Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Mikrovasküler Fonksiyon ve Tadilat üzerine Arteriolar Ligasyonu etkisini değerlendirmek için mürin Spinotrapezius Modeli

doi: 10.3791/50218 Published: March 3, 2013
* These authors contributed equally

Summary

Biz bir adım-adım prosedürü ve gerekli enstrümantasyon açıklaması dahil murin spinotrapezius kas bir roman arter ligasyonu modeli göstermektedir. Biz cerrahi ve intravital ve konfokal mikroskopi kullanılarak vasküler ağ şekillenmesi ve fonksiyonel vazodilatasyon ile ilgili, sonuç ölçümleri açıklayacağız.

Abstract

Murin spinotrapezius T3 L4 uzanan ince, yüzeysel iskelet destek kas, ve dorsal cilt insizyonu yoluyla kolayca ulaşılabilir. Eşsiz anatomisi iskemik yaralanma ve sonraki mikrovasküler remodeling soruşturma spinotrapezius kullanışlı hale getirir. Burada, bizim araştırma ekibi tarafından geliştirilen ve daha önce 1-3 yayımlandı murin spinotrapezius kasında bir arteriolar ligasyon modeli göstermektedir. Gibi Balb / c fare gibi bazı hassas fare suşları için, bu ligasyon ameliyatı güvenilir iskelet kası iskemi oluşturur ve revaskülarizasyon teşvik tedavileri araştırmak için bir platform olarak hizmet vermektedir. Ölçme ve değerlendirme yöntemleri de intravital ve konfokal mikroskop kullanımı dahil, gösterilmiştir. Spinotrapezius de onun erişilebilirlik (yüzeyel dorsal anatomi) ve göreli inceliği (60-200 mikron) nedeniyle bu tür görüntüleme çalışmaları için uygundur. Spinotrapezius kas kolaylaştırılması, cepheden monte edilebilirhistolojik kesit olmadan bütün kas mikrovasküler ağların görüntüleme. Bir işlevsel vazodilatasyon prosedür takip ölçümleri elde etmek için intravital mikroskobu kullanılmasını tarif eder ve özellikle, kas kasılma bir sonucu olarak arterilar çapı artar. Biz de dokuları ve sabitleme için prosedürler, çalışmalar ve konfokal mikroskop kullanımı immünboyama için gerekli bir öncül göstermektedir.

Introduction

Kronik iskemi Hayvan modelleri, periferik arter hastalığı, koroner arter hastalığı ve serebrovasküler hastalık gibi iskemik hastalıkların patofizyolojisi araştırmak için değerli araçlardır. Kemirgenlerde, insanlarda olduğu gibi, arteriyel oklüzyon arteriogenesis ve anjiyojenez dahil olmak üzere, damar ağının yapısal yeniden yol açar. Sağlıklı ve genç hastalarda bu biçimlenme iskemiye bağlı yaralanma doku kurtarmak için yeterli olabilir, ancak diyabet gibi komorbiditeler ciddi biçimlenme ve kurtarma bozabilir. Vasküler remodeling olayların altında yatan mekanizmaların anlaşılması bu endojen revaskülarizasyon işlemlerini teşvik tedavilerin geliştirilmesi için esastır.

Şu anda, bacak femoral arter ligasyonu veya rezeksiyon 4,5 küçük hayvanlar kronik iskemiye bağlı vasküler yeniden incelemek için standart bir tekniktir. Çapı, bağlantı ve reaktivite AnaliziBağlanmış femoral arter damar ağı alt-oluşturan mikrodamar kas kalınlığı nedeniyle güçtür. Bu istikrar dorsal kas 1'de yanal yem arterin tek taraflı ligasyonu: Biz fare spinotrapezius kasında bir arteriolar ligasyonu modeli geliştirdik. Nispeten ince spinotrapezius (60-200 mikron) tüm doku boyunca vasküler remodeling olayların ayrıntılı bir incelemesini sağlayan tek hücreli çözünürlüğü ile tüm ağ topolojisi değerlendirilmesi için en face immun mükellef olduğunu. Spinotrapezius da yüzeysel ve erişilebilir ve böylece damarlar kolayca vasküler reaktivite üzerinde şekillenmesi ve arterioler ligasyon etkisinin etkin karakterizasyonu için, intravital mikroskop ile gözlemlenebilir.

Bu yazıda ayrıntılı olarak açıklamak ve fare spinotrapezius arterioler ligasyonu modeli göstermektedir. Vivo ve ex vivo bana ikideğerlendirme cerrahi ve thods iskemik durumlar altında 6 bozulduğu görülmüştür fonksiyonel vazodilatasyon ve bütün kas mikrovasküler ağların immünofloresan görüntüleme ölçüm dahil olmak üzere, tarif edilmektedir. Ayrıca modelin yararlılığını ortaya iki ayrı pilot çalışmaların sonuçları içermektedir. Öncelikle, biz C57BL / 6 fareler (Şekil 2B) damar kıvrımlarında istatistiksel olarak anlamlı bir artış teşvik etmek için arteryel ligasyon modeli kullanılmıştır. Arteriyol teminatlar içinde arteriogenesis sırasında eğrilik artar. Diğer fare suşları ise, bu teminat arteriyoller yokluğunda (örneğin Balb / c) nedeniyle iskemi karşı daha savunmasız olan, kılcal arterleştirilmelerine 10 görülmektedir. Kapiler arterleştirilmelerine artan çap ve α-düz kas aktin reaktivite gelişim tarafından tespit edilir. İkincisi, kas fonksiyonel elektriksel stimülasyon spinotrapezi terminal arteriyollerde vazodilatasyona yol açarbize (Şekil 3B).

Protocol

1. Spinotrapezius Yem Arter Ligasyonu Cerrahisi

  1. Intraperitoneal enjeksiyonu ile fare uyuştur. , 0.5 ml şırınga içinde, formüle: 100 mg / ml 0.06 ml ketamin
    20.0 mg / ml, 0.03 ml Xylazine
    0.4 mg / ml, 0.01 ml Atropin
    % 0.9 Saline 0.30 ml.
    Doz: 0.01 ml * gram vücut ağırlığı başına, ip

Fare zorlanma ve stok üzerine * Doz değişken indüksiyon bir saat içinde bu kadar fare kurtarma olduğunu buna göre ayarlayın.

  1. Kornea kuruma önlemek için standart oftalmik merhem uygulayın.
  2. Tüy dökücü krem ​​kısa uygulaması takip kırpma makası kullanarak arka saç çıkarın.
  3. Klorheksidin veya povidon-iyot ile cerrahi alanında dezenfekte edin. Povidon-iyot ile biten etanol üç kez Alternatif povidon-iyot,.
  4. Isıtıcı ped ve steril örtü ile, önceden hazırlanmış cerrahi çalışma yüzeyi fare aktarınyerde.
  5. Tenting ile doku iris makas ve standart desen forseps (örneğin FST, 11271-30) kullanarak ve paralel kesme kürek kemikli öne kaudal yaklaşık 5 mm dorsal deri yoluyla doğrusal bir kesi (3-5 mm) oluşturma omurga. Hedef kesi yeri deri pigmentasyonu veriyorsa dorsal yağ yastığı transdermal görselleştirme tarafından tespit edilebilir; yağ pedinin kaudal sınırında kesti. Gerektiği gibi kesi genişletin ve yay makas kullanılarak sekonder deri katmanları aracılığıyla genişletmek.
    1. Anatomik notu - spinotrapezius kas dorsal yatıyor ve omurganın her iki tarafında L3 T4 uzanır. Ön sınırından yaklaşık omuz bıçak yanal olarak uzanır. Kası en posterior sınır anterior sınırına medial yatıyor ve omurga ile aynı hizada koyabilir böylece kaudal yönde tapers. İki yağ yastıkları spinotrapezius doğrudan dorsal ve ventral döşeme de dikkat etmek önemlidirkranial yarısına doğru kas.
    2. Insizyon nedeniyle iltihap sham ligasyon ameliyatı spinotrapezius vaskülatürün biçimlenme hiçbir değişiklik gösterdiği gibi, vasküler remodeling cevabı üzerinde herhangi bir etkiye sahip olduğu gösterilmiştir. İki mekansal faktörlerin bu sonuca katkıda bulunmaktadır. İlk olarak kesik kas vasküler response tipik olarak incelenmiştir ilgi bölgesi gelen kafatası yönde 5 mm ile uzaklaştırılır. Buna ek olarak, dorsal deri üzerinde kesi spinotrapezius kas kafatası üçüncü tepesinde yer alan bir ventral yağ ped ile damar ligasyon yer ayrılır.
  6. Kas kuruma önlemek için ısıtılmış Ringer solüsyonu ile kesi sulayın. Böyle papaverin gibi vazodilatörlerin Uygulama ligasyonu için hedef arter görselleştirmek yardımcı olacaktır.
  7. Diseksiyon mikroskobu altında yatan musc (kaldırmasını değil ama) teşrih künt ve ayırmak için dorsal beyaz yağ yastığı forseps kullanıngirer ve onun yan kenarında spinotrapezius yapraklar gibi damarsal görselleştirmek amacıyla ular doku.
  8. Bir ya da iki ikili damarları ile birlikte, kas yanal kenarına kendi yolu üzerinde spinotrapezius ventral bir yağ yastığı içinden geçen hedef arter, Yerleştirme. Bu arter yansıtan ve kas içinde arter yol izlemek için kas değiştirilmesi ile teyit edilebilir kas, kuyruk yarım önemli bir kısmını besler. Ligasyon için hedef konumu arter ventral yağ yastığı çıkma ve kas girme segmentinde olduğunu ve bu bölgede oldukça erişilebilir. Arter damar çift yavaşça bu bölgedeki yağ ventral ped ayrılması gerekebilir. Spinotrapezius transvers dorsal ve ventral yağ yastıkları ya o gemiler de dahil olmak üzere, birden fazla arter-ven çiftleri beslenmektedir unutmayın. Bu gemilerin bozmaya dikkat edin.
    1. Çoklu göstergeler arter ayırt etmek için kullanılabilirvenden. En iyi yöntemlerden biri yavaşça mikroprob ile kan akışını engelleyebilir ve kas uzak yukarı taşımak için; tıkanıklık serbest bırakılıncaya kadar ak arter devam etmeyecektir. Ven duvarlarının arterler eksikliği bağ dokusu bir beyazımsı kılıf içerdiğinden Renkli da kullanılabilir. Damarlar genellikle büyük boyutta olduğu gibi Ayrıca, bir vazodilatör uygulamasından önce çapı düşünebilirsiniz.
  9. Arter ile eşleştirilmiş damar yakın olarak, tipik olarak, arter arkasında mikroprob geçen, ve doğal olarak daha geniş bir boşluk sağlamak için ucunu kullanarak, bir mikroprob ve yaklaşık olarak 5 mm kademeli bir izole etmek için 5. forseps ile diseksiyon kullanmak arter ve ven arasındaki yarık. Bu dikiş dişli olacak hangi aracılığıyla boşluğudur.
  10. 10-0 tek iplik dikiş ve iğne tutucu bir yer cerrahın düğüm kullanarak disseke segmentinin proksimal sonuna doğru yem arter (~ 70 mikron çapında) etrafında bir ligasyon kullanma. Plaarter kesisi izin vermek için ligatür arasında yeterli ayırma işlemi ile parçalanmış arter kademeli bir mafsaldan uzak ucuna doğru ce ek bir ligasyon.
    1. Spinotrapezius besleme arter ile ilişkili küçük ölçekte; femoral arter gibi daha büyük bir kap ligasyonu ile karşılaştırıldığında, artan cerrahi zorluk yol açar. Deneyimsiz cerrahlar özellikle avulsiyonu, yanlışlıkla kanama ve diğer cerrahi komplikasyon oranları yüksek olacaktır. Özellikle kaygı belirlenmesi ve akış sadece kesim öncesi engellemiştir sonra renksiz arter kesme güçlüktür. Cerrah arter hem de ligatür 2 arasında kolayca gözlemlenebilir ayırma ile kesilmiş bir onay transeksiyonu için burada yerini görsel bir kılavuz olduğu gibi bu nedenlerden dolayı, 2 ligatür yerleştirilmesi prosedür alışık için tavsiye edilir. Ancak, daha deneyimli bir cerrah sürece onlar açıkça mümkün olduğu gibi, tek bir bağ yeterli bulabilirbelirlemek ve bağ ve arter aşağı kesti. Bu tekniğin istemeden keskin ligasyonu sütür ile yakındaki bir gemi nicklemek riskini azaltır iken, bu arterlerde kesmiş olduğu teyit artan güçlüğü gibi sakıncaları olmadan değildir.
  11. Kan akımının azalmasına (tıkalı RBC sütun) ligasyon sitenin mansap (kas doğru yani) gözlemleyerek ligasyon doğrulayın.
  12. Kullanılması kesme makasları iki bitişik harfler arasında bağlanan arter transect. Sadece tek bir bağ yerleştirilmiş olur (11a) aşağı doğrultuda son derece dikkatli bir kesti.
  13. Düz film yüklü İlaç (1 mm) deneysel işlemin bir parçası olarak (kaudal) aşağı konabilir.
  14. Özgün yönüne yerinden fasya ve adipoz doku konumlandırın.
  15. 8-0 rezorbe olmayanlar sütürler kullanılarak cilt insizyonu kapatın. Sonra gözlem altında hazırlanmış bir ısıtmalı kurtarma kafesteki fare yerleştirin ve ap yönetmekBöyle bupivakain, 0,02-0,05 ml% 0.25 lokal infiltrasyon olarak analjezik de temin.

2. In situ Spinotrapezius intravital Mikroskopi,

  1. % 3-4 izofluran 3-4 L'lik bir akış hızı-dk -1% 100 oksijen, buharlaşmış olan bir indüksiyon odasında fare anestetize.
    1. Enjekte edilebilir anestetiklerin ile daha az kardiyovasküler depresyon olduğundan, uçucu madde anestezi kullanılması, fonksiyonel ölçümleri için tercih edilir. Örneğin sodyum pentobarbital olarak mevcut değildir, uzun etkili enjektabl anestezikler, uçucu madde anestezi hayvan konumlandırılmış edildikten sonra tekrar enjeksiyonları önlemek için tercih edilir ise.
  2. Bir kez anestezi, sürekli bakım konsantrasyonları (genelde ~% 2) ve 0.5-1 L · dk -1 akış hızında bir anestezi maskesi (aka burun konisi) aracılığıyla izofluran teslim.
    1. Fare çoğunlukla kendi burun yoluyla havalandırılması, bu yüzden sadece başka yerde sınıflandırılmamış olanAnestezi maskesi diyafram ile burunlarını kapatmak için Gerekli veri.
  3. Gerekiyorsa, kırpma makası ve tüy dökücü krem ​​kullanarak arkasından saç kaldırmak.
  4. Isı pad hayvan taşıyın.
    1. Soğuk-bağlı vazokonstrüksiyon önlemek için euthermic durumda fareler korumak için önemli olduğunu, bu lambalar aracılığıyla gerçekleştirilebilir, su ısı pedleri dolaşan, mikrodalga yastıkları, vb ısıtır
  5. Rektal ısı probu yerleştirin ve 35 termo-kontrolörü set ° C.
  6. Iris makas ve standart desen forseps kullanarak spinotrapezius en kaudal sonunda cilt kesi olun.
  7. , Yağ yastığı için kraniyale kesi uzatın bir at nalı kesi oluşturma ve kuruma önlemek için plastik wrap ile flep kapsamaktadır.
  8. Görünürlüğünü maksimize etmek için forseps ve yaylı makas ile cilt altı bağ dokusu teşrih Blunt.
  9. Yakın toge gibi uyarıcı elektrotlar yerleştirinmümkün gibi termik olarak, mevcut alanın boyutunu küçültmek ve omurga için sadece yanal maruz kas kuyruk sonunda yerleştirmek için.
  10. 1 Hz teslim 200 μsec süresi, 2 mA amplitüdlü, kare dalgalar ile, bir elektrot veri toplama sistemi, elektrot uyaran izolatör ve bilgisayar denetleyicisi kullanarak elektrot yerleşimini doğrulamak için bir test stimülasyonu gerçekleştirin.
  11. Kuruma önlemek için maruz kası üzerinde plastik wrap yerleştirin.
  12. Damar çapları muvazene alacağı bir 30 dakika süre zamanlama başlayın.
  13. Vasküler mimari görüntülemek için spinotrapezius kası üzerinde intravital mikroskop yerleştirin.
    1. Immersiyon objektif kullanıyorsanız, objektif ve plastik wrap ile PBS bir damla yerleştirin.
  14. Ana arteriyol (büyük damar görünür) Yukarıdaki başlayan faiz gemi bulmak için XY düzleminde sahne işlemek.
    1. Küçük arteriol görselleştirmeyansıyan ışık mikroskobu ile es-kırmızı hücre sütun tarafından sağlanan daha fazla kontrast gerektirir. Biz öncelikle mikrovasküler kontrastı arttırmak için bir yan-akım karanlık alan mikroskobu görüntüleme kullanabilirsiniz, ancak kontrast da yüksek molekül ağırlıklı floresan dekstran intravenöz enjeksiyonundan sonra bir yansıyan ışık floresan mikroskop ile geliştirilebilir.
  15. 30 dakika dengelenme sonra, ilgilenilen damarın bir görüntü / video yakalama.
  16. 90 saniye için 8 Hz, teslim 200 μsec süresi, 2 mA genlik, yukarıda tanımlandığı gibi, bir kare dalgalar ile kas teşvik.
  17. Başka bir görüntü / video hemen sonrası stimülasyon Yakalama ve damar dinlenme çapı dönene kadar her dakika yakalamak için devam ediyor, 10 dk ~.
  18. Kontralateral kas kullanarak adımları 6-18 tekrarlayın.
  19. Veri analizi görüntü analiz yazılımı ile video kaliperler veya off-line ile gerçek zamanlı olarak yapılabilmektedir.
  20. Fareyi takip Euthanizeing IACUC protokolü.

3. Spinotrapezius Doku Hasat ve Fiksasyon

  1. Spinotrapezius Besleme ligasyonu adım 1 'deki gibi formülasyon; intraperitonal enjeksiyon yoluyla fareler anestetize.
  2. Iris makas ve standart desen forseps kullanarak fare kürek kemikli öne kranial bir kesi birkaç milimetre olun. Her iki yanal tarafta kaudal ve ensizyon genişletir.
  3. Cildi nazikçe yansıtan ve yüzeysel fasya keserek dorsal gövdesinden cildi serbest bırakın.
  4. Standart forseps kullanarak dorsal adipoz doku kaldırmak ve sonra kas yansıtacak ve benzer ventral adipoz doku teşrih künt diseksiyon kullanın.
  5. Forseps ve yaylı makas kullanılarak kas örten fasya çıkarın. Bu adım, zor ve zaman alıcı olabilir, ama immünofloresan boyama ve görüntüleme artırmak için önemli olabilir. Doku sulu tutulması fasya kaldırılmasını kolaylaştırabilir.
  6. YerleştirmekLateral kas sınır ve ventral yatıyor yağ yastığı gelen spinotrapezius kas ayırmak için künt diseksiyon kullanabilirsiniz.
  7. Kaudal yönde bir Kranyal künt diseksiyon devam edin. Birçok kan damarları bu durum kas ventral yüzeyi girip terk unutmayın; perfüzyon gerekli ise, bu kapların transecting önce yapılmalıdır. Bu kas kaudal yarısında, lateral sınır ekler ventral yalan kas içine unutmayın. Bazı kesim tamamen kenar tanımlamak ve serbest bırakmak için bu sınır boyunca gerekli olabilir.
  8. Tüketim spinotrapezius kas. Bunu yapmak için:
    1. Serbest yukarıda tarif edildiği gibi kas yanal kenarı.
    2. Kas en kranial ölçüde boyunca enine kesin.
    3. Sagital planda, medial sınır (omurga boyunca) boyunca kesin.
  9. Tekrar prosedürü kontralateral kas 4-9 adımları yineleyin ve sonra m euthanizeBir IACUC onaylanmış yöntemi ile ouse.
  10. Soğutulmuş metanol (4 ° C) ya da 20 dakika için% 4 paraformaldehit / oda sıcaklığında deiyonize su çözeltisi ile daldırma yoluyla jelatin kaplı cam slaytlar üzerine doku düzeltildi.
    1. Alternatif olarak, perfüzyon fiksasyon istihdam edilebilir. 2. adıma önce, 1, 5 ml × 4 5 ml ardından, 0.1 mM CaCl2 ve sol ventrikül ile% 2 heparin ile salin Tris tamponlu ile sağ atrium bir kesi yapmak, bir torakotomi gerçekleştirmek ve perfuse damar % damar tespiti için paraformaldehit ve 1 sonunda 5 ml x 0.1 mM CaCl2 ile 7 Tris-tamponlu salin.
  11. Hemen sonra fiksasyonu, dört kez, 20 dakika boyunca numune yıkama her biri% 0.1 saponin ile, 0.01 M fosfat-tamponlu salin (PBS) ile.

Representative Results

Ligasyon uğrar spinotrapezius kas besleme ana arter bir cerrahi bakış ilgi alanlarını gösteren etiket ile, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Ligasyon Şekil 2A'da gösterilmiştir sonra doğrudan alt-ligate arter bir hafta ile yer kas hasat edilmiş ve immunohistokimyasal bölge bir örnek konfokal görüntü. Düz kas hücreleri (kırmızı) ifade düz kas alfa-aktin içeren Genişletilmiş teminat arteriol ligasyonu sonrası karakteristik kıvrımlarında gösterilecek. Bağlanan kas damar yolu uzunluğu ve kablo mesafesi (yani, aynı geminin yolunu uç noktalarda uzanan çizgi) arasındaki oran olarak bildirilen Gemi kıvrımlarında, (sağ) (n = 8 Şekil 2B) unligated kontralateral kas göre geliştirilmiştir . Şekil 3, kutup vazodilatasyona arteriole fonksiyonel intravital mikroskopi kullanılarak ölçüldüğü bir pilot çalışmanın sonuçlarını gösterir. Beklendiği gibi, Arteriyollerde di Seçilmiş olan disk çapından anlamlı elektriksel stimülasyon ile indüklenen kas kasılması sonrasında artar.

Şekil 1
Şekil 1. Yansıyan spinotrapezius kas ve yem arter Cerrahi alanında. Yem arter A0 ile gösterilen iki noktada bağlandı edilir. Bu bitişik harfler arasında ve kan tıkanması sonra, arter belirtilen sitede, D tarafından ana hatlarıyla, spinotrapezius kas içine, A. C tarafından özetlenen ventral yağ yastığı, gelen arter geçişlerin hedefli segmenti belirtilen sitede ma- ok B. Akış yönü kesik ok E. ile belirtilir ile

ghres.jpg "/>
Şekil 2. Kıvrımlar pilot çalışma için spinotrapezius kas mikrovasküler ağ Konfokal görüntü. (A) Hasat ve tam monte kas konfokal mikroskopi kullanılarak düz kas alfa-aktin ve görüntülü için immunohistokimyasal edildi. Görüş alanına kas bölgesi doğrudan doğruya aşağı bağlanan arteriole 1 hafta sonrası ligasyon yer göstermektedir. Dolambaçlı damar ligasyon sonucu olarak kas belirgindir (B), pilot çalışmanın sonuçları önemli ölçüde (p = 0.035; 1 kuyruklu Student t-testi) artış gösterirler. Eğrilik için damar yol uzunluğu ile ölçülen bağlanan kas içinde kılcal tarafından sergilenen C57BL / 6 fareler bir deneme için kordon mesafe oranı (n = 8), kontralateral kontrol ile karşılaştırılmıştır.

Şekil 3
Figu3. yeniden. In vivo spinotrapezius arteriyollerde fonksiyonel vazodilatasyon intravital mikroskobu görüntüleme. Istirahatte (A) Temsilcisi kalanı (solda) spinotrapezius terminali arteriyollerin fotomikrografı ve derhal 8 Hz kas kasılması (sağda) bırakılmasını takiben. (B) Terminal arteriyol çapı ( 8.5 ± 0.5 mikron, sol) ve hemen ardından (11 ± 1 mikron, orta) belirgin arterioler çapı (artmış kas kontraksiyonu 90 sn, p = 0.032; 1-tailed) Balb / C farelerde t-testi eşleştirilmiş (n = 6). Yüzde değişim (sağ) gösterilir.

Discussion

Burada sunulan murin spinotrapezius ligasyonu modeli arteriyel oklüzyon gelen yapısal ve işlevsel uyarlamalar bu sonucu incelemek için etkin bir küçük hayvan modelidir. Bu model yaygın olarak kullanılan bacak iskemisi modelinde 4 tamamlayıcı olduğunu, bunda yüksek uzaysal çözünürlüğü ile sağlam mikrovasküler ağların bir bütün kas görünümü sağlar. Bu kas sadece dorsal cilt altında yer almaktadır çünkü Ayrıca, bu intravital mikroskopi ile seri görüntüleme ve superfusion veya ince film implantasyon 2 aracılığıyla yerel ilaç dağıtım için erişilebilir. Bu özellikler, arteriyel oklüzyon sonrası vasküler remodeling ve fonksiyonel vazodilatasyon üzerine yeni terapötik hedeflerin etkilerini incelemek için cazip bir küçük hayvan modeli yapmak.

Nedeniyle birkaç anahtar d Bacak ligasyon modeli Elde edilen verilere spinotrapezius ligasyon modeli edinilen verilerin karşılaştırılmasında ki dikkatli kullanılması gerektiğini unutmayınifferences. İlk olarak, spinotrapezius kaslar kasları stabilize edilir ve fonksiyon ve lif türü dağılımı içinde bacak kaslarının farklıdır. Grubumuz önce spinotrapezius kas arterioler ligasyonu gibi bacak modeli 1,8 olarak femoral arter ligasyonu sonrası arka ayak gözlenen hipoksi ile karşılaştırıldığında iyi gelişmiş kollateral arterioler ağları ile suşları daha az veya önemsiz hipoksi oluşturur olduğunu göstermiştir - 10. Ayrıca spinotrapezius ligasyon modelinde, mevcut Arteriyollerde bağlantıları 3 büyümesi yoluyla kılcal kollateralizasyonu ve C57BL / 6 yeniden şekillenmesi ile Balb / c fareleri ağlar ile yeniden C57BL / 6 fareler ile karşılaştırıldığında, Balb / c farelerinde, farklı bir yeniden tepki verdiğini göstermiştir. Bu gözlemlere ve bacak ligasyon modelinde yapılmış olanlar arasında bir ilginç paralel vardır, ki burada Balb / c fareleri C57BL / 6 fareleri ile karşılaştırıldığında 9,11,12 ligasyonu sonrası uzun bir perfüzyon iyileşmektedir </> Sup. Henüz spinotrapezius ligasyon modelinde bu değişkenlerin test edilmiş olmasına rağmen doku iskemisi, fare 13 yaşında cinsiyet 14 ve 15 hastalık varlığı başka modellerinde de, Arteriyollerde oklüzyon için dokular tepkilerini etkileyebilecek.

İkinci olarak, spinotrapezius modelinde ligate edilir arter büyüklüğü femoral arter göre önemli ölçüde daha küçük olan, ve bu nedenle, ligasyon spinotrapezius, dolaşım ağacının daha düşük bir seviyede, yani, daha aşağıda olan daha küçük bir doku hacim etkileri Bacak 3 ile karşılaştırıldığında. Bu müdahale konusu fizyolojik tepkiler (örneğin vasküler remodeling) karşılaştırırken Dolayısıyla, bu iki modelde ligasyon konumda anatomik farklılığı dikkate alınmalıdır.

Üçüncü olarak, spinotrapezius inceliği oksijen komşu doku unperfused kısmı ulaşmak için izin verebilir3, yukarıda belirtildiği gibi, arka ayakların modelinde kombine iskemi ve hipoksi ile karşılaştırıldığında doku. Dördüncü, ligasyon spinotrapezius aşağı kısmına akış kurtarma bacak ligasyon daha hızlıdır. Spinotrapezius ligasyonu modeli eşsiz bir kronik bir modeldir ve iskemi reperfüzyon hasarı geçici arteriyel oklüzyon veya modellerin diğer modelleri ile karıştırılmamalıdır. Bu koşullar, bu tür yerleştirmek için bu model uyum sağlanmasına olanak düşünün, ama bu burada sunulan çalışmalar kapsamı dışındadır. Son olarak, biz genç ve fareler sağlıklı ve böyle yüksek kalp hızı 5 sıra doğal fizyolojik sınırlar nedeniyle kullanarak özellikle doğrudan insanlarda iskemik hastalığın klinik bu modelde ön klinik gözlemler ile karşı dikkatli olun. Bununla birlikte, biz ligasyonu doku yanıtları temel mekanizmalarını ortaya çıkarılması ve potansiyel belirlenmesi için değerli bir araç olarak bu yeni model kabulbir in vivo ortamda rapeutic hedefler.

Spinotrapezius besleme ligasyonu prosedürü (anatomik ven (9a) dan arter ayırt Not (6a), ve bir tek bağ (11a) kullanımı) 'de verilmiştir cerrahi notlar, işlem yararı, birkaç diğer yönleri ek olarak, tartışma.

İlk olarak, dorsal yağ yastığı sınır (ya da transdermal görselleştirme mümkün değilse omuz bıçak kaudal birkaç mm) üzerinde yapılan ilk kesi ideal cerrahın rahat olduğu kadar küçük yapılır ve gerekirse işlem sırasında genişletilir. Bu uygulama, cerrah için uygun insizyon kapatmak için gerekli sütür minimize işlem süresini azaltır ve aynı zamanda kurtarma sırasında hayvana daha az tahriş edicidir. Kas genişletilmiş bir alan ile bulmak daha kolay olabilir çünkü Alternatif olarak, büyük bir cilt kesisi, cerrahın tercihine göre uygun olabilir. Bu durumda, kesik olabiliromurganın doğru katlayarak izin medial açık yüzü ile bir at nalı şeklinde yarar. Cilt insizyonu yapma ve bir yüzey geminin hasar ve kanama neden ise, sekonder deri katmanları boyunca uzanan iken, steril gazlı bez ile hafif basınç uygulayın ve hemostaz için zaman verin.

Ayrıca şunu da unutmayın, bu gerekli minimum kuvvet ile doku işlemek için önemlidir ve mümkün olduğunca yakın kasın lateral sınırı ve uzak amaçlanan iskemik bölgeden forseps ile tutun. Bu uygulama arter ligasyonu ile uyarılmış vasküler remodeling yanıtı yanıltabilecek ek inflamatuar aracılı doku yanıtları yol açabilir ezilme yaralanması, önlemeye yardımcı olur.

Sonuç olarak, Arteriyollerde ligasyon için damar ve doku tepkileri incelenmesi için bir cerrahi örnek olarak murin spinotrapezius kas kullanımını ortaya koymuştur. Bu model için (vasküler değişikliklerin intravital değerlendirilmesi için uygundurÖrneğin, fonksiyonel vazodilatasyon), ve damar değişiklikleri ex vivo değerlendirilmesi (örneğin, damar ağlar immünofloresan görüntüleme ve kantitatif) için. Hem klinik öncesi ve klinik çalışmalar arterioler obstrüksiyonu (insanlarda fareler veya aterosklerotik plakların ligasyonu yoluyla örneğin) bir bireyin tepkisi yaşlarına bağlı olduğunu göstermiştir hastalığın varlığı veya yokluğu (örneğin diyabet) tıkalı arter çapı , bireysel ve doku 11-15 metabolik talep genetik. Böyle Burada sunulan biri olarak sıçan modellerinde, bu karmaşık ilişkiler soruşturma kolaylaştırır zorlanma özgü anatomik ve genetik farklılıkları ve hastalığa özgü fenotipleri, araştırmacı boşuna.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları var beyan.

Acknowledgments

Biz onun parçaları "Havaalanı Lounge", "Duvar" ve "Akşam Melodram (görünüş sırasına göre) dahil olmak üzere, ilgili video onun Creative Commons lisanslı müzik kullanımı için Kevin Macleod kabul ediyorum." Biz de ameliyat video ile onların yardım için Ndubisi Okeke ve Frederick Torstrick kabul etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Iris scissors FST 14090-09 Type: Tool
Size 7 forceps FST 11271-30 Type: Tool
Size 5 forceps FST 11251-20 Type: Tool
Spring scissors Roboz RS5671 Type: Tool
Microprobe FST 10140-03 Type: Tool
May be substituted with straight probe
Needle holder FST 12500-12 Type: Tool
Induction chamber JD Medical Dist. Co., Inc. IC-1086 Type: Equipment
Eye Gel Dechra NDC 17033-211-38 Type: Reagent
Heat pad FST 21060-01 Type: Equipment
Rectal temperature probe FST 21060-01 Type: Equipment
Stimulating electrodes FHC UEWSGCSE0N1M Type: Equipment
Artisan's Polymer Clay Polyform N/A Type: Equipment
PowerLab data acquisition system ADInstruments ML 845 Type: Equipment
Stimulus isolator ADInstruments FE 180 Type: Equipment
LabChart ADInstruments ML S060/7 Type: Software
Reflected-light fluorescent microscope Olympus BFXM Type: Equipment
High MW fluorescent dextran Sigma FD250S-100MG Type: Reagent
Video calipers Colorado Video 308 Type: Equipment
Automated Vascular Analysis (AVA) Microvision Medical Type: Software
Anti-αSMA Conjugated Fluorophore Sigma 1A4-Cy3 Type: Reagent
Clonal, 1:100
Fluorescent Microscope Olympus BFXM Type: Equipment
High-molecular weight fluorescent dextran Sigma FD250S-100MG Type: Reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bailey, A. M., O'Neill, T. J., Morris, C. E., Peirce, S. M. Arteriolar Remodeling Following Ischemic Injury Extends from Capillary to Large Arteriole in the Microcirculation. Microcirculation. 15, 389-404 (2010).
  2. Bruce, A. C., Peirce, S. M. Exogenous Thrombin Delivery Promotes Collateral Capillary Arterialization and Tissue Reperfusion in the Murine Spinotrapezius Muscle Ischemia Model. Microcirculation. 19, 143-154 (2012).
  3. Mac Gabhann, F., Peirce, S. M. Collateral capillary arterialization following arteriolar ligation in murine skeletal muscle. Microcirculation. 17, 333-347 (2010).
  4. Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine Model of Hindlimb Ischemia. J. Vis. Exp. (23), e1035 (2009).
  5. Madeddu, P., et al. Murine models of myocardial and limb ischemia: diagnostic end-points and relevance to clinical problems. Vascul. Pharmacol. 45, 281-301 (2006).
  6. Cardinal, T. R., Kurjiaka, D. T., Hoying, J. B. Chronic hindlimb ischemia impairs functional vasodilation and vascular reactivity in mouse feed arteries. Front. Physio. 2, 91 (2011).
  7. Sefcik, L. S., et al. Selective Activation of Sphingosine 1-Phosphate Receptors 1 and 3 Promotes Local Microvascular Network Growth. Tissue Eng. Part A. 17, 617-629 (2011).
  8. Deindl, E., et al. Role of Ischemia and of Hypoxia-Inducible Genes in Arteriogenesis After Femoral Artery Occlusion in the Rabbit. Circulation Research. 89, 779-786 (2001).
  9. Chalothorn, D., Zhang, H., Smith, J. E., Edwards, J. C., Faber, J. E. Chloride Intracellular Channel-4 Is a Determinant of Native Collateral Formation in Skeletal Muscle and Brain. Circulation Research. 105, 89-98 (2009).
  10. Scholz, D., et al. Contribution of Arteriogenesis and Angiogenesis to Postocclusive Hindlimb Perfusion in Mice. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 775-787 (2002).
  11. McClung, J. M., et al. Skeletal muscle-specific genetic determinants contribute to the differential strain-dependent effects of hindlimb ischemia in mice. Am. J. Pathol. 180, 2156-2169 (2012).
  12. Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117, 1207-1215 (2008).
  13. Faber, J. E., et al. Aging causes collateral rarefaction and increased severity of ischemic injury in multiple tissues. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31, 1748-1756 (2011).
  14. Peng, X., et al. Gender differences affect blood flow recovery in a mouse model of hindlimb ischemia. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 300, 2027-2034 (2011).
  15. Li, Y., Guan, H., Hazarika, S., Liu, C., Annex, B. H. Impaired angiogenesis following hind-limb ischemia in diabetes mellitus mice. Chin. Med. Sci. J. 22, 232-237 (2007).
Mikrovasküler Fonksiyon ve Tadilat üzerine Arteriolar Ligasyonu etkisini değerlendirmek için mürin Spinotrapezius Modeli
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guendel, A. M., Martin, K. S., Cutts, J., Foley, P. L., Bailey, A. M., Mac Gabhann, F., Cardinal, T. R., Peirce, S. M. Murine Spinotrapezius Model to Assess the Impact of Arteriolar Ligation on Microvascular Function and Remodeling. J. Vis. Exp. (73), e50218, doi:10.3791/50218 (2013).More

Guendel, A. M., Martin, K. S., Cutts, J., Foley, P. L., Bailey, A. M., Mac Gabhann, F., Cardinal, T. R., Peirce, S. M. Murine Spinotrapezius Model to Assess the Impact of Arteriolar Ligation on Microvascular Function and Remodeling. J. Vis. Exp. (73), e50218, doi:10.3791/50218 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter