Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

إعداد الحويصلية عملاق التصوير والتصحيح، المشبك الكهربية

Published: June 21, 2013 doi: 10.3791/50227
Automatic Translation
1, 1
1Department of Physiology and Biophysics, University of Washington

Summary

إعادة تشكيل بروتينات الغشاء وظيفية في الجسيمات الشحمية العملاقة من تكوين المعرفة هو نهج قوية عندما يقترن الكهربية التصحيح، المشبك. ومع ذلك، قد يكون الإنتاج الحويصلية العملاقة التقليدية يتعارض مع استقرار البروتين. نحن تصف بروتوكولات لإنتاج الجسيمات الشحمية العملاقة من الدهون نقية أو الجسيمات الشحمية صغيرة تحتوي على القنوات الأيونية.

Abstract

وقد تم إعادة تشكيل القنوات الأيونية في الأغشية الدهنية محددة الصفات كيميائيا لتسجيل الكهربية تقنية قوية لتحديد واستكشاف وظيفة هذه البروتينات الهامة. بيد أن الاستعدادات الكلاسيكية، مثل طبقات ثنائية مستو، والحد من التلاعب والتجارب التي يمكن القيام بها على قناة المعاد والبيئة غشاء لها. وتشبه خلية هيكل أكثر من الجسيمات الشحمية العملاقة يسمح تجارب التصحيح، المشبك التقليدية دون التضحية السيطرة على البيئة الدهون.

Electroformation هو يعني كفاءة لإنتاج الجسيمات الشحمية العملاقة> 10 ميكرون في القطر الذي يعتمد على تطبيق التيار الكهربائي بالتناوب إلى رقيقة، فيلم الدهون أمرت تترسب على سطح القطب. ومع ذلك، وبما أن بروتوكول الكلاسيكية يدعو إلى الدهون لتودع من المذيبات العضوية، وأنه غير متوافق مع بروتينات الغشاء أقل قوة مثل القنوات الأيونية ويجب أن يتم تعديل. في الآونة الأخيرة، والعلاقات العامةوقد وضعت otocols إلى electroform الجسيمات الشحمية العملاقة من الجسيمات الشحمية الصغيرة المجففة جزئيا، والتي تكيفنا مع الجسيمات الشحمية تحتوي على البروتين في المختبر لدينا.

نقدم هنا الخلفية، ومعدات، وتقنيات، ومزالق electroformation من الجسيمات الشحمية العملاقة من التفرق الحويصلية الصغيرة. نبدأ مع بروتوكول الكلاسيكية، والتي ينبغي أن يتقن أولا قبل محاولة البروتوكولات أكثر تحديا التي تتبع. ونحن لشرح عملية جفاف جزئي للرقابة من الجسيمات الشحمية صغيرة باستخدام بخار التوازن مع حلول الملح المشبع. وأخيرا، ونحن لشرح عملية electroformation نفسها. سنقوم بشرح بسيط، تجهيزات رخيصة الثمن التي يمكن إجراؤها في المنزل لإنتاج الجسيمات الشحمية عالية الجودة، ووصف الفحص البصري للإعداد في كل مرحلة لضمان أفضل النتائج.

Introduction

الجسيمات الشحمية العملاقة (غالبا ما تسمى الحويصلات unilamellar العملاقة، أو GUVs) وقد استخدمت أساسا لدراسة الفيزياء والكيمياء الفيزيائية من طبقات ثنائية الدهون، بما في ذلك دراسات من تشوه طبقة ثنائية، الوحشي مرحلة التعايش ("الطوافات")، والانصهار الغشاء، الخ 1-4. لديهم بشكل صارخ مثل خلية هيكل: قذيفة كروية من الغشاء الذي يحيط الداخلية مائي والتي يمكن بسهولة أن يتم مختلفة من المخزن المؤقت المائية المحيطة بها. ، بحكم تعريفها، ≈ 1-100 ميكرون في القطر، بحيث يمكن تصويرها أنهم باستخدام مجموعة متنوعة من النهج المجهر الضوئي. يمكن أن تكون مصنوعة مشدود باستخدام التدرجات التناضحي أو التوتر تطبيقها ميكانيكيا، بحيث حين ميسرة عموما، يمكن التلاعب ممتلكاتهم لسهولة التعامل. على وجه الخصوص، والسيطرة على "صلابة" من الحويصلية يجعلها واضحة لتشكيل بقع "الحويصلية المرفقة" أو رفعه للالكهربية. في الماضي، تم إجراء إعادة ايون القناة إلى حد كبير في مستو الدهون بilayers. الآن، والقدرة على تشكيل بقع من الجسيمات الشحمية العملاقة واستخدام جعبة كبيرة من الأدوات التي وضعت لالكهربية التقليدية (المجهري مضان، micropipette الطموح، نضح السريع والتحكم في درجة الحرارة، الخ) يجعل الجسيمات الشحمية العملاقة جذابة على نحو متزايد للدراسات إعادة 5،6.

وقد بذلت الجسيمات الشحمية العملاقة من قبل العديد من الاستراتيجيات. في الواقع، الجسيمات الشحمية العملاقة تشكل عفويا من خلال عملية التورم عند ممهى فيلم الدهون المجففة 4،7،8. الرغبة في إعداد أكثر بسرعة أكبر، أدى الجسيمات الشحمية أكثر اتساقا الباحثين إلى أساليب أخرى، أهمها electroformation 1،9. يعتمد Electroformation أيضا على ترطيب فيلم الدهون المجففة، ولكن تسرع هذه العملية من خلال تطبيق مجال كهربائي تتأرجح عبر فيلم الدهون. يتم تطبيق هذا المجال من خلال قطبين، إما أسلاك البلاتين أو الإنديوم-أكسيد القصدير (ITO) شرائح الزجاج المطلي، وفصلها عن طريق المياه أوالعازلة والتي تترسب على نسبة الدهون. من خلال تسريع تورم الجسيمات الشحمية، واحد يحقق عائدات أعلى من الجسيمات الشحمية أكبر. وهكذا، أصبح electroformation الأسلوب الافتراضي لإنتاج الجسيمات الشحمية العملاقة 4.

آلية electroformation ليست مفهومة تماما، ويتم تطوير معظم بروتوكولات تجريبيا (على سبيل المثال 10،11). ومع ذلك، يمكننا أن نتعلم قليلا عن ما يمكن توقعه من خلال النظر في نظرية وبعض النتائج التجريبية. ويعتقد على نطاق واسع أن electroformation يحدث من قبل القيادة تدفق الكهربائية ناضح من عازلة بين طبقات ثنائية الدهون الفردية مكدسة في الفيلم الدهون المودعة 10،11. اقتران كهرباء لتقلبات الحرارية للطبقات ثنائية الدهون وربما أيضا المشاركة 12. هذه الفرضيات التنبؤ نوعيا الحدود العليا لتردد المجال الكهربائي والقوة التي يمكن استخدامها 10،12. على وجه الخصوص، فإنه من المتوقع أن الحلول عالية التوصيل ( 12. انخفاض معدلات تدفق Electroosmotic عموما مع زيادة تركيز الملح وكثيرا ما بلغ ذروته في بعض الكهربائية تيرة التذبذب حقل (على سبيل المثال وإن كان ذلك في الهندسة المختلفة، الأخضر وآخرون 13). وبالتالي، شدة المجال العالي وترددات أعلى معقولة عن حلول الموصلية عالية، في حدود 10.

ومع ذلك، من المحتمل أن تكون غير متوافقة مع الأسلوب المعتاد لإيداع الدهون على أقطاب لهذا الإجراء electroswelling، وبالتحديد في المذيبات العضوية والتي يتم بعد ذلك تبخرت قبالة لترك فيلم الدهون رقيقة بروتينات الغشاء. هناك مسارين الرئيسي للتغلب على هذه الصعوبة: لإدراج البروتينات بعد تشكيل الحويصلية العملاقة، أو للتكيف مع الطريقة التي أودعت الدهون. نهجنا يبني على الآخرين 5،11 لإيداع الدهون وreconstituted بروتين غشاء معا من تعليق "proteoliposomes" صغيرة أو كبيرة. نحن تصف عملية طويلة وأكثر تحديا من إنتاج proteoliposomes من تنقية البروتين والدهون في مكان آخر (كولينز وغوردون، في الاستعراض). نحن هنا وصف بروتوكول في غياب أي بروتين، ولكنه هو نفسه عندما تم دمج بروتين، ونحن وتشمل النتائج تبين أن proteoliposomes تحتوي على قناة TRPV1 أيون يمكن أن تتحول إلى GUVs وتستخدم لالتصحيح، المشبك الكهربية. في أي نهج electroformation، الفحص البصري من العينة الدهون أثناء عملية ترسب الدهون أمر بالغ الأهمية لتحقيق النجاح.

نهجنا قد تكون ذات صلة وراء تطبيق المتخصصة لايون القناة إعادة. في الوقت منذ وضعنا أول هذا البروتوكول والآن، كما تم إثبات أنه الطريقة التي تترسب الدهون على أقطاب لelectroformation يؤثر على التجانس التركيبي للGUVs الناتجة عن ذلك. Baykآل كاغلار وآخرون. أظهرت أن 14 GUVs شكلت من الجسيمات الشحمية بعناية المجففة كان 2.5 مرات أصغر التباين في امتزاج درجة حرارة التحول من GUVs تشكلت من خليط من مختلف الدهون الفوسفاتية والكوليسترول. عملهم يشير إلى أن الدهون، وخصوصا الكوليسترول، قد يعجل من خليط الدهن عندما تودع من المذيبات العضوية، مما أدى إلى التباين المكاني كبير في تكوين الفيلم الدهون المودعة. وهذا أمر مهم خاصة بالنسبة للدراسات من الدهون غشاء السلوك المرحلة، ولكن قد يكون أيضا عاملا حاسما للتجارب الكمية على وظيفة القناة الايونية. بايكال-كاغلار وآخرون. 'ق بروتوكول مماثل ولكن ليست متطابقة إلى منطقتنا، ونحن نشجع القراء لدراستها كذلك.

هذا البروتوكول (انظر نظرة عامة، والشكل 1) هو واحد من العديد من التي يمكن استخدامها. في نجاح electroformation مبدأ يعتمد على خليط الدهون، الماء، درجة الحرارة، والمواد المذابة الأخرى (وخاصة أيونات)، وللبالطبع الجهد والتردد المستخدمة في التشكيل. كما يصبح electroformation فهم أفضل، ونحن نتوقع أن صقل بروتوكول لدينا أكثر من ذلك.

وأخيرا، غالبا ما يكون هناك منحنى التعلم حاد في electroforming الجسيمات الشحمية العملاقة. نقترح اتقان بروتوكول التقليدية (الأقسام 1 و 4، وإذا لزم الأمر، القسم 5) قبل أن تعلم أن تودع الدهون من الايقاف الليبوسومال (الأقسام 2-5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ترسب الدهون من المذيبات العضوية: بروتوكول الكلاسيكية

  1. إزالة الدهون من التخزين عند درجة حرارة -20 ° C أو -80 ° C؛ الحارة لRT تنبيه: الدهون هي استرطابي للغاية، والعديد من حساسة للأكسجين. تغطية نسبة الدهون في الأراضي الجافة الأرجون أو غاز النيتروجين وفي جميع الخطوات تقليل التعرض للهواء.
  2. إذا لزم الأمر، تعلق الدهون في الكلوروفورم أو الهكسان الحلقي في ملغ / مل 1-10، علما أن تركيزات الصانع المعلنة هي عادة الاسمية فقط تحذير: ارتداء القفازات المناسبة ومعدات الحماية الشخصية الأخرى عند استخدام المذيبات العضوية. إزالة معدات الوقاية الشخصية بسرعة في حال تسرب مذيب عليها، لأن معظم المواد لا تزال قابلة للاختراق لهذه المذيبات وأنها توفر حماية مؤقتة فقط.
  3. تنظيف كلا الجانبين من اثنين 25 × 37.5 ملم ITO الشرائح الزجاجية المغلفة مع الإيثانول
  4. مزيج من الدهون لتحقيق نسب المولي المطلوب. لكل سم 2 من مساحة 1 من ITO ينزلق إلى أن تطلى مع شفةمعرف، مزيج ~ ميكروغرام 15-20 من الدهون. على سبيل المثال، إذا كانت كل 25 × 37.5 ملم الشرائح لتكون مغلفة بشكل كامل، فإننا عادة استخدام 30 ميكرولتر من 10 ملغ / مل خليط الدهن ملاحظة: إضافة 0.1 مول٪ تكساس الأحمر DPPE للتصوير الفلورسنت، وانظر أدناه للحصول تحذر من الأصباغ الفلورية.
  5. تحقق من أن الجانب ITO المغلفة من الشرائح الزجاجية يواجه ما يصل عن طريق قياس مقاومة سطح مع جهاز قياس المقاومة أو المتعدد.
  6. نضح في نسبة الدهون في مقاومة المذيبات حقنة تنبيه: لا الغراء أو البلاستيك، وغيرها من السليكوون، يجب الاتصال المذيب العضوي.
  7. مع إبرة حقنة عدم لمس السطح تماما إيتو، تطبق ببطء الدهون تحريك إبرة ذهابا وإيابا عبر الشريحة. تغطية السطح على نحو متساو، وتبحث عن "قوس قزح لمعان" على سطح الزجاج.
  8. ضع الشرائح بسرعة تحت <1 عربة (1 ملم زئبقي) فراغ ل0.5-1 ساعة لإزالة أي أثر المذيبات. فراغ الإفراج مع غاز خامل.
  9. تطبيق طوقا سيليكون، معطبقة رقيقة من السيليكون الشحوم فراغ في كلا الجانبين. ترك 5 مم على الأقل من الشريحة المكشوف تتعرض في نهاية واحدة من الشريحة.
  10. الشروع فورا في القسم 4.

2. إعداد الحويصلية صغيرة للجفاف الشواهد

  1. تحضير خليط الدهن كما في خطوات 1،1-1،4.
  2. تجفيف الدهون باستخدام تيار من غاز النيتروجين أو الأرجون في 10-15 ملم قطر الأنبوب الثقافة. للحصول على كميات صغيرة من الدهون، ≤ 0.5 ملغ، يمكن للفيلم أن يكون الناتج رطب مباشرة بعد وضعه تحت فراغ ل0.5-1 ساعة لإزالة المذيبات المتبقية؛ انتقل إلى الخطوة 2.5. كميات أكبر من الدهون تميل إلى اعتراض المذيبات العضوية في مادة هلامية سميكة، حتى في ظل فراغ، وتجفيد مستعدون بشكل أفضل، وانظر الخطوات 2،3-4.
  3. تعليق الفيلم الدهون المجففة في الهكسان الحلقي، وغطاء مع الأرجون وختم مع سدادة، ووضع أنبوب في كتلة الباردة والتجميد في -80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة الحد الأدنى.
  4. وضع كتلة الباردة وعينة من المادة الدهنية في نظام فراغقادرة على الوصول إلى 100 mTorr. تطبيق فراغ، بل سوف "المماطلة" في حوالي 1 عربة كما يبخر المذيب قبالة. وبمجرد إزالة المذيب تماما (~ 1 ساعة) فراغ تنخفض الى اقل من هذا المستوى. فراغ الإفراج مع غاز خامل وختم الأنبوب أو هيدرات فورا.
  5. في حين أن الدهون هي تحت فراغ، عازلة الماء ديغا باستخدام فراغ وsparging 15-17.
  6. هيدرات الدهون باستخدام العازلة degassed في تركيز النهائي 1-10 ملغ / مل. تسمح الدهون لترطيب ببطء. بعد 30 دقيقة، 1 ساعة، دوامة لتفتيت كتل المتبقية. الانتظار لمدة 0.5-1 ساعة إضافية للسماح لترطيب كاملة. استخدام osmoticant، مثل السوربيتول أو السكروز تصل إلى 200 ملم، لمنع الجفاف الكامل في الخطوات التالية.
  7. إعداد 100-200 نانومتر الجسيمات الشحمية قطرها بواسطة البثق. انظر البروتوكول قذف الشركة المصنعة للحصول على التفاصيل. لاحظ أنه يجب أن يكون المخزن المؤقت وستكون هناك حاجة أقل من ~ 25 ملم القوة الأيونية، أو بروتوكولات الجهد electroformation خاصة في القسم 4.

3.ترسب الدهون بسبب الجفاف الشواهد من الليبوزومات الصغيرة

  1. تحذير: يتطلب بروتوكول لدينا الدهون إلى وضعها في حالة توازن مع حلول بخار مشبع من الملح لعدة ساعات. ونحن نوصي بشدة أداء البروتوكول في جو غاز خامل، وذلك باستخدام علبة القفازات أو الضميمة مماثلة.
  2. تحذير: إذا إعداد العينات التي تحتوي على البروتينات، وتجنب الجفاف الكامل. هيدرات الغلاف الجوي في أي الضميمة مع كوب من الماء الدافئ، أو المرطب على sonicator. استخدام مقياس درجة الرطوبة لضمان وجود الرطوبة النسبية 30٪ على الأقل. استخدام السوربيتول أو السكروز في المخزن المؤقت الحويصلية الصغيرة كإجراء وقائي إضافي لمنع إجمالي الجفاف.
  3. إعداد محلول الملح المشبع من الرطوبة النسبية الملائمة. الرطوبة الهدف يعتمد على الأسمولية من إعداد حويصلة. للتحضير مع الأسمولية الفسيولوجية، واستخدام 30-45٪ RH، بينما منخفض الاستعدادات حويصلة الأسمولية يمكن أن يكون المجففة بشكل كاف فيالتوازن مع 75-90٪ RH (انظر أيضا الجدول 1).
  4. وضع محلول الملح المشبع والملح الزائد في وعاء قابل للغلق بإحكام مع الرف الداخلية. حاويات المواد الغذائية تجارية للالزبادي والجرانولا تعمل بشكل جيد جدا. استبدال الرف بعد التعبئة، وجعل السائل بالتأكيد هو 5-10 ملم تحت الرف.
  5. نظيفة ITO الشرائح المغلفة كما هو الحال في القسم 1. استخدام المتعدد لتحديد الجانب الذي هو موصل، وتسمية الجانب غير موصل مع اسم العينة.
  6. بخفة الشحوم كلا الجانبين من السيليكون (USP الصف السادس) طوقا (s) مع واحد أو ثقوب متعددة.
  7. ضع الشرائح الجانبية الموصلة حتى على مقاعد البدلاء، وتطبيق سيليكون طوقا (ق) إلى كل الشريحة التي سيتم تطبيقها الدهون، والتأكد من وجود ما لا يقل عن 5 ملم من الشريحة تتعرض في نهاية واحدة للاتصال الجهاز electroformation. تمهيد طوقا لضمان ختم جيدة.
  8. تمييع إعداد حويصلة في منطقة عازلة متسق الضغط التناضحي قليل الملح إلى ~ 1-2 ملغ / مل. نجد أن أعلى concentrations تنتج النتائج السيئة.
  9. تطبيق المادة الدهنية إلى الشريحة في قطرات ميكرولتر 1-10. قطرات أصغر تنتج عادة نتائج أفضل.
  10. ضع الشريحة على الرف الداخلية فوق محلول الملح المشبع وختم الحاوية بإحكام. ترك في RT لمدة 3 ساعة إلى O / N. الحاوية يمكن وضعها في 4 درجات مئوية، ولكن سوف نلاحظ أنه بالنسبة لبعض الأملاح، وRH يعتمد بشدة على درجة الحرارة، وهذا البرد زيادة موازنة الوقت.
  11. قد يكون الفيلم الناتج لمعان قوس قزح طفيفة عليها، ولكن على أي حال يجب أن تظهر المجفف تقريبا. قد تكون الحلول بدءا الاسموزي للغاية من المستحيل حتى يجف تماما لفيلم الدهن، وهذا لن يؤثر سلبا على النتائج.

4. Electroformation من الليبوزومات العملاق

  1. يتم فكها الأفلام الدهون، وخاصة تلك التي يتم تشكيلها من الجسيمات الشحمية المجففة، وبسهولة. هيدرات بعناية كل بئر من خلال وضع 27 G إبرة حقنة على حافة طوقا وتطبيق ببطء العازلة. يمكن مخازنوتشمل المياه، ≤ 200 ملي السكروز، ≤ 1 M السوربيتول و≤ 5 HEPES ملي. أكثر من 10 ملي محلول الملح قد تتطلب بروتوكولات الجهد electroformation بديل. فعم كل طوقا بشكل جيد من قبل ~ 10٪.
  2. ملاحظة: بمجرد أن الدهون هي رطب، والمضي قدما بسرعة من خلال الخطوات المتبقية، منذ الأفلام الدهون تبدأ في delaminate فورا. إلى أقصى حد العائد وحجم إذا يبدأ electroformation فورا.
  3. في اقتراح واحد على نحو سلس، وتطبيق الشريحة ايتو والوجه الثاني في موصل، إلى الأعلى من وحشية. تأكد من أن يكون لا يقل عن 5 ملم من عبء خارج منطقة طوقا والعكس عبء الأول. اضغط بلطف لضمان ختم جيدة.
  4. تنظيف يتدلى اثنين باستخدام الإيثانول والتحقق من أن الجانبين التي تواجه طوقا هي موصل مع المتعدد الخاص بك.
  5. الدائرة يمكن تأمين مزيد مع parafilm أو ضوء كليب ربيع التوتر اذا شئت.
  6. ربط غرفة electroformation إلى مصدر التيار الكهربائي من خلال تأمين الألومنيوم أو النحاس القضبان، "EMI gaskوآخرون رغوة "، أو شريط لاصق موصل إلى السطوح موصل من الشرائح اثنين. نحن نستخدم EMI طوقا رغوة. خطط لرقصة والمشبك وتظهر في الشكل 5.
  7. تحقق من وجود أي تماس كهربائي بين الأسماء، وأن اتصالات الاتصال بشكل صحيح إلى السطوح ايتو، وذلك باستخدام المتعدد.
  8. تسخين غرفة 10 ° C فوق أعلى درجة حرارة انصهار أي من نسبة الدهون في الحاضر؛ على سبيل المثال لDPPC، والحرارة إلى 52 درجة مئوية كحد أدنى، و 10 درجة مئوية فوق درجة حرارة انصهار سلسلة من 42 درجة مئوية.
  9. لمخازن قليل الملح، وتطبيق 10 هرتز موجة جيبية، ~ 0.7 V RMS لكل ملليمتر الفجوة بين اثنين من الأسطح المطلية إيتو، ل60-90 دقيقة. لمخازن عالية من الملح، وبروتوكولات الجهد أخرى ينبغي أن تستخدم (انظر المراجع).

5. التصوير واستكشاف الأخطاء وإصلاحها

  1. صورة الحويصلية باستخدام مجهر مقلوب مجهزة مكعب مرشح لرودامين أو الأصباغ الحمراء تكساس. يجب أن يكون الحويصلية كروية،في الغالب unilamellar بالعين، وخالية من العيوب مثل "سلاسل" شنقا قبالة الحويصلية.
  2. إذا كانت الجسيمات الشحمية هي صغيرة جدا، استخدام كميات أقل من الدهون.
  3. إذا كان هناك العديد من العيوب أو بعض الجسيمات الشحمية، وهذا قد يكون راجعا إلى نسبة الدهون في مراحل هلام. النظر في رفع درجة الحرارة electroformation.
  4. إذا قليلة أو معدومة الجسيمات الشحمية العملاقة التي تشكلت في كل من الجسيمات الشحمية الصغيرة المجففة، والحد من قوة ناضح من المخزن المؤقت الحويصلية، أو زيادة قوة ناضح من المخزن المؤقت electroformation. وتدفق من العازلة في مركزة حل العازلة الخلالي يمكن أن يسبب التبطين من الفيلم الدهون المودعة.
  5. إذا العائد حويصلة، والجودة، أو حجم والفقراء، وأنت شملت أملاح أو مخازن درجة الحموضة في electroformation أو الحويصلية المخازن المؤقتة، والنظر في بروتوكولات الجهد electroformation البديلة. على سبيل المثال، بوت، وآخرون. 11، يوصي البروتوكول الخطوة الثالثة باستخدام 500 هرتز شركة Sinewave، ورفع الجهد من 50-1،300 بي بي / م أكثر من 30 دقيقة، وعقد لمدة 90 دقيقة، فين خفض تردد إلى 50 هرتز أكثر من 30-60 دقيقة. قد تكون هناك حاجة البلاتين أو التيتانيوم الأقطاب في هذه الحالة، ولكن هذا لن يغير كثيرا في البروتوكول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في الأمثلة لدينا، ونحن نستعد الجسيمات الشحمية من خليط من ما يقرب من 55٪ POPC مول (1-بالميتويل-2-oleoyl-SN-glycero-phosphocholine)، 15٪ مول الملوثات العضوية الثابتة (1-بالميتويل-2-oleoyl-SN-glycero-phosphoserine ، 30٪ مول الكوليسترول، و 0.1٪ مول تكساس الأحمر المسمى 1،2-dipalmitoyl-SN-phosphoethanolamine (TXR-DPPE). وقد تم اختيار هذا التكوين ممثلا تقريبا من الدهون عقدة الجذر الظهري 18. ونلاحظ أن 15٪ مشحونة مول الدهون (هنا POPS) بالقرب من حدود ما يمكن استخدامه في electroformation (على سبيل المثال Walde وآخرون. 4).

انهيار الدهون بواسطة التحليل المائي وبيروكسيد هي قضية ذات أهمية خاصة بالنسبة لكثير من الخلائط الدهون والعديد من التجارب الحساسة (انظر المناقشة). من أجل الوضوح وحده، ونحن لا تستخدم الاجواء غاز خامل في عرض الفيديو. كما هو واضح من الأرقام أدناه، وهذا لا يؤثر بشكل ملحوظ على نوعية الجسيمات الشحمية، ولكن لدراسات حساسة أوالدهون غير المشبعة عند استخدام درجة عالية من الأهمية لمنع انهيار الدهون.

منذ عقبة رئيسية في electroformation هو تشكيل فيلم جيد دهن على الإنديوم-أكسيد القصدير (ITO) الركيزة، ومعرفة ما الفيلم الدهون يجب أن تبدو عندما جفت أمر بالغ الأهمية. ومع ذلك، عندما فشل electroformation، فإنه غالبا ما يفعل ذلك تماما، مما أدى إلى عدم إنتاج الحويصلية العملاقة ملموس. في كثير من الأحيان، وسيراعى في الحتات كبيرة، وهذا يشير عادة أن الكثير من الدهون قد استخدمت. تظهر الأرقام لدينا ما يتوقع المرء أن يرى على النجاح.

ويبين الشكل 2 اثنان بقع مختلفة من الجسيمات الشحمية كهربي من الدهون المودعة من الكلوروفورم. في اللوحة اليسرى، ودراسة عن كثب بقع يتبين من السهام 2 و 3. بينما سهم 2 يشير إلى التصحيح مع الجسيمات الشحمية تمييزها بشكل سيئ، يمكن أن يقدم أي الجسيمات الشحمية إلى التركيز في المنطقة المشار إليها بواسطة السهم 3. معا، وهذه النتائج تشير إلى وجود الفقراء عموماإعداد، وربما يرجع ذلك إلى أن يكون هناك الكثير من الدهون المودعة في هذا المجال. في اللوحة اليمنى، هذه المناطق "غامض" هي أقل شيوعا، مما يشير إلى إعداد أفضل عموما. نجد أنه من النادر أن القضاء نهائيا على مثل هذه العيوب.

ويبين الشكل 3 الجسيمات الشحمية كهربي بنجاح من الدهون التي أودعتها الجفاف من الجسيمات الشحمية صغيرة، في اثنين من تكبير، التقط باستخدام تكساس epifluorescence الأحمر. الجسيمات الشحمية هي متفرق، ولكن هناك العديد من العينات جيدة. وذلك لأن حجم يختلف، عدة خارج التركيز. تشير الأسهم إلى ثلاثة الجسيمات الشحمية ذات نوعية جيدة وتتراوح في حجمها من 5-20 ميكرون ~، اثنان منها تظهر في الصورة التكبير 40X. لاحظ واضحة "خاتم" على حافة: هذا يشير إلى وجود الحويصلية unilamellar أو unilamellar تقريبا. في حين تظهر بعض البقع من الدهون قد انهارت أو شكلت أبدا الدهون، وهذا هو نتيجة نوعية جيدة.

وأخيرا، هدفنا في تطوير ونشر هذا البروتوكولهو إعداد GUVs مع سليمة، وظيفية القنوات الأيونية الثدييات التي هي مناسبة للالكهربية التقليدية التصحيح، المشبك. في الشكل (4) علينا أن نظهر فلفلين تنشيط TRPV1 التيارات الأيونية سجلت في بقع الغشاء الدهني رفعه من GUVs تشكيلها باستخدام هذا البروتوكول. يمكن أن يكون قد تم حظره من قبل التيار الروثينيوم الأحمر، ولم يتم تفعيلها من خلال مركبة كشافات (0.1٪ من الإيثانول، 138 ملي مول كلوريد الصوديوم، 3 HEPES ملي درجة الحموضة 7.4) وحده. إعداد proteoliposomes للتجارب الكهربية هو أبعد من نطاق هذا البروتوكول، ولكن هو موضوع مقال المقدمة.

ملح المولالية @ 20 درجة مئوية، والتشبع ٪ RH @ 10 ° C ٪ RH @ 20 ° C ٪ RH @ 30 ° C
هيدرات كلوريد المغنيسيوم 5.8 33 33 32
البوتاسيوم كربونات ديهيدراتي 8.0 47 44 42
بروميد الصوديوم 4.6 58 57 57
كلوريد نحاسي 5.6 68 68 67
كلوريد الصوديوم 6.13 75 75 75
كلوريد البوتاسيوم 4.61 87 86 84

الجدول 1. الرطوبة النسبية (RH٪) من عدة أملاح شيوعا البيانات الرطوبة النسبية من 19 غرينسبان وروكلاند 20؛ البيانات التشبع من الجداول الهامة الدولية 21.

الشكل 1 الشكل 1. التخطيطي من electroformation الحويصلية العملاقة من الجسيمات الشحمية صغيرة. تترسب (أعلى اليسار) الجسيمات الشحمية الصغيرة في مجموعة من قطرات صغيرة، <5 ميكرولتر. (أعلى الوسط) والجسيمات الشحمية هي المجففة تحت الرطوبة النسبية للرقابة عن طريق وضعها في حاوية مغلقة فوق محلول الملح المشبع. A الرطوبة هو اختياري. (أعلى يمين) مرة واحدة المجففة لفيلم لزجة من الدهون و (ربما) osmoticant مثل السوربيتول، وممهى نسبة الدهون في منطقة عازلة مفرط التناضح (انظر القسم بروتوكول 5). (أسفل اليسار) وختم الدائرة electroformation مع شريحة ايتو الثاني على القمة. (السفلى إلى اليمين) وأخيرا، يتم تسخين غرفة فوق الدهون سلسلة درجة حرارة انصهار، ومتصل بمصدر إشارة توفير حقل كهربائي متذبذب عبر جهازي الشرائح ITO.

الشكل 2

الشكل (3)
الشكل (3). الجسيمات الشحمية كهربي العملاقة التي تشكلت من الدهون الجفاف المودعة. (يسار) على التكبير 10x، العديد من الجسيمات الشحمية مرئية. وصفت ثلاثة الجسيمات الشحمية. (يمين) وجهة النظر نفسها كما في اليسار، في التكبير 40X، مع نفسالجسيمات الشحمية (2 و 3) المسمى. عدد هذه الجسيمات الشحمية هو عادة أصغر بكثير مما كانت عليه عندما electroforming من الدهون مذيب المودعة، ولكن كافية تماما لأغراض كثيرة. التقط باستخدام المجهر epifluorescence مقلوب مجهزة كروما 41004 تكساس الأحمر مرشح مكعب وستانفورد الضوئيات XR/MEGA-10 S30 المكثفة كاميرا CCD.

الشكل 4
الشكل 4. فلفلين المنشط TRPV1 الحالي قد سجلت في رقعة غشاء رفعه من GUV تشكيلها باستخدام هذا البروتوكول. A. تسرب الحالية تدل على وجود ختم 500 MΩ المقاومة قبل وأضيف فلفلين. B. الإشباع كشافات (> 20 ميكرون، في 0.1٪ من الإيثانول) ينشط TRPV1 الحالية كبيرة؛. جيم يعود يتم حظر الحالي عن طريق الروثينيوم الأحمر، ولم يتم تفعيلها من خلال سيارة (الإيثانول بنسبة 0.1٪ في المخزن) وحدها (لا تظهر البيانات) الحاليإلى قرب خط الأساس كما يتم غسلها فلفلين من التصحيح.

الرقم 5
الشكل 5. خطط لغرفة electroformation. وشملت لمحة عامة، والتي تبين الجمعية كاملة، وأبعاد الخطط لأعلى وأسفل قطعة من البلاستيك. استخدم الاكريليك أو البلاستيك الشفاف تشكيله بسهولة آخر. يجب أن تكون متصلا رقيقة KAPTON سخان فيلم للتحكم في درجة الحرارة (انظر الجدول من الكواشف والمعدات محددة)، ويجب أن تكون متصلا طوقا رغوة EMI إلى وظيفة مولد، بحيث إشارة موجة جيبية يتم تطبيقها عبر جهازي الشرائح المغلفة ايتو. يتم توفير حفرة لتحقيق درجة الحرارة. يتم وضع مسطح الرأس 10-32 مسامير في ثقوب غاطسة في قطعة أسفل، ويمر من خلال قطعة العلوي. وتستخدم 10-32 المكسرات لتأمين الجمعية. عندما بأكملsembled، يجب أن يكون الجزء العلوي والسفلي قطعة من البلاستيك مطاردة مع بعضها البعض على الجانبين (الجانبين بالتوازي مع EMI حشية.) انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد وضعت Electroformation من الجسيمات الشحمية العملاقة إلى تقنية مرنة متوافقة مع الدهون المختلفة، والأعمال التحضيرية، ومخازن. التحكم الدقيق في عملية ترسب الدهون هو الأكثر أهمية لتحقيق النجاح. لقد قدمنا ​​أدوات بسيطة لجعل ترسب الدهون رقابة من الاستعدادات الحويصلية صغيرة عملية مباشرة. الرطوبة النسبية أمر بالغ الأهمية لجفاف السليم للالجسيمات الشحمية الأولي، وسوف تختلف القيمة المثلى مع التركيز المبدئي من المواد المذابة في تعليق الحويصلية. مطلوب الرطوبة النسبية أقل ليذوى عينات أكثر تركيزا على مستوى كاف.

بروتوكول ترطيب الدقيق والحقل الكهربائي تستخدم لelectroformation يبقى موضوعا للمناقشة 1،4،7،10،11،22. ينبغي أن يتقن أبسط البروتوكولات الأول قبل محاولة electroformation الحويصلية في وجود تركيزات عالية من الملح والدهون مشحونة، أو تركيزات عالية جدا من ذوبان عاليةجي الدهون درجة الحرارة. بمجرد يتقن هذه المهارات، بروتوكولات أكثر تقدما عادة تقسيم عملية electroformation إلى ثلاثة أجزاء: تورم الأولية، والنمو، ومفرزة. يبدو تورم الأولية التي يفضلها يتزايد ببطء الحقل الكهربائي التطبيقية 11. ويمكن ل، مرحلة الاختياري الثاني في شدة المجال الثابتة مساعدة في السيطرة على الحجم النهائي للالجسيمات الشحمية. وأخيرا، وخفض وتيرة مجال تتأرجح قد تساعد على فصل الجسيمات الشحمية من سطح ITO. وهناك حاجة إلى ترددات أعلى لelectroform الجسيمات الشحمية في ظروف الملح الفسيولوجية 11، ولكن يمكن أن تتكون الجسيمات الشحمية أكثر من مجموعة واسعة جدا من ترددات مجال وسعة 10.

ملاحظة أن الجسيمات الشحمية العملاقة سوف تشكل عفويا عند الإماهة من الجسيمات الشحمية المجففة مع منطقة عازلة للفراش لا تسبب ناضح 7 يشير العديد من مفاتيح النجاح. أولا، عملية تورم الحويصلية يبدأ على الفور، حتى يتسنى للelectroformation، بعضلقد وجدت حتى الجماعات أنه من المفيد لتطبيق الحقل الكهربائي AC قبل إعادة إماهة الفيلم الدهون 10. الثانية، أنه من المرجح أن تدفق السوائل يقود العملية تورم الليبوسومال، ويحدث أن electroformation على الأقل في جزء بسبب الكهربائية osmotically تدفق مدفوعة. هذا يفرض قيودا على التردد مفيدا ونطاق السعة التي يمكن استخدامها في electroformation 10.

وثمة نقطة رئيسية للمناقشة في السنوات القليلة الماضية إمكانية التحلل الدهني وبيروكسيد 23،24. خط الدفاع الأول ضد تدهور الدهون من أي نوع هو لإزالة الأكسجين من جميع المواد التي تستخدم في إعداد GUV: منذ بيروكسيد يعتمد على الأكسجين الجزيئي 23، وهذا ينبغي أن تبطئ عملية إلى حد كبير. مزيج من فراغ وsparging مع غاز خامل ينبغي أن تستخدم لإزالة أكبر قدر ممكن الأكسجين 15-17. صوتنة والفراغ ضوء غير فعالة. نحن استخدام طقم اختبار الأكسجين (Chemetrics K7501) إلى الخامسerify أن قمنا بإزالة الأكسجين على أكمل وجه ممكن. التحلل المائي هو أكثر ضررا، ولكن يتم تقليل من خلال الحفاظ على درجة الحموضة محايد 25، والحد من الجهد المستخدمة في electroformation 24. بعض الكتاب يدعون إلى استخدام أقطاب التيتانيوم في مكان ايتو الشرائح 23،24،26،27. ونحن نفضل لتجنب احتمال تلوث عينات لدينا مع التيتانيوم (أو أي معدن)، لأنه في الماضي كان من المعروف أن تتداخل مع تجارب الحويصلية 28،29، ولكنه قد يساعد على منع بعض الآثار بيروكسيد أو التحلل. فمن نافلة القول أن التعرض لفترات طويلة لدرجات حرارة عالية يسرع انهيار الدهون 30. وأخيرا، طبقة رقيقة اللوني 24،31، المقايسات اللونية 23، وغيرها من الأساليب لقياس وجود 31 تدهور الدهون.

وهناك قضية مماثلة تتعلق الأصباغ الدهون الفلورسنت المستخدمة لGUVs صورة، وخاصة بالنسبة للدراسات الوحشي مرحلة الفصل 30،32 30،33 الأصباغ، واستخدامها في الحد الأدنى من التركيز.

نحن لسنا على علم بأي توافق في الآراء بشأن ما إذا كانت الشرائح القطب ITO يمكن إعادة استخدامها. العديد من المجموعات تفعل إعادة استخدام الشرائح الخاصة بهم إيتو، في حين لا تفعل بعض. الأعمال الأخيرة تشير إلى أن الشرائح القيام تتحلل بمرور الوقت، ولكن يمكن مطوع لاستعادة الأداء العالي 34؛ كان هذا التدهور سوى تأثير صغير لمخاليط الدهون بما في ذلك الدهون أو ثنائي الشحنة وهو الأيونية، ولكن كان حاسما لمخاليط التي تحتوي على الدهون الموجبة. نحن لدينا من دون إعادة استخدام الشرائح الصلب.

على الرغم من أن هناك تفاوتا كبيرا في البروتوكولات المستخدمة لelectroform الجسيمات الشحمية العملاقة، فهم النظرية والخبرة العملية مع تقنية يتحسن باستمرار. بالفعل الجسيمات الشحمية يمكن تشكيلها مع كميات كبيرة من الدهون مشحونة، أو في مخازن الملح العالية. يبقى مفتاح ترسب كفاءة من الدهون على سطح القطب، حركتيH هو جوهر بروتوكول لدينا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

نشكر بريان Venema واريك مارتنسون لبناء جهاز electroformation. وقد تم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للعلوم الطبية العامة من المعاهد الوطنية للصحة (R01GM100718 إلى SEG) والمعهد الوطني للعيون التابع لمعاهد الصحة القومية (R01EY017564 إلى SEG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Digital Multimeter Agilent Technologies, www.agilent.com U1232A or similar Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.
Fluke 117 or 177 Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.
Function Generator Agilent Technologies, www.agilent.com 33210A or similar Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 Ω load
ITO coated glass slides Delta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.com CB-90IN-S107 or similar Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm
Temperature controller Omega Engineering Stamford, CT www.omega.com CNi3233 or similar
Hygrometer Extech, Nashua, NH, www.extech.com 445815
Silicone rubber sheet McMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com 87315K64 Use USP Grade VI silicone for its high purity
EMI gasket Laird Technologies www.lairdtech.com 4202-PA-51H-01800 or similar Distributed by Mouser www.mouser.com
TxR-DHPE Life Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.com T1395MP Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable.
POPC Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL www.avantilipids.com 850457P or 850457C Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C)
POPS Avanti Polar Lipids 840034P/C
Cholesterol Sigma-Aldrich C8667

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dimova, R., Aranda, S., Bezlyepkina, N., Nikolov, V., Riske, K. A., Lipowsky, R. A practical guide to giant vesicles. Probing the membrane nanoregime via optical microscopy. Journal of Physics-Condensed Matter. 18 (28), S1151-S1176 (2006).
  2. Giant Vesicles. Luisi, P. L., Walde, P. , John Wiley & Sons Ltd. (2000).
  3. Riquelme, G., Lopez, E., Garcia-Segura, L. M., Ferragut, J. A., Gonzalez-Ros, J. M. Giant liposomes: a model system in which to obtain patch-clamp recordings of ionic channels. Biochemistry. 29 (51), 11215-11222 (1990).
  4. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: preparations and applications. Chembiochem. 11 (7), 848-865 (2010).
  5. Aimon, S., Manzi, J., Schmidt, D., Poveda Larrosa, J. A., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. Functional reconstitution of a voltage-gated potassium channel in giant unilamellar vesicles. PLoS. One. 6 (10), e25529 (2011).
  6. Girard, P., Pecreaux, J., Lenoir, G., Falson, P., Rigaud, J. L., Bassereau, P. A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles. Biophys. J. 87 (1), 419-429 (2004).
  7. Manley, S., Gordon, V. D. Making giant unilamellar vesicles via hydration of a lipid film. Curr. Protoc. Cell. Biol. 24, 1-13 (2008).
  8. Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy. Colloids. Surf. B. Biointerfaces. 42 (2), 125-130 (2005).
  9. Angelova, M. I., Soleau, S., Meleard, P., Faucon, J. F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Kinetics and applications. Progressin Colloid & Polymer Science. 89, 127-131 (1992).
  10. Politano, T. J., Froude, V. E., Jing, B., Zhu, Y. AC-electric field dependent electroformation of giant lipid vesicles. Colloids. Surf. B. Biointerfaces. 79 (1), 75-82 (2010).
  11. Pott, T., Bouvrais, H., Méléard, P. Giant unilamellar vesicle formation under physiologically relevant conditions. Chem. Phys. Lip. 154 (2), 115-119 (2008).
  12. Sens, P., Isambert, H. Undulation Instability of Lipid Membranes under an Electric Field. Phys. Rev. Lett. 88 (12), (2002).
  13. Green, N. G., Ramos, A., González, A., Morgan, H., Castellanos, A. Fluid flow induced by nonuniform ac electric fields in electrolytes on microelectrodes. I. Experimental measurements. Phys. Rev. E. 61 (4), 4011-4018 (2000).
  14. Baykal-Caglar, E., Hassan-Zadeh, E., Saremi, B., Huang, J. Preparation of giant unilamellar vesicles from damp lipid film for better lipid compositional uniformity. Biochim. Biophys. Acta. 1818 (11), 2598-2604 (2012).
  15. Bakalyar, S. R., Bradley, M. P. T., Honganen, R. The role of dissolved gases in high -performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 158 (0), 277-293 (1978).
  16. Brown, J. N., Hewins, M., Van Der Linden, J. H. M., Lynch, R. J. Solvent degassing and other factors affecting liquid chromatographic detector stability. J. Chromatogr. A. 204, 115-122 (1981).
  17. Dolan, J. W. Mobile Phase Degassing-Why, When, and How. LC-GC. 17 (10), 909-912 (1999).
  18. Cheng, H., Jiang, X., Han, X. Alterations in lipid homeostasis of mouse dorsal root ganglia induced by apolipoprotein E deficiency: a shotgun lipidomics study. J. Neurochem. 101 (1), 57-76 (2007).
  19. Greenspan, L. Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions. J. Res. Natl. Bur. Stand. 81 (1), 89-96 (1977).
  20. Rockland, L. B. Saturated Salt Solutions for Static Control of Relative Humidity between 5 ° and 40 °C. Anal. Chem. 32 (10), 1375-1376 (1960).
  21. Washburn, E. W. International Critical Tables of Numerical Data, Physics, Chemistry and Technology (1st Electronic Edition). , 216-249 (2003).
  22. Estes, D. J., Mayer, M. Giant liposomes in physiological buffer using electroformation in a flow chamber. Biochim. Biophys. Acta. 1712 (2), 152-160 (2005).
  23. Ayuyan, A. G., Cohen, F. S. Lipid Peroxides Promote Large Rafts: Effects of Excitation of Probes in Fluorescence Microscopy and Electrochemical Reactions during Vesicle Formation. Biophys. J. 91 (6), 2172-2183 (2006).
  24. Morales-Penningston, N. F., Wu, J., et al. GUV preparation and imaging: minimizing artifacts. Biochim. Biophys. Acta. 1798 (7), 1324-1332 (2010).
  25. Grit, M., de Smidt, J. H., Struijke, A., Crommelin, D. J. Hydrolysis of phosphatidylcholine in aqueous liposome dispersions. Int. J. Pharm. 50 (1), 1-6 (1989).
  26. Zhou, Y., Berry, C. K., Storer, P. A., Raphael, R. M. Peroxidation of polyunsaturated phosphatidyl-choline lipids during electroformation. Biomaterials. 28 (6), 1298-1306 (2007).
  27. Farkas, E. R., Webb, W. W. Multiphoton polarization imaging of steady-state molecular order in ternary lipid vesicles for the purpose of lipid phase assignment. J. Phys. Chem. B. 114 (47), 15512-15522 (2010).
  28. Hauser, H. O. The effect of ultrasonic irradiation on the chemical structure of egg lecithin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 45 (4), 1049-1055 (1971).
  29. Hauser, H. Phospholipid vesicles. Phospholipids Handbook. Cevc, G. , Marcel Dekker, Inc. New York, New York. (1993).
  30. Veatch, S. L. Electro-formation and fluorescence microscopy of giant vesicles with coexisting liquid phases. Meth. Mol. Biol. 398, 59-72 (2007).
  31. Kim, R. S., LaBella, F. S. Comparison of analytical methods for monitoring autoxidation profiles of authentic lipids. J. Lipid. Res. 28 (9), 1110-1117 (1987).
  32. Veatch, S. L., Leung, S. S. W., Hancock, R. E. W., Thewalt, J. L. Fluorescent probes alter miscibility phase boundaries in ternary vesicles. J. Phys. Chem. B. 111 (3), 502-504 (2007).
  33. Juhasz, J., Davis, J. H., Sharom, F. J. Fluorescent probe partitioning in GUVs of binary phospholipid mixtures: implications for interpreting phase behavior. Biochim. Biophys. Acta. 1818 (1), 19-26 (2012).
  34. Herold, C., Chwastek, G., Schwille, P., Petrov, E. P. Efficient electroformation of supergiant unilamellar vesicles containing cationic lipids on ITO-coated electrodes. Langmuir. 28 (13), 5518-5521 (2012).

Tags

علم وظائف الأعضاء، العدد 76، الفيزياء الحيوية، علم الأحياء الجزيئية، الكيمياء الحيوية، علم الوراثة، علم الأحياء الخلوي، والبروتينات، والأغشية، والاصطناعي، طبقات ثنائية الدهون، الجسيمات الشحمية، الفوسفورية، والكيمياء الحيوية، والدهون، والحويصلات Unilamellar العملاق، الحويصلية، الكهربية، electroformation، إعادة، المشبك التصحيح
إعداد الحويصلية عملاق التصوير والتصحيح، المشبك الكهربية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Collins, M. D., Gordon, S. E. Giant… More

Collins, M. D., Gordon, S. E. Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology. J. Vis. Exp. (76), e50227, doi:10.3791/50227 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter