이미징 및 패치 클램프 전기 생리학에 대한 거대한 리포좀 준비
Summary
패치 클램프 전기 생리학과 결합 될 때 정의 된 구성의 거대한 리포좀으로 기능 막 단백질을 재구성하는 강력한 방법입니다. 그러나 기존의 거대한 리포좀 생산 단백질의 안정성과 호환되지 않을 수 있습니다. 우리는 순수 지질이나 이온 채널을 포함하는 작은 리포좀의 거대한 리포좀 생산을위한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
전기 생리학 녹음 화학적 지질 막에 이온 채널의 재구성이 중요한 단백질의 기능을 식별하고 탐구 할 수있는 강력한 기술이다. 그러나, 평면 이중층과 같은 고전적인 준비는, 재구성 채널과의 멤브레인 환경에서 수행 할 수있는 조작과 실험을 제한 할 수 있습니다. 거대한 리포좀의 더 많은 세포와 같은 구조 지질 환경의 제어를 희생하지 않고도 기존 패치 – 클램프 실험을 허용합니다.
Electroformation는 전극 표면에 증착 얇은 주문한 지질 막에 전압을 교류의 응용 프로그램에 의존 직경 거대한 리포솜에게> 10 ㎛를 생성하는 효율적인 의미입니다. 고전 프로토콜은 유기 용매에서 입금 할 지질 요구 때문에 그러나, 그것은 이온 채널과 같은 덜 강력한 막 단백질과 호환되지 않으며 수정해야합니다. 최근 홍보otocols 우리가 우리의 실험실에서 단백질을 함유 리포솜에 적응 부분적으로 탈수 작은 리포좀에서 거대한 리포좀을 전주 위해 개발되었습니다.
우리는 여기서 배경, 장비, 기술 및 작은 리포좀 분산에서 거대한 리포좀의 electroformation의 함정을 제시한다. 우리는 다음에 더 도전 프로토콜을 시도하기 전에 먼저 마스터해야하는 고전적인 프로토콜로 시작합니다. 우리는 포화 소금 용액과 증기 평형을 사용하여 작은 리포좀의 제어 부분 탈수의 과정을 보여줍니다. 마지막으로, 우리는 electroformation 자체의 과정을 보여줍니다. 우리는 고품질 리포좀을 생산하고 최상의 결과를 보장하기 위해 각 단계에서 준비 육안 검사를 설명하기 위해 사내에서 할 수있는 간단한, 저렴한 장비를 설명합니다.
Introduction
거대한 리포좀은 (종종 거대한 unilamellar 소포, 또는 GUVs 불리는) 주로 이중층 변형, 측면 상 공존 ( "뗏목"), 막 융합 등 1-4 연구 등의 지질 이중층의 물리학 및 물리 화학을 연구하는 데 사용되었습니다. 쉽게 주변 수성 버퍼보다 다른 할 수있는 수성 내부를 둘러싼 막의 구형 쉘 : 그들은 크게 세포와 같은 구조를 가지고. 그들은 정의에 의해, 직경 ≈ 1-100 μm의, 그래서 그들은 광학 현미경의 다양한 접근 방식을 사용하여 이미지화 할 수 있습니다. 그들은 일반적으로 소프트하면서, 자신의 속성을 쉽게 처리를 위해 조작 할 수 있도록, 삼투 기울기 또는 기계적으로 적용 장력을 사용하여 팽팽하게 만들 수 있습니다. 특히, 리포좀의 "강성"전기 생리학에 대해 "리포좀 연결"또는 절제 패치를 형성하는 것이 간단하게 제어. 과거에, 이온 채널의 재구성은 크게 평면 지질 B에서 수행되었다ilayers. 이제, 거대한 리포솜에서 패치를 형성하고 기존의 전기 생리학 개발 도구의 상당한 떨림을 (형광 현미경, 마이크로 피펫 포부, 신속한 재관류 및 온도 제어 등)를 사용하는 기능을 재구성 연구 5,6를위한 거대한 리포좀은 점점 더 매력적 수 있습니다.
거대한 리포좀 많은 전략에 의해 만들어진되었습니다. 건조 지질 영화는 4,7,8을 재수 때 사실 거대한 리포좀은 붓기 프로세스에 의해 자발적으로 형성한다. 더 빨리 더 준비하는 욕망은,보다 균일 한 리포솜은 electroformation 1,9 그들 가운데 최고 다른 접근, 연구자했다. Electroformation는 건조 지질 필름의 수분에 의존하지만, 지질 막에 걸쳐 진동하는 전기장의 응용 프로그램을 통해 과정을 속도. 필드 또는 물에 의해 분리 된 두 개의 전극, 백금 와이어 하나 또는 인듐 – 주석 산화물 (ITO) 코팅 유리 슬라이드를 적용버퍼링 된에 지질이 침착되어 있습니다. 리포좀의 팽창을 가속화함으로써, 더 큰 리포솜의 높은 수율을 달성 할 수있다. 따라서, electroformation 거대한 리포솜에게 4 생산하는 기본 방법이되었다.
electroformation의 메커니즘은 완전히 이해되지 않고, 프로토콜의 대부분은 (예 : 10,11) 경험적으로 개발된다. 그럼에도 불구하고, 우리는 이론과 실증적 결과를 고려하여 무엇을 기대해야하는지에 대해 조금 배울 수 있습니다. 그것은 널리 electroformation은 입금 지질막 10,11 쌓아 개별 지질 이중층 사이의 버퍼의 전기 삼투 흐름을 운전에 의해 발생하는 것으로 생각됩니다. 지질 이중층의 열 변동에 정전기 커플 링은 아마 12 참여하고있다. 이 가설은 질적 10,12 사용할 수 있습니다 전기장의 주파수와 강도에 대한 상한을 예측하고있다. 특히, 그 높은 전도성 솔루션을 예측 ( <eM> 즉, 생리 식염수)는 리포좀 electroformation에게 12을 시작할 수 있습니다 전기 수력 힘을 줄일 수 있습니다. 전기 삼투 유량은 일반적으로 증가 소금 농도가 감소 자주 일부 전기장 발진 주파수 (예를 들어 다른 기하학, 녹색 등. 13이기는하지만)에 만족하고 있습니다. 따라서, 높은 전계 강도와 높은 주파수 범위 10에서, 높은 전도성 솔루션을 합리적입니다.
그러나 막 단백질은 그 얇은 지질막을 떠날 떨어져 증발하는 유기 용매 즉, electroswelling 절차를 전극에 지질 증착의 일반적인 방법으로 호환되지 않을 가능성이 있습니다. 이러한 어려움의 주위에 두 가지 주요 경로가 있습니다 : 거대한 리포좀 형성 한 후 단백질을 통합하거나, 지질이 입금되는 방법을 적용 할 수 있습니다. 우리의 접근 방식은 지질 및 reconsti을 입금하는 다른 5,11에 구축작거나 큰 "proteoliposomes"의 현탁액에서 함께 막 단백질을 tuted. 우리는 (콜린스와 고든 검토)에서 다른 단백질과 지질을 정제에서 proteoliposomes을 생산 길고 더 도전 과정을 설명합니다. 여기에서 우리는 어떤 단백질의 부재에서 프로토콜을 설명하지만 단백질이 포함되는 경우는 동일합니다, 우리는 이온 채널 TRPV1을 포함 proteoliposomes이 GUVs로 변환 및 패치 – 클램프 전기 생리학에 사용할 수있는 것을 보여주는 결과가 있습니다. 모든 electroformation 방식에서 지질 증착 과정에서 지질 샘플을 시각적으로 검사 성공에 중요합니다.
우리의 접근 방식은 이온 채널의 재구성에 대한 전문적인 응용 프로그램 이외의 관련이있을 수 있습니다. 우리가 처음이 프로토콜을 개발하고 지금 그것은 또한 지방질이 electroformation을위한 전극에 부착되는 방법은 결과 GUVs의 조성 이질성에 미치는 영향을 보여왔다 이후 시간에. Bayk알 Caglar 등. 14주의 탈수 리포솜에서 형성 GUVs 다양한 인지질과 콜레스테롤의 혼합물에서 형성 GUVs의 혼 화성 전이 온도에서 2.5 배 작은 변화를했다고했다. 그들의 작품은 지질 혼합물의 지질, 특히 콜레스테롤, 5 월 침전물이 퇴적 지질 필름의 구성에 큰 공간적 변화의 결과로, 유기 용제에서 증착 할 때 나타냅니다. 이 지질 막 단계의 행동 연구에 특히 중요합니다,뿐만 아니라 이온 채널의 기능에 대한 정량적 실험에 중요 할 수 있습니다. 바이칼-Caglar 하였다.의 프로토콜은 비슷하지만 우리 자신과 동일하지 않고, 독자뿐만 아니라 그것을 연구하는 것이 좋습니다.
이 프로토콜은 (개요 그림 1 참조) 사용할 수있는 많은 중 하나입니다. 원리 electroformation 성공에 지질 혼합물, 수화, 온도, 다른 용질 (특히 이온), 그리고에 따라 달라집니다형성에 사용되는 과정의 전압 및 주파수. electroformation이 잘 이해됨에 따라, 우리는 우리의 프로토콜을 구체화 할 것으로 예상된다.
마지막으로, 거대한 리포좀을 전주에있는 가파른 학습 곡선이 종종있다. 우리는 리포좀 현탁액 (섹션 2-5)에서 지질을 입금 학습하기 전에 마스터에게 기존의 프로토콜 (제 1, 4, 그리고 필요한 경우 5 장) 제안합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
거대한 리포좀의 Electroformation은 다양한 지질, 준비하고, 버퍼와 호환 유연한 기술로 개발했다. 지질 증착 공정의주의 깊은 관리가 성공에 가장 중요합니다. 우리는 작은 리포좀 제제 간단한 프로세스에서 지질 조절 증착하기 위해 간단한 도구를 발표했다. 상대 습도는 초기 리포솜의 적절한 탈수 중요하며, 최적의 값은 리포좀 현탁액 용질의 초기 농도가 달라집니다. 낮은 상대 습도는 적절한 수?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 electroformation 장치 구축을위한 브라이언 Venema의 에릭 마틴 슨 감사합니다. 이 작품은 건강의 국립 연구소의 일반적인 의료 과학 국립 연구소에서 보조금 (SEG에 R01GM100718) 및 보건 국립 연구소의 국립 안과 연구소 (SEG에 R01EY017564)에 의해 재정 지원되었다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Digital Multimeter | Agilent Technologies, www.agilent.com | U1232A or similar | Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test. |
| Fluke | 117 or 177 | Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test. | |
| Function Generator | Agilent Technologies, www.agilent.com | 33210A or similar | Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 Ω load |
| ITO coated glass slides | Delta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.com | CB-90IN-S107 or similar | Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm |
| Temperature controller | Omega Engineering Stamford, CT www.omega.com | CNi3233 or similar | |
| Hygrometer | Extech, Nashua, NH, www.extech.com | 445815 | |
| Silicone rubber sheet | McMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com | 87315K64 | Use USP Grade VI silicone for its high purity |
| EMI gasket | Laird Technologies www.lairdtech.com | 4202-PA-51H-01800 or similar | Distributed by Mouser www.mouser.com |
| TxR-DHPE | Life Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.com | T1395MP | Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable. |
| POPC | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL www.avantilipids.com | 850457P or 850457C | Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C) |
| POPS | Avanti Polar Lipids | 840034P/C | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 |
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