Summary
패치 클램프 전기 생리학과 결합 될 때 정의 된 구성의 거대한 리포좀으로 기능 막 단백질을 재구성하는 강력한 방법입니다. 그러나 기존의 거대한 리포좀 생산 단백질의 안정성과 호환되지 않을 수 있습니다. 우리는 순수 지질이나 이온 채널을 포함하는 작은 리포좀의 거대한 리포좀 생산을위한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
전기 생리학 녹음 화학적 지질 막에 이온 채널의 재구성이 중요한 단백질의 기능을 식별하고 탐구 할 수있는 강력한 기술이다. 그러나, 평면 이중층과 같은 고전적인 준비는, 재구성 채널과의 멤브레인 환경에서 수행 할 수있는 조작과 실험을 제한 할 수 있습니다. 거대한 리포좀의 더 많은 세포와 같은 구조 지질 환경의 제어를 희생하지 않고도 기존 패치 - 클램프 실험을 허용합니다.
Electroformation는 전극 표면에 증착 얇은 주문한 지질 막에 전압을 교류의 응용 프로그램에 의존 직경 거대한 리포솜에게> 10 ㎛를 생성하는 효율적인 의미입니다. 고전 프로토콜은 유기 용매에서 입금 할 지질 요구 때문에 그러나, 그것은 이온 채널과 같은 덜 강력한 막 단백질과 호환되지 않으며 수정해야합니다. 최근 홍보otocols 우리가 우리의 실험실에서 단백질을 함유 리포솜에 적응 부분적으로 탈수 작은 리포좀에서 거대한 리포좀을 전주 위해 개발되었습니다.
우리는 여기서 배경, 장비, 기술 및 작은 리포좀 분산에서 거대한 리포좀의 electroformation의 함정을 제시한다. 우리는 다음에 더 도전 프로토콜을 시도하기 전에 먼저 마스터해야하는 고전적인 프로토콜로 시작합니다. 우리는 포화 소금 용액과 증기 평형을 사용하여 작은 리포좀의 제어 부분 탈수의 과정을 보여줍니다. 마지막으로, 우리는 electroformation 자체의 과정을 보여줍니다. 우리는 고품질 리포좀을 생산하고 최상의 결과를 보장하기 위해 각 단계에서 준비 육안 검사를 설명하기 위해 사내에서 할 수있는 간단한, 저렴한 장비를 설명합니다.
Introduction
거대한 리포좀은 (종종 거대한 unilamellar 소포, 또는 GUVs 불리는) 주로 이중층 변형, 측면 상 공존 ( "뗏목"), 막 융합 등 1-4 연구 등의 지질 이중층의 물리학 및 물리 화학을 연구하는 데 사용되었습니다. 쉽게 주변 수성 버퍼보다 다른 할 수있는 수성 내부를 둘러싼 막의 구형 쉘 : 그들은 크게 세포와 같은 구조를 가지고. 그들은 정의에 의해, 직경 ≈ 1-100 μm의, 그래서 그들은 광학 현미경의 다양한 접근 방식을 사용하여 이미지화 할 수 있습니다. 그들은 일반적으로 소프트하면서, 자신의 속성을 쉽게 처리를 위해 조작 할 수 있도록, 삼투 기울기 또는 기계적으로 적용 장력을 사용하여 팽팽하게 만들 수 있습니다. 특히, 리포좀의 "강성"전기 생리학에 대해 "리포좀 연결"또는 절제 패치를 형성하는 것이 간단하게 제어. 과거에, 이온 채널의 재구성은 크게 평면 지질 B에서 수행되었다ilayers. 이제, 거대한 리포솜에서 패치를 형성하고 기존의 전기 생리학 개발 도구의 상당한 떨림을 (형광 현미경, 마이크로 피펫 포부, 신속한 재관류 및 온도 제어 등)를 사용하는 기능을 재구성 연구 5,6를위한 거대한 리포좀은 점점 더 매력적 수 있습니다.
거대한 리포좀 많은 전략에 의해 만들어진되었습니다. 건조 지질 영화는 4,7,8을 재수 때 사실 거대한 리포좀은 붓기 프로세스에 의해 자발적으로 형성한다. 더 빨리 더 준비하는 욕망은,보다 균일 한 리포솜은 electroformation 1,9 그들 가운데 최고 다른 접근, 연구자했다. Electroformation는 건조 지질 필름의 수분에 의존하지만, 지질 막에 걸쳐 진동하는 전기장의 응용 프로그램을 통해 과정을 속도. 필드 또는 물에 의해 분리 된 두 개의 전극, 백금 와이어 하나 또는 인듐 - 주석 산화물 (ITO) 코팅 유리 슬라이드를 적용버퍼링 된에 지질이 침착되어 있습니다. 리포좀의 팽창을 가속화함으로써, 더 큰 리포솜의 높은 수율을 달성 할 수있다. 따라서, electroformation 거대한 리포솜에게 4 생산하는 기본 방법이되었다.
electroformation의 메커니즘은 완전히 이해되지 않고, 프로토콜의 대부분은 (예 : 10,11) 경험적으로 개발된다. 그럼에도 불구하고, 우리는 이론과 실증적 결과를 고려하여 무엇을 기대해야하는지에 대해 조금 배울 수 있습니다. 그것은 널리 electroformation은 입금 지질막 10,11 쌓아 개별 지질 이중층 사이의 버퍼의 전기 삼투 흐름을 운전에 의해 발생하는 것으로 생각됩니다. 지질 이중층의 열 변동에 정전기 커플 링은 아마 12 참여하고있다. 이 가설은 질적 10,12 사용할 수 있습니다 전기장의 주파수와 강도에 대한 상한을 예측하고있다. 특히, 그 높은 전도성 솔루션을 예측 (
그러나 막 단백질은 그 얇은 지질막을 떠날 떨어져 증발하는 유기 용매 즉, electroswelling 절차를 전극에 지질 증착의 일반적인 방법으로 호환되지 않을 가능성이 있습니다. 이러한 어려움의 주위에 두 가지 주요 경로가 있습니다 : 거대한 리포좀 형성 한 후 단백질을 통합하거나, 지질이 입금되는 방법을 적용 할 수 있습니다. 우리의 접근 방식은 지질 및 reconsti을 입금하는 다른 5,11에 구축작거나 큰 "proteoliposomes"의 현탁액에서 함께 막 단백질을 tuted. 우리는 (콜린스와 고든 검토)에서 다른 단백질과 지질을 정제에서 proteoliposomes을 생산 길고 더 도전 과정을 설명합니다. 여기에서 우리는 어떤 단백질의 부재에서 프로토콜을 설명하지만 단백질이 포함되는 경우는 동일합니다, 우리는 이온 채널 TRPV1을 포함 proteoliposomes이 GUVs로 변환 및 패치 - 클램프 전기 생리학에 사용할 수있는 것을 보여주는 결과가 있습니다. 모든 electroformation 방식에서 지질 증착 과정에서 지질 샘플을 시각적으로 검사 성공에 중요합니다.
우리의 접근 방식은 이온 채널의 재구성에 대한 전문적인 응용 프로그램 이외의 관련이있을 수 있습니다. 우리가 처음이 프로토콜을 개발하고 지금 그것은 또한 지방질이 electroformation을위한 전극에 부착되는 방법은 결과 GUVs의 조성 이질성에 미치는 영향을 보여왔다 이후 시간에. Bayk알 Caglar 등. 14주의 탈수 리포솜에서 형성 GUVs 다양한 인지질과 콜레스테롤의 혼합물에서 형성 GUVs의 혼 화성 전이 온도에서 2.5 배 작은 변화를했다고했다. 그들의 작품은 지질 혼합물의 지질, 특히 콜레스테롤, 5 월 침전물이 퇴적 지질 필름의 구성에 큰 공간적 변화의 결과로, 유기 용제에서 증착 할 때 나타냅니다. 이 지질 막 단계의 행동 연구에 특히 중요합니다,뿐만 아니라 이온 채널의 기능에 대한 정량적 실험에 중요 할 수 있습니다. 바이칼-Caglar 하였다.의 프로토콜은 비슷하지만 우리 자신과 동일하지 않고, 독자뿐만 아니라 그것을 연구하는 것이 좋습니다.
이 프로토콜은 (개요 그림 1 참조) 사용할 수있는 많은 중 하나입니다. 원리 electroformation 성공에 지질 혼합물, 수화, 온도, 다른 용질 (특히 이온), 그리고에 따라 달라집니다형성에 사용되는 과정의 전압 및 주파수. electroformation이 잘 이해됨에 따라, 우리는 우리의 프로토콜을 구체화 할 것으로 예상된다.
마지막으로, 거대한 리포좀을 전주에있는 가파른 학습 곡선이 종종있다. 우리는 리포좀 현탁액 (섹션 2-5)에서 지질을 입금 학습하기 전에 마스터에게 기존의 프로토콜 (제 1, 4, 그리고 필요한 경우 5 장) 제안합니다.
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Protocol
1. 유기 용매에서 지질 증착 : 클래식 프로토콜
- . -20 ° C 또는 -80 ° C에서 저장소에서 지질을 제거합니다 RT 따뜻한주의 : 지질은 매우 흡습성이 있으며, 많은 산소에 민감합니다. 건조한 아르곤 또는 질소 가스의 지질을 커버하고 모든 단계에서 공기에 노출을 최소화합니다.
- 필요한 경우, MG / ML 1-10에 클로로포름 또는 헥산에 지질을 중단, 제조 업체의 주장 농도는주의 일반적으로 공칭 것을. 주 : 유기 용제를 사용하는 경우 적절한 장갑 및 기타 개인 보호 장비를 착용하십시오. 대부분의 물질은 여전히이 용매 투과하고 그들이 일시적 보호를 제공하기 때문에 용매, 그들에 유출되는 경우 신속하게 PPE를 제거합니다.
- 에탄올로 두 개의 25 X 37.5 mm ITO 코팅 유리 슬라이드의 양쪽을 청소
- 원하는 몰비를 달성하기 위해 지질을 섞는다. 각 1cm를위한 ITO 면적의 2 입술로 코팅 할 슬라이드아이디, 믹스 ~ 지질의 15-20 μg. . 모두 25 X 37.5 mm 슬라이드가 완전히 코팅 될 것 인 경우에 예를 들어, 우리는 일반적으로 10 ㎎ / ㎖ 지질 혼합물 주 30 μL를 사용한다 : 텍사스 형광 이미징을위한 레드 DPPE, 그리고 아래 참조에 대한주의 0.1 몰 %를 추가 형광 염료.
- 유리 슬라이드의 ITO 코팅면이 저항계 또는 멀티 미터의 표면 저항을 측정하여이 위를 향하고 있는지 확인하십시오.
- . 용매 저항 주사기주의로 지질을 흡입 : 아니오 접착제 또는 PTFE가 아닌 플라스틱, 유기 용매에 문의해야합니다.
- 주사기 바늘은 매우 ITO 표면에 닿지 않도록 함께, 천천히 슬라이드에 걸쳐 앞뒤로 바늘을 이동 지질을 적용합니다. 유리 표면에 "무지개 광택"을 찾고, 균등하게 표면을 커버.
- 흔적 용매 제거 0.5-1 시간 동안 <1 토르 (1 mmHg로) 진공 빠르게 슬라이드를 놓습니다. 불활성 가스로 진공을 해제합니다.
- 와, 실리콘 가스켓을 적용양쪽에 실리콘 진공 그리스의 얇은 층. 슬라이드의 한쪽 끝에서 노출 폭로 슬라이드 5 mm 이상을 둡니다.
- 제 4 즉시 진행합니다.
2. 제어 탈수위한 작은 리포좀 준비
- 단계 1.1에서와 같이 1.4 지질 혼합물을 준비합니다.
- 10-15 mm 직경의 문화 튜브에 아르곤의 스트림 또는 질소 가스를 사용하여 지질을 건조. 지질의 소량, ≤ 0.5 밀리그램, 그 결과 영화는 직접 잔류 용매를 제거하기 위해 0.5 시간 동안 진공 상태로 배치 한 후 수화 될 수 있으며, 2.5 단계로 진행합니다. 지질의 큰 금액도 진공 상태에서, 두꺼운 젤 유기 용매를 트랩하는 경향, 그리고 더 나은 동결 건조에 의해 준비가되어 있습니다; 단계 2.3-4를 참조하십시오.
- , 시클로 헥산에 건조 지질 필름을 중단 마개 아르곤과 물개 덮개, 1 시간의 최소 -80 ° C에서 냉각 블록과 동결에 튜브를 놓습니다.
- 진공 시스템의 추위 블록과 지질 샘플을 배치100 mTorr의에 도달 할 수. 진공을 적용, 그것은 용매 고상하게 오프로 약 1 토르에서 "정지"됩니다. 일단 용매가 완전히 (~ 1 시간) 제거 진공이 수준 이하로 떨어질 것이다. 불활성 가스로 진공을 해제하고 즉시 튜브 또는 수화물을 밀봉하십시오.
- 지질은 진공 반면, 가스를 수화 버퍼는 진공을 사용하여 15-17 불어 내면.
- 최종 농도가 1-10 MG / ML에서 탈기 버퍼를 사용하여 지질 수화물. 천천히 수화 지질을 허용합니다. 후 30 분 - 1 시간, 남은 덩어리를 분해하는 소용돌이. 완전한 수화를 허용하도록 추가 0.5-1 시간을 기다립니다. 다음 단계 완전 탈수를 방지하는 등 최대 200 mm까지 소르비톨 또는 자당으로, osmoticant을 사용합니다.
- 압출 100-200 nm의 직경 리포좀을 준비합니다. 자세한 내용은 제조업체의 압출 프로토콜을 참조하십시오. 버퍼가 ~ 25 mM의 이온 강도 또는 특수 electroformation 전압 프로토콜보다가 4 장에서 필요한 것이 있어야합니다.
3.작은 리포좀의 제어 탈수에 의한 지질 증착
- 주의 : 우리의 프로토콜은 지질이 많은 시간 동안 포화 소금 용액과 증기 평형에 배치해야합니다. 우리는 강하게 글로브 박스 또는 유사한 인클로저를 사용하여 불활성 가스 분위기에서 프로토콜을 수행하는 것이 좋습니다.
- 주의 : 단백질을 포함하는 샘플을 준비하는 경우, 완전한 탈수를 방지. 수화물은 따뜻한 물 비커에있는 모든 인클로저의 분위기 나 sonicator 기반의 가습기. 적어도 30 %의 상대 습도가 있는지 확인하기 위해 습도계를 사용합니다. 총 탈수를 방지하기 위해 추가 조치로 작은 리포좀 버퍼에 소르비톨이나 자당을 사용합니다.
- 적절한 상대 습도 포화 소금 용액을 준비합니다. 대상 습도 소포 준비의 삼투압에 따라 달라집니다. 낮은 삼투압의 소포 준비가에 적절하게 탈수 할 수있는 동안 생리적 삼투압과 준비를 위해, 30-45 % RH를 사용75~90% RH (표 1 참조)와 평형.
- 내부 선반 단단히 밀봉 용기에 포화 소금 용액 과잉 소금을 넣어. 아주 잘 한 요구르트 작업을위한 상용 식품 용기. 작성 후 선반을 교체하고 있는지 유체가 선반 아래 5~10mm다는 것을 확인한다.
- 제 1과 깨끗한 ITO 코팅 된 슬라이드. 전도성면을 확인, 샘플 이름으로 비전 도성 쪽 레이블을 멀티 미터를 사용합니다.
- 그리스를 살짝 발라 하나 또는 여러 개의 구멍 실리콘 (USP 등급 VI) 가스켓 (들)의 양쪽.
- 벤치에 슬라이드 전도성 측면을 놓고 electroformation 장치에 연결하기 위해 한쪽 끝에 노출 된 슬라이드 5 mm 이상이 있는지 확인하고, 지질을 적용 할 각 슬라이드에 실리콘 가스켓 (들)을 적용합니다. 좋은 물개를 보장하기 위해 가스켓을 반반하게한다.
- ~ 1-2 밀리그램 / ML에 낮은 소금 isosmotic 버퍼에 소포 준비를 희석. 우리는 더 높은 concentr을 찾을 수관리 포인트 가난한 결과를 생성합니다.
- 1-10 μL 방울의 슬라이드에 지질을 적용합니다. 작은 방울은 일반적으로 더 나은 결과를 생성합니다.
- 포화 소금 용액 위의 내부 선반에 슬라이드를 삽입하고 단단히 밀폐한다. O / N으로 3 시간 동안 RT에서 남겨 컨테이너는 ° C 4에 배치 할 수 있지만, 일부 염을 위해 RH 온도, 그리고 추위에 강하게 의존한다는 것을 참고 평형 시간이 증가합니다.
- 그 결과 영화는 거기에 약간의 무지개 광채를 가질 수 있지만, 어떤 경우에는 거의 건조 된 나타납니다. 높은 삼투압 시작 솔루션은 지질 필름이 완전히 건조하는 것이 불가능할 수 있으며,이 부정적인 결과에 영향을 미치지 않을 것이다.
4. 거인 리포좀의 Electroformation
- 특히 지질 필름, 탈수 리포솜에서 형성하는이 쉽게 빠질 수 있습니다.주의 수화물 각 웰은 가스켓의 가장자리에 27 G 주사기 바늘을 삽입하고 천천히 버퍼를 적용하여. 버퍼 수물을 포함 ≤ 200 MM의 자당, ≤ 1 M 소르비톨 ≤ 5 MM의 HEPES. 이상 10 MM 소금 솔루션은 대체 electroformation 전압 프로토콜이 필요할 수 있습니다. ~ 10 % 잘 충진 각 가스켓.
- 참고 : 지질 수화이며, 지질 필름은 즉시 얇은 층으로 갈라 시작 이후 나머지 단계를 신속하게 진행합니다. electroformation이 즉시 시작하면 수익률 및 크기는 극대화된다.
- 한 번의 부드러운 동작으로, 개스킷의 상단에 두 번째 ITO 슬라이드, 전도성 얼굴을 적용합니다. 가스켓 영역 외부와의 첫 번째 오버행 반대 오버행 5 mm 이상을 가지고 있는지 확인하십시오. 좋은 물개를 보장하기 위해 살짝 누르십시오.
- 에탄올을 사용하여 두 개의 돌출부를 청소하고 가스켓에 직면 측면은 멀티 미터를 가진 전도성이 있는지 확인합니다.
- 원하는 경우 챔버는 더 파라 필름 (parafilm) 또는 가벼운 장력 스프링 클립으로 고정 할 수 있습니다.
- , "EMI gask에게 알루미늄 또는 구리 막대를 확보하여 전압 소스에 electroformation 챔버를 연결두 슬라이드의 전도성 표면에 등 거품 "또는 전도성 접착 테이프. 우리는 EMI 개스킷 폼을 사용합니다. 지그 및 클램프 계획 그림 5에 표시됩니다.
- 전기적 접점 사이의 짧고 연락처 멀티 미터를 사용하여 ITO 표면에 올바르게 연결하는이 없는지 확인합니다.
- ° C 최소 10 ° C 42 ° C의 체인 용융 온도보다 52 열, DPPC에 대한 예를 들어, 챔버 (10) ° C 지질의 가장 높은 용융 온도 이상으로 선물을 가열
- 저염 버퍼, 60-90 분 동안 10 Hz의 사인파, 두 ITO 코팅 된 표면 사이의 각 밀리미터 격차 ~ 0.7 V RMS를 적용합니다. 높은 소금 버퍼, 다른 전압 프로토콜 (참고 문헌 참조)를 사용해야합니다.
5. 이미징 및 문제 해결
- 이미지 로다 민 또는 텍사스 레드 염료에 대한 필터 큐브 장착 거꾸로 현미경을 사용하여 리포좀을. 리포좀은 구형해야한다주로 눈으로 unilamellar, 이러한 리포좀에 걸려 "문자열"과 같은 결함.
- 리포좀이 너무 작 으면 적은 지질을 사용합니다.
- 많은 결함이나 몇 리포좀가있는 경우,이 젤 상 지질 때문일 수 있습니다. electroformation 온도를 높이는 것이 좋습니다.
- 거의 또는 전혀 거대한 리포좀 탈수 작은 리포좀의 모든 형성하는 경우, 리포좀 버퍼의 삼투 강도를 줄이거 나 electroformation 버퍼의 삼투 강도를 높일 수 있습니다. 농축 중간 완충 용액에 버퍼의 유입은 입금 지질 필름의 박리가 발생할 수 있습니다.
- 소포 수율, 품질, 또는 크기별로, 그리고 당신이 electroformation 또는 리포좀 버퍼에있는 염분의 pH 버퍼를 포함하는 경우, 다른 electroformation 전압 프로토콜을 고려하십시오. 예를 들어, POTT, 외. 11, 90 분 개최, 50-1,300 Vpp로 / m 30 분에서 전압을 높여, 500 Hz의 정현파를 사용하여 3 단계 프로토콜을 추천합니다N 30-60 분 동안 50 Hz로 주파수를 감소. 백금 티타늄 전극이 경우에 필요할 수 있습니다, 그러나 이것은 실질적으로 프로토콜을 변경하지 않습니다.
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Representative Results
우리의 예제에서, 우리는 약 55 몰 % POPC (1 파르 미트-2-oleoyl-SN-팔미 - 포스 포 콜린), 15 몰 % POPS (1 파르 미트-2-oleoyl-SN-팔미-phosphoserine의 혼합물에서 리포좀을 준비 , 30 몰 % 콜레스테롤, 0.1 몰 % 텍사스 1,2 - dipalmitoyl-SN-phosphoethanolamine (TXR-DPPE) 레드 라벨.이 구성은 18 신경절 (dorsal root ganglion) 지질의 약 대표로 선택되었다. 우리는 15 몰 %가 청구주의 지질 (여기 POPS)는 (예를 들어, 발데 등. 4) electroformation에서 사용할 수있는 것의 한계 근처에 있습니다.
가수 분해 및 과산화에 의한 지질 분해는 많은 지질 혼합물 많은 중요한 실험 (토론 참조) 특히 중요한 문제입니다. 혼자 명확성을 위해, 우리는 비디오를 프레젠테이션에 불활성 가스 분위기를 사용하지 마십시오. 아래 그림에서 분명하기 때문에,이 눈에 띄게 나 리포좀의 품질에 영향을하지만, 중요한 연구에되지 않습니다고도 불포화 지질을 사용하는 경우는 지질의 고장을 방지하는 것이 중요합니다.
electroformation의 주요 장애물은 건조가 중요한 때 지질 영화는 어떠해야하는지 알고, 인듐 - 주석 산화물 (ITO) 기판에 좋은 지질 필름을 형성 할 수 있기 때문에. 그러나 electroformation가 실패 할 때, 그것은 종종 느낄 수 없습니다 거대한 리포좀 생산의 결과로, 너무 완전하지 않습니다. 자주, 상당한 암설을 준수해야합니다, 이것은 일반적으로 너무 많은 지방이 사용되었음을 나타냅니다. 우리의 그림은 하나의 성공을보고 무엇을 기대 보여줍니다.
그림 2는 클로로포름에서 증착 된 지질에서 전주 리포좀의 두 가지 패치를 보여줍니다. 왼쪽 패널에서 밀접 화살 2, 3으로 표시된 패치를 검사합니다. 화살표 2 제대로 구별 리포좀과 패치를 나타내며, 어떤 리포좀은 화살표 3로 표시된 영역에 초점을 반입 할 수 없습니다. 함께, 이러한 연구 결과는 일반적으로 가난을 나타냅니다너무 많은 지질되고있다 때문인 준비,이 지역에 보관. 오른쪽 패널에서, 예 : "퍼지"지역은 일반적으로 더 나은 준비를 나타내는 덜 일반적입니다. 우리는 완전히 같은 결함을 제거하는 드문 찾을 수 있습니다.
그림 3은 성공적으로 지질에서 전주 리포좀은 두 개의 배율 작은 리포좀의 탈수에 의해 증착 텍사스 레드 epifluorescence에를 사용하여 몇 군데 보여줍니다. 리포좀은 드문 드문 있지만, 몇 가지 좋은 표본이 있습니다. 크기가 다르기 때문에 여러 초점이 있습니다. 화살표는 40X 배율 이미지에 나타나는 중 두 ~ 5-20 μm의에서 크기에 이르기까지 세 가지 좋은 품질의 리포좀을 나타냅니다. 가장자리에 분명히 "링"을 참고 :이 unilamellar 또는 거의 unilamellar 리포좀을 나타냅니다. 지질의 일부 반점 지질을 축소하거나 형성되지 않을 것으로 보이지만, 이것은 좋은 품질의 결과입니다.
마지막으로,이 프로토콜을 개발 및 게시에있는 우리의 목적기존 패치 - 클램프 전기 생리학에 적합 그대로, 기능 포유 동물의 이온 채널을 GUVs을 준비하는 것입니다. 그림 4에서 우리는이 프로토콜을 사용하여 형성 GUVs에서 절제 지질 막 패치에 기록 된 캡사이신 활성화 TRPV1 이온 전류를 보여줍니다. 현재는 루테늄 레드에 의해 차단 될 수 있으며, 캡사이신 차량 (0.1 % 에탄올, 138 mM의 NaCl을, 3 mM의 HEPES 산도 7.4) 혼자가 활성화되지 않습니다. 전기 생리학 실험 proteoliposomes의 준비까지 본 의정서의 범위를 벗어나지 만 제출 문서의 주제이다.
| 소금 | 몰랄 농도 @ 20 ° C, 채도 | % RH @ 10 ° C | % RH @ 20 ° C | % RH @ 30 ° C |
| 염화 마그네슘 육수화물 | 5.8 | 33 | 33 32 | |
| 탄산 칼륨 이수화 | 8.0 | 47 | 44 | 42 |
| 나트륨 평범한 사람 | 4.6 | 58 | 57 | 57 |
| 제이 구리 염화물 | 5.6 | 68 | 68 | 67 |
| 나트륨 염화물 | 6.13 | 75 | 75 | 75 |
| 칼륨 염화물 | 4.61 | 87 | 86 | 84 |
표 1. 몇 가지 일반적인 소금의 상대 습도 (% RH) 그린스펀 19 랜드 20에서 상대 습도 데이터;. 국제 크리티컬 표 21에서 포화 데이터입니다.
그림 1. 작은 리포좀의 거대한 리포좀 electroformation의 개략도. (왼쪽 위) 작은 리포솜은 작은 물방울의 배열에 입금됩니다 <5 μL. (상단 중앙) 리포좀은 포화 소금 용액 위의 밀폐 용기에 그들을 배치하여 통제 상대 습도에 따라 건조합니다. 습도계는 선택 사항입니다. 지질의 끈적 끈적한 필름 (오른쪽) 일단 탈수와 (아마도) 같은 소르비톨과 같은 osmoticant은 지질 (프로토콜 5 장 참조) 삼투압 버퍼에 재수 있습니다. (왼쪽 하단) electroformation 챔버는 상단에 두 번째 ITO 슬라이드로 밀봉되어 있습니다. (오른쪽 하단) 마지막으로, 챔버 지질 체인 용융 온도 이상으로 가열, 두 ITO 슬라이드에 걸쳐 진동 전기장을 제공하는 신호 소스에 연결되어 있습니다.
그림 3. 전주 거대한 리포좀 탈수 퇴적 지질. (왼쪽) 배 배율에서의 형성, 여러 리포좀을 볼 수 있습니다. 세 리포좀이 표시되어 있습니다. 같은과 40 배 배율에서 왼쪽으로 (오른쪽) 동일한보기,리포좀 (2와 3)로 표시. 이러한 리포좀의 수는 일반적으로 용제 입금 지질에서 전주 때보다 훨씬 작지만, 많은 목적을 위해 완전히 적합합니다. 크로마 41004 텍사스 레드 필터 큐브 스탠포드 Photonics의 XR/MEGA-10 S30 강화 및 CCD 카메라가 장착 거꾸로 epifluorescence에 현미경을 사용하여 몇 군데. 
그림 4. GUV에서 적출 막 패치에 기록 된 현재의 캡사이신 활성화 TRPV1이 프로토콜을 사용하여 형성. A. 누설 전류는 캡사이신이 추가되기 전에 500 MΩ 저항을 밀봉 지적했다. B. 포화 캡사이신은 (> 20 μM, 0.1 % 에탄올) 활성화 큰 TRPV1 현재;. 현재는 루테늄 레드에 의해 차단되고 (데이터가 표시되지 않음)에 단독 (버퍼 0.1 % 에탄올) 차량으로 활성화되지 C. 현재의 반환캡사이신이 패치에서 세척되는 기준을 가까운. 
그림 5. electroformation 챔버 계획. 포함하여 전체 어셈블리를 보여주는 개요이며, 상단과 하단 플라스틱 조각 설계도를 치수. 아크릴 또는 다른 쉽게 가공 투명 플라스틱을 사용합니다. 얇은 폴리이 미드 필름 히터 온도 조절기 (특정 시약 및 장비의 표 참조)에 연결해야하며, EMI 개스킷 폼은 정현파 신호가 두 개의 ITO 코팅 된 슬라이드에 적용 될 수 있도록, 함수 발생기에 연결해야합니다. 구멍 온도 프로브를 위해 제공됩니다. 납작한 10-32 나사는 아래 부분에있는 카운터 싱크 구멍에 배치하고, 상단 부분을 통과하고 있습니다. 10-32 너트 조립품을 고정하는 데 사용됩니다. 때 완전히 같은조립 된, 상단 및 하단 플라스틱 조각 양면 (병렬 EMI 개스킷합니다.면)에 서로 플러시해야 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
거대한 리포좀의 Electroformation은 다양한 지질, 준비하고, 버퍼와 호환 유연한 기술로 개발했다. 지질 증착 공정의주의 깊은 관리가 성공에 가장 중요합니다. 우리는 작은 리포좀 제제 간단한 프로세스에서 지질 조절 증착하기 위해 간단한 도구를 발표했다. 상대 습도는 초기 리포솜의 적절한 탈수 중요하며, 최적의 값은 리포좀 현탁액 용질의 초기 농도가 달라집니다. 낮은 상대 습도는 적절한 수준에 더 집중 샘플을 탈수하는 데 필요합니다.
electroformation에 사용되는 정확한 수화 프로토콜과 전기장 토론 1,4,7,10,11,22의 점 남아있다. 간단한 프로토콜은 높은 소금 농도, 충전 지질, 또는 용융 매우 높은 농도의 존재 리포좀 electroformation을 시도하기 전에 먼저 마스터해야합니다온도 지질 ING. 초기 부종, 성장, 그리고 분리 : 그 기술을 마스터하고 나면, 더 진보 된 프로토콜은 일반적으로 세 부분으로 electroformation 프로세스를 나눕니다. 초기 부종은 서서히 전기장에게 11의 증가에 의해 선호 될 것으로 보인다. 고정 필드 강도 두 번째 옵션 단계는 리포좀의 최종 크기를 제어 할 수 있습니다. 마지막으로, 진동 필드의 주파수를 낮추면 ITO 표면에서 리포좀을 분리하는 데 도움이 될 수 있습니다. 높은 주파수는 생리 식염 조건 11 리포좀을 전주하는 데 필요한 있지만, 리포좀은 필드 주파수와 진폭 (10)의 매우 넓은 범위에 걸쳐 형성 될 수있다.
거대한 리포좀은 저자 삼투 버퍼 7 탈수 리포솜의 재수에 저절로 형성 할 것으로 관측 성공에 여러 개의 키를 나타냅니다. 첫째, 리포좀 팽창 과정은 그렇게 electroformation를 들어, 일부, 즉시 시작그룹도 지질 필름 (10)을 재수하기 전에 AC 전기장을 적용하는 것이 유용 발견했습니다. 둘째, 유체 흐름 리포솜 붓기 프로세스를 구동 가능성이 높습니다, 그리고 electroformation는 적어도 때문에 전기 삼투 구동 흐름의 한 부분에서 발생합니다. 이 장소 electroformation 10에서 사용할 수있는 유용한 주파수와 진폭 범위에 대한 제한.
지난 몇 년 동안 논의의 주요 포인트는 지질 가수 분해 및 과산화 23,24의 가능성이다. 어떤 종류의 지질 저하에 대한 첫 번째 방어는 GUV 준비에 사용되는 모든 재료 산소를 제거하는 것입니다 과산화 산소 분자 23 일에 의존하기 때문에이 상당히 진행을 느리게한다. 불활성 가스 진공 불어 내면의 조합은 가능한 15-17만큼 산소를 제거하는 데 사용되어야한다. 초음파와 빛의 진공 효과입니다. 우리는 V에 산소 테스트 키트 (Chemetrics K7501)를 사용우리는 가능한 한 철저 산소를 제거했는지 erify. 가수 분해 유독 더 있지만, 중성 pH 25을 유지하여 및 electroformation 24에서 사용되는 전압을 줄임으로써 줄일 수있다. 몇몇 저자는 ITO 대신에 티타늄 전극의 사용 23,24,26,27 슬라이드 옹호. 그것은 과거에 리포좀 실험 28,29을 방해하는 것으로 알려져있다 때문에 우리는 티타늄 (또는 금속) 우리의 샘플을 오염 가능성을 방지하는 것을 선호하지만, 일부 과산화 또는 가수 분해 효과를 방지하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그것은 높은 온도에 장시간 노출 지질 고장 30을 가속화한다는없이갑니다. 마지막으로, 얇은 층 크로마토 그래피 24,31, 비색 분석 23 다른 방법 31 지질 저하를 정량화하기 위해 존재합니다.
유사한 문제는 특히 측면 상 분리 30,32의 연구에, 이미지 GUVs하는 데 사용되는 형광 지질 염료에 관한 30,33 선택해야하며, 최소한의 농도로 사용됩니다.
우리는 ITO 전극 슬라이드를 재사용 할 수 있는지 여부에 대한 합의를 인식하지 않습니다. 일부는하지 않지만 대부분의 그룹은 그들의 ITO 슬라이드를 재사용한다. 최근 작품은 슬라이드가 시간이 지남에 따라 저하 할 것을 나타냅니다 있지만, 고성능 34 회복 단련 할 수 있으며이 저하 zwitterionic 또는 음이온 성 지질을 포함한 지질 혼합물의 단지 작은 영향을 미쳤다지만, 양이온 성 지질을 포함하는 혼합물 중요했습니다. 우리는 어닐링없이 우리의 슬라이드를 재사용 할 수 있습니다.
거대한 리포좀, 이론적 이해와 기술을 가진 실제적인 경험을 전주하는 데 사용되는 프로토콜에 큰 변화가 있지만, 지속적으로 개선되고있다. 이미 리포좀가 부과 지질, 또는 높은 소금 버퍼에 대량으로 형성 될 수있다. 키는 어느 것이, 전극 표면에 지질 효율적으로 증착 유지시간은 우리의 프로토콜의 핵심입니다.
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Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 electroformation 장치 구축을위한 브라이언 Venema의 에릭 마틴 슨 감사합니다. 이 작품은 건강의 국립 연구소의 일반적인 의료 과학 국립 연구소에서 보조금 (SEG에 R01GM100718) 및 보건 국립 연구소의 국립 안과 연구소 (SEG에 R01EY017564)에 의해 재정 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digital Multimeter | Agilent Technologies, www.agilent.com | U1232A or similar | Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test. |
| Fluke | 117 or 177 | Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test. | |
| Function Generator | Agilent Technologies, www.agilent.com | 33210A or similar | Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 Ω load |
| ITO coated glass slides | Delta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.com | CB-90IN-S107 or similar | Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm |
| Temperature controller | Omega Engineering Stamford, CT www.omega.com | CNi3233 or similar | |
| Hygrometer | Extech, Nashua, NH, www.extech.com | 445815 | |
| Silicone rubber sheet | McMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com | 87315K64 | Use USP Grade VI silicone for its high purity |
| EMI gasket | Laird Technologies www.lairdtech.com | 4202-PA-51H-01800 or similar | Distributed by Mouser www.mouser.com |
| TxR-DHPE | Life Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.com | T1395MP | Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable. |
| POPC | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL www.avantilipids.com | 850457P or 850457C | Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C) |
| POPS | Avanti Polar Lipids | 840034P/C | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 |
References
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