedad (por ejemplo, diabetes mellitus) el diámetro de la arteria obstruida , la composición genética del individuo, y la demanda metabólica del tejido 11-15. Los modelos murinos, como la que se presenta aquí, aprovechar el investigador de las diferencias cepa específica anatómicos y genéticos y fenotipos específicos de la enfermedad, lo que facilita la investigación en estas complejas relaciones.

Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto financieros.

Acknowledgments

Reconocemos Kevin Macleod para el uso creativo de su música con licencia commons en el video asociado, incluyendo (en orden de aparición) su "sala del aeropuerto," pistas "Fondo de pantalla" y "Melodrama tarde". También queremos agradecer a Ndubisi Okeke y Torstrick Federico por su ayuda en el video la cirugía.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Iris scissors FST 14090-09 Type: Tool
Size 7 forceps FST 11271-30 Type: Tool
Size 5 forceps FST 11251-20 Type: Tool
Spring scissors Roboz RS5671 Type: Tool
Microprobe FST 10140-03 Type: Tool
May be substituted with straight probe
Needle holder FST 12500-12 Type: Tool
Induction chamber JD Medical Dist. Co., Inc. IC-1086 Type: Equipment
Eye Gel Dechra NDC 17033-211-38 Type: Reagent
Heat pad FST 21060-01 Type: Equipment
Rectal temperature probe FST 21060-01 Type: Equipment
Stimulating electrodes FHC UEWSGCSE0N1M Type: Equipment
Artisan's Polymer Clay Polyform N/A Type: Equipment
PowerLab data acquisition system ADInstruments ML 845 Type: Equipment
Stimulus isolator ADInstruments FE 180 Type: Equipment
LabChart ADInstruments ML S060/7 Type: Software
Reflected-light fluorescent microscope Olympus BFXM Type: Equipment
High MW fluorescent dextran Sigma FD250S-100MG Type: Reagent
Video calipers Colorado Video 308 Type: Equipment
Automated Vascular Analysis (AVA) Microvision Medical Type: Software
Anti-αSMA Conjugated Fluorophore Sigma 1A4-Cy3 Type: Reagent
Clonal, 1:100
Fluorescent Microscope Olympus BFXM Type: Equipment
High-molecular weight fluorescent dextran Sigma FD250S-100MG Type: Reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bailey, A. M., O'Neill, T. J., Morris, C. E., Peirce, S. M. Arteriolar Remodeling Following Ischemic Injury Extends from Capillary to Large Arteriole in the Microcirculation. Microcirculation. 15, 389-404 (2010).
  2. Bruce, A. C., Peirce, S. M. Exogenous Thrombin Delivery Promotes Collateral Capillary Arterialization and Tissue Reperfusion in the Murine Spinotrapezius Muscle Ischemia Model. Microcirculation. 19, 143-154 (2012).
  3. Mac Gabhann, F., Peirce, S. M. Collateral capillary arterialization following arteriolar ligation in murine skeletal muscle. Microcirculation. 17, 333-347 (2010).
  4. Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine Model of Hindlimb Ischemia. J. Vis. Exp. (23), e1035 (2009).
  5. Madeddu, P., et al. Murine models of myocardial and limb ischemia: diagnostic end-points and relevance to clinical problems. Vascul. Pharmacol. 45, 281-301 (2006).
  6. Cardinal, T. R., Kurjiaka, D. T., Hoying, J. B. Chronic hindlimb ischemia impairs functional vasodilation and vascular reactivity in mouse feed arteries. Front. Physio. 2, 91 (2011).
  7. Sefcik, L. S., et al. Selective Activation of Sphingosine 1-Phosphate Receptors 1 and 3 Promotes Local Microvascular Network Growth. Tissue Eng. Part A. 17, 617-629 (2011).
  8. Deindl, E., et al. Role of Ischemia and of Hypoxia-Inducible Genes in Arteriogenesis After Femoral Artery Occlusion in the Rabbit. Circulation Research. 89, 779-786 (2001).
  9. Chalothorn, D., Zhang, H., Smith, J. E., Edwards, J. C., Faber, J. E. Chloride Intracellular Channel-4 Is a Determinant of Native Collateral Formation in Skeletal Muscle and Brain. Circulation Research. 105, 89-98 (2009).
  10. Scholz, D., et al. Contribution of Arteriogenesis and Angiogenesis to Postocclusive Hindlimb Perfusion in Mice. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 775-787 (2002).
  11. McClung, J. M., et al. Skeletal muscle-specific genetic determinants contribute to the differential strain-dependent effects of hindlimb ischemia in mice. Am. J. Pathol. 180, 2156-2169 (2012).
  12. Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117, 1207-1215 (2008).
  13. Faber, J. E., et al. Aging causes collateral rarefaction and increased severity of ischemic injury in multiple tissues. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31, 1748-1756 (2011).
  14. Peng, X., et al. Gender differences affect blood flow recovery in a mouse model of hindlimb ischemia. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 300, 2027-2034 (2011).
  15. Li, Y., Guan, H., Hazarika, S., Liu, C., Annex, B. H. Impaired angiogenesis following hind-limb ischemia in diabetes mellitus mice. Chin. Med. Sci. J. 22, 232-237 (2007).
Modelo murino Spinotrapezius para evaluar el impacto de la ligadura arteriolar en la función microvascular y Remodelación
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guendel, A. M., Martin, K. S., Cutts, J., Foley, P. L., Bailey, A. M., Mac Gabhann, F., Cardinal, T. R., Peirce, S. M. Murine Spinotrapezius Model to Assess the Impact of Arteriolar Ligation on Microvascular Function and Remodeling. J. Vis. Exp. (73), e50218, doi:10.3791/50218 (2013).More

Guendel, A. M., Martin, K. S., Cutts, J., Foley, P. L., Bailey, A. M., Mac Gabhann, F., Cardinal, T. R., Peirce, S. M. Murine Spinotrapezius Model to Assess the Impact of Arteriolar Ligation on Microvascular Function and Remodeling. J. Vis. Exp. (73), e50218, doi:10.3791/50218 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter