Summary
पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी साथ संयुक्त परिभाषित रचना की विशाल liposomes में कार्यात्मक झिल्ली प्रोटीन पुनर्गठन एक शक्तिशाली तरीका है. हालांकि, पारंपरिक विशाल liposome उत्पादन प्रोटीन स्थिरता के साथ असंगत हो सकता है. हम शुद्ध लिपिड या आयन चैनल युक्त छोटे liposomes से विशाल liposomes के उत्पादन के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन है.
Abstract
electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए रासायनिक परिभाषित लिपिड झिल्ली में आयन चैनल के पुनर्गठन इन महत्वपूर्ण प्रोटीन के समारोह की पहचान और पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक से किया गया है. हालांकि, इस तरह के तलीय bilayers रूप में शास्त्रीय तैयारी, पुनर्गठन चैनल और इसकी झिल्ली पर्यावरण पर प्रदर्शन किया जा सकता है कि जोड़तोड़ और प्रयोगों की सीमा. विशाल liposomes की अधिक सेल जैसी संरचना लिपिड पर्यावरण का नियंत्रण त्याग के बिना पारंपरिक पैच दबाना प्रयोगों परमिट.
Electroformation एक इलेक्ट्रोड सतह पर जमा एक पतली, आदेश दिए लिपिड फिल्म के लिए वोल्टेज बारी के आवेदन पर निर्भर करता है जो व्यास में विशाल liposomes> 10 माइक्रोन का उत्पादन करने के लिए एक कुशल मतलब है. शास्त्रीय प्रोटोकॉल कार्बनिक विलायकों से जमा किया जा लिपिड के लिए कहता है हालांकि, बाद से, यह आयन चैनलों की तरह कम मजबूत झिल्ली प्रोटीन के साथ संगत नहीं है और संशोधित किया जाना चाहिए. हाल ही में, जनसंपर्कotocols हम हमारी प्रयोगशाला में प्रोटीन युक्त liposomes के लिए अनुकूल है जो आंशिक रूप से निर्जलित छोटे liposomes, से विशाल liposomes electroform के लिए विकसित किया गया है.
हम यहाँ पृष्ठभूमि, उपकरण, तकनीक, और छोटे liposome dispersions से विशाल liposomes की electroformation के नुकसान से प्रस्तुत करते हैं. हम पालन कि अधिक चुनौतीपूर्ण प्रोटोकॉल का प्रयास करने से पहले पहले महारत हासिल किया जाना चाहिए जो क्लासिक प्रोटोकॉल, के साथ शुरू करते हैं. हम संतृप्त नमक समाधान के साथ वाष्प संतुलन का उपयोग कर छोटे liposomes की नियंत्रित आंशिक निर्जलीकरण की प्रक्रिया का प्रदर्शन. अंत में, हम electroformation खुद की प्रक्रिया का प्रदर्शन. हम उच्च गुणवत्ता वाले liposomes के उत्पादन, और सबसे अच्छा परिणाम सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक स्तर पर तैयारी का निरीक्षण दृश्य का वर्णन करने के लिए घर में बनाया जा सकता है कि सरल, सस्ता उपकरण का वर्णन करेंगे.
Introduction
विशालकाय liposomes (अक्सर विशाल unilamellar फफोले, या GUVs कहा जाता है) मुख्य रूप से बाईलेयर विरूपण, पार्श्व चरण सह - अस्तित्व ("rafts"), झिल्ली संलयन, आदि 1-4 की पढ़ाई सहित लिपिड bilayers के भौतिक विज्ञान और भौतिक विज्ञान, रसायन शास्त्र का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. आसानी से आसपास के जलीय बफर से अलग किया जा सकता है जो एक जलीय आंतरिक आसपास झिल्ली की गोलाकार खोल: वे एक निहायत सेल जैसी संरचना है. वे, परिभाषा से, व्यास में ≈ 1-100 माइक्रोन, ताकि वे प्रकाश माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण की एक किस्म का उपयोग imaged किया जा सकता है कर रहे हैं. वे आम तौर पर नरम है, जबकि उनके गुणों आसान से निपटने के लिए चालाकी से किया जा सकता है, ताकि आसमाटिक ढ़ाल या यंत्रवत् लागू तनाव का उपयोग कर तना हुआ बनाया जा सकता है. विशेष रूप से, liposome के "कठोरता" इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए "liposome संलग्न" या excised पैच फार्म करने के लिए इसे सरल बनाता नियंत्रित. अतीत में, आयन चैनल पुनर्गठन काफी हद तक तलीय लिपिड ख में प्रदर्शन किया गया थाilayers. अब, विशाल liposomes से पैच फार्म और पारंपरिक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए विकसित उपकरण का काफी तरकश (प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, micropipette आकांक्षा, तेजी से छिड़काव और तापमान नियंत्रण, आदि) का उपयोग करने की क्षमता पुनर्गठन पढ़ाई 5,6 के लिए विशाल liposomes के तेजी से आकर्षक बनाता है.
विशालकाय liposomes के कई रणनीतियों द्वारा किया गया है. एक सूखे लिपिड फिल्म 4,7,8 rehydrated है जब वास्तव में, विशाल liposomes के एक सूजन प्रक्रिया से अनायास रूप में. और अधिक तेजी से बड़ा तैयार करने की इच्छा, अधिक वर्दी liposomes electroformation 1,9 उन के बीच मुख्य अन्य दृष्टिकोण के लिए शोधकर्ताओं ने नेतृत्व किया. Electroformation भी एक सूखे लिपिड फिल्म की हाइड्रेशन पर निर्भर करता है, लेकिन लिपिड फिल्म में एक oscillating बिजली क्षेत्र के आवेदन के माध्यम से प्रक्रिया को गति. क्षेत्र या पानी से अलग कर दिया, दो इलेक्ट्रोड, प्लैटिनम तार या तो या ईण्डीयुम टिन ऑक्साइड (आईटीओ) लेपित गिलास स्लाइड के माध्यम से लागू किया जाता हैबफर और जो पर लिपिड जमा कर रहे हैं. Liposomes की सूजन तेजी से, एक बड़ा liposomes की एक उच्च उपज प्राप्त होता है. इस प्रकार, electroformation विशाल liposomes 4 का उत्पादन करने के लिए डिफ़ॉल्ट तरीका बन गया है.
electroformation का तंत्र पूरी तरह समझ नहीं है, और प्रोटोकॉल के अधिकांश (जैसे 10,11) अनुभव से विकसित कर रहे हैं. बहरहाल, हम सिद्धांत और कुछ अनुभवजन्य परिणाम पर विचार से क्या उम्मीद करने के बारे में एक छोटे से सीख सकते हैं. यह व्यापक रूप से electroformation जमा लिपिड फिल्म 10,11 में खड़ी व्यक्ति लिपिड bilayers के बीच बफर के विद्युत आसमाटिक प्रवाह ड्राइविंग से होता है कि माना जाता है. लिपिड bilayers के थर्मल उतार चढ़ाव के इलेक्ट्रोस्टैटिक युग्मन भी शायद 12 शामिल है. ये परिकल्पना गुणात्मक 10,12 इस्तेमाल किया जा सकता है कि बिजली के क्षेत्र आवृत्ति और ताकत के लिए ऊपरी सीमा का अनुमान है. विशेष रूप से, यह है कि उच्च चालकता समाधान भविष्यवाणी की है (
हालांकि, झिल्ली प्रोटीन तो एक पतली लिपिड फिल्म छोड़ने के लिए बंद कर सुखाया जाता है जो कार्बनिक विलायकों में अर्थात्, electroswelling प्रक्रिया के लिए इलेक्ट्रोड पर लिपिड जमा करने की सामान्य विधि के साथ असंगत होने की संभावना है. इस कठिनाई के चारों ओर दो प्रमुख रास्ते हैं: विशाल liposome गठन के बाद प्रोटीन को शामिल करने, या लिपिड जमा कर रहे हैं कि कैसे अनुकूलित करने के लिए. हमारा दृष्टिकोण लिपिड और reconsti जमा करने के लिए दूसरों 5,11 पर बनाता हैछोटे या बड़े "proteoliposomes" के निलंबन से एक साथ झिल्ली प्रोटीन tuted. हम (कोलिन्स और गॉर्डन, समीक्षा में) कहीं प्रोटीन और लिपिड शुद्ध से proteoliposomes उत्पादन का लंबा और अधिक चुनौतीपूर्ण प्रक्रिया का वर्णन है. यहाँ हम किसी भी प्रोटीन के अभाव में प्रोटोकॉल का वर्णन है, लेकिन प्रोटीन को शामिल किया जाता है तो यह एक ही है, हम आयन चैनल TRPV1 युक्त proteoliposomes GUVs में तब्दील और पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि दिखाने के परिणाम शामिल हैं. किसी भी electroformation दृष्टिकोण में, लिपिड बयान प्रक्रिया के दौरान लिपिड नमूना के दृश्य निरीक्षण सफलता के लिए महत्वपूर्ण है.
हमारा दृष्टिकोण आयन चैनल के पुनर्गठन के लिए विशेष आवेदन परे प्रासंगिक हो सकता है. हम पहली बार इस प्रोटोकॉल विकसित और अब, यह भी लिपिड electroformation के लिए इलेक्ट्रोड पर जमा कर रहे हैं जिस तरह परिणामस्वरूप GUVs की compositional विविधता को प्रभावित करता है कि कैसे दिखाया गया है के बाद से समय में. Baykअल Caglar एट अल. 14 ध्यान से निर्जलित liposomes के गठन से GUVs विभिन्न phospholipids और कोलेस्ट्रॉल के मिश्रण से बनाई GUVs की miscibility संक्रमण के तापमान में 2.5 गुना छोटे बदलाव किया था कि पता चला है. उनके काम को लिपिड मिश्रण से लिपिड, और विशेष रूप से कोलेस्ट्रॉल, मई तलछट जमा लिपिड फिल्म की संरचना में बड़े स्थानिक विभिन्नता में जिसके परिणामस्वरूप, कार्बनिक विलायकों से जमा जब कि इंगित करता है. इस लिपिड झिल्ली चरण व्यवहार के अध्ययन के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, लेकिन यह भी आयन चैनल समारोह पर मात्रात्मक प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है. Baykal-Caglar एट अल. के प्रोटोकॉल के समान है लेकिन हमारे ही समान नहीं है, और पाठकों के रूप में यह अच्छी तरह से अध्ययन करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है.
इस प्रोटोकॉल (सिंहावलोकन, चित्रा 1 देखें) का उपयोग किया जा सकता है कि कई में से एक है. सिद्धांत electroformation सफलता में लिपिड मिश्रण, हाइड्रेशन, तापमान, अन्य विलेय (विशेष रूप से आयनों), और पर निर्भर करता हैनिर्माण में इस्तेमाल किया पाठ्यक्रम वोल्टेज और आवृत्ति. Electroformation बेहतर समझ हो जाता है, हम और अधिक हमारे प्रोटोकॉल को परिष्कृत करने की उम्मीद है.
अंत में, विशाल liposomes electroforming में एक तेजी से सीखने की अवस्था होती है. हम लिपोसोमल निलंबन (धारा 2-5) से लिपिड जमा करने के लिए सीखने से पहले माहिर पारंपरिक प्रोटोकॉल (धारा 1 और 4, और, यदि आवश्यक हो, धारा 5) का सुझाव देते हैं.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. कार्बनिक सॉल्वैंट्स से लिपिड का बयान: शास्त्रीय प्रोटोकॉल
- . -20 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण से लिपिड निकालें, आरटी के लिए गर्म सावधानी: लिपिड अत्यंत हीड्रोस्कोपिक हैं, और कई ऑक्सीजन के प्रति संवेदनशील हैं. शुष्क आर्गन या नाइट्रोजन गैस में लिपिड कवर और सभी चरणों में हवा के लिए जोखिम को कम.
- यदि आवश्यक हो, मिलीग्राम / एमएल 1-10 पर क्लोरोफॉर्म या cyclohexane में लिपिड निलंबित, निर्माता ने कहा सांद्रता ही चेतावनी आम तौर पर नाममात्र हैं उस पर ध्यान दें:. कार्बनिक विलायकों का उपयोग करते समय उपयुक्त दस्ताने और अन्य व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें. सबसे अधिक सामग्री अभी भी इन विलायकों को प्रवेश के योग्य हैं और वे केवल अस्थायी सुरक्षा प्रदान के रूप में विलायक, उन पर गिरा दिया जाता है, तो जल्दी से पीपीई निकालें.
- इथेनॉल के साथ दो 25 x 37.5 मिमी आईटीओ लेपित गिलास स्लाइड के दोनों ओर साफ
- वांछित दाढ़ अनुपात प्राप्त करने के लिए लिपिड मिलाएं. प्रत्येक 1 सेमी के लिए आईटीओ के क्षेत्र के 2 होंठ के साथ लेपित किया जा करने के लिए स्लाइडआईडी, मिश्रण ~ लिपिड की 15-20 ग्राम. . दोनों 25 x 37.5 मिमी स्लाइड पूरी तरह से लेपित हो रहे थे अगर उदाहरण के लिए, हम आम तौर पर 10 मिलीग्राम / एमएल लिपिड मिश्रण नोट के 30 μl का प्रयोग करेंगे: टेक्सास फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए लाल DPPE, और के लिए नीचे देखने के बारे में चेतावनी देते 0.1 मोल% जोड़ फ्लोरोसेंट रंजक.
- गिलास स्लाइड के आईटीओ लेपित पक्ष एक ohmmeter या मल्टीमीटर के साथ सतह प्रतिरोध को मापने के द्वारा सामना करना पड़ रहा है सत्यापित करें.
- . एक विलायक प्रतिरोधी सिरिंज सावधानी में लिपिड महाप्राण: नहीं गोंद या PTFE अलावा अन्य प्लास्टिक,, कार्बनिक विलायक से संपर्क करना चाहिए.
- सिरिंज सुई काफी इतो सतह को छू नहीं के साथ, धीरे धीरे स्लाइड भर में आगे और पीछे की सुई आगे बढ़ लिपिड लागू होते हैं. कांच की सतह पर एक "इंद्रधनुष चमक" की तलाश में, समान रूप से के रूप में सतह को कवर किया.
- किसी भी ट्रेस विलायक हटाने के लिए 0.5-1 घंटे के लिए <1 Torr (1 एमएमएचजी) के तहत निर्वात जल्दी स्लाइड रखें. अक्रिय गैस के साथ वैक्यूम रिलीज.
- एक साथ, एक सिलिकॉन गैसकेट लागू करेंदोनों पक्षों पर सिलिकॉन वैक्यूम तेल की पतली परत. स्लाइड के एक छोर पर उजागर खुला स्लाइड की कम से कम 5 मिमी छोड़ दें.
- धारा 4 के लिए तुरंत आगे बढ़ें.
2. नियंत्रित निर्जलीकरण के लिए लघु Liposome तैयारी
- कदम 1.1 में के रूप में 1.4 के लिए लिपिड मिश्रण तैयार करें.
- एक 10-15 मिमी व्यास संस्कृति ट्यूब में एक आर्गन की धारा या नाइट्रोजन गैस का उपयोग लिपिड सूखी. लिपिड की कम मात्रा के लिए, ≤ 0.5 मिलीग्राम, जिसके परिणामस्वरूप फिल्म सीधे अवशिष्ट विलायक हटाने के लिए 0.5-1 घंटे के लिए वैक्यूम के तहत इसे रखने के बाद हाइड्रेटेड हो सकता है, 2.5 कदम आगे बढ़ना. लिपिड की बड़ी मात्रा में भी वैक्यूम के तहत, एक मोटी जेल में कार्बनिक विलायकों फंसाने के लिए करते हैं, और बेहतर lyophilization के द्वारा तैयार किया जाता है, कदम 2.3-4 देखें.
- , Cyclohexane में सूखे लिपिड फिल्म सस्पेंड एक डाट के साथ आर्गन और सील के साथ कवर, 1 घंटा न्यूनतम के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर एक ठंड ब्लॉक और फ्रीज में ट्यूब जगह.
- एक निर्वात प्रणाली में ठंड ब्लॉक और लिपिड नमूना रखें100 mTorr तक पहुंचने में सक्षम. वैक्यूम लागू करें, यह विलायक sublimes बंद के रूप में 1 के बारे में Torr पर "दुकान" होगा. एक बार विलायक पूरी तरह से (~ 1 घंटा) निकाल दिया जाता है निर्वात इस स्तर के नीचे छोड़ देंगे. अक्रिय गैस के साथ निर्वात छोड़ दें और तुरंत ट्यूब या हाइड्रेट सील.
- लिपिड वैक्यूम के तहत कर रहे हैं, देगास हाइड्रेशन बफर निर्वात का उपयोग करते हुए और 15-17 sparging.
- अंतिम एकाग्रता 1-10 मिलीग्राम / एमएल degassed बफर का उपयोग लिपिड हाइड्रेट. धीरे हाइड्रेट करने के लिए लिपिड की अनुमति दें. के बाद 30 मिनट 1 घंटा, शेष clumps को तोड़ने के भंवर. पूरा हाइड्रेशन के लिए अनुमति देने के लिए एक अतिरिक्त 0.5-1 घंटे तक प्रतीक्षा करें. नीचे दिए गए चरणों में पूरा निर्जलीकरण को रोकने के लिए, इस तरह के ऊपर 200 मिमी तक sorbitol या sucrose के रूप में, एक osmoticant का प्रयोग करें.
- बाहर निकालना द्वारा 100-200 एनएम व्यास liposomes तैयार. जानकारी के लिए निर्माता की जगह लेना प्रोटोकॉल देखें. बफर ~ 25 मिमी ईओण ताकत, या विशेष electroformation वोल्टेज प्रोटोकॉल से भी कम समय धारा 4 में की जरूरत होगी आपके पास आवश्यक ध्यान दें.
3.लघु Liposomes की नियंत्रित निर्जलीकरण से लिपिड का बयान
- सावधानी: हमारी प्रोटोकॉल लिपिड कई घंटे के लिए संतृप्त नमक समाधान के साथ वाष्प संतुलन में रखा जा करने की आवश्यकता है. हम दृढ़ता से एक दस्ताना बॉक्स या इसी तरह के बाड़े का उपयोग कर, एक आभ्यांतरिक गैस वातावरण में प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने की सलाह देते हैं.
- सावधानी: प्रोटीन युक्त नमूने की तैयारी करते हैं, तो पूरी निर्जलीकरण से बचने के. हाइड्रेट गर्म पानी की एक बीकर के साथ किसी भी बाड़े में वातावरण, या एक sonicator आधारित ह्यूमिडीफ़ायर. कम से कम 30% सापेक्ष आर्द्रता वहाँ सुनिश्चित करने के लिए एक आर्द्रतामापी का प्रयोग करें. कुल निर्जलीकरण को रोकने के लिए एक अतिरिक्त एहतियात के रूप में छोटे liposome बफर में sorbitol या सुक्रोज का प्रयोग करें.
- उपयुक्त सापेक्ष आर्द्रता की एक संतृप्त नमक घोल तैयार करें. लक्ष्य नमी पुटिका तैयारी की परासारिता पर निर्भर करता है. कम परासारिता पुटिका तैयारी में पर्याप्त रूप से निर्जलित हो सकता है, जबकि शारीरिक परासारिता साथ तैयारियों के लिए, 30-45% आरएच उपयोग75-90% आरएच (1 टेबल भी देखें) के साथ संतुलन.
- एक इंटीरियर शेल्फ के साथ एक कसकर sealable कंटेनर में संतृप्त नमक समाधान और अधिक नमक डाल दिया. बहुत अच्छी तरह से दही और ग्रेनोला काम के लिए वाणिज्यिक खाद्य कंटेनर. भरने के बाद शेल्फ बदलें, और यकीन है कि तरल पदार्थ शेल्फ के नीचे 5-10 मिमी है बनाते हैं.
- धारा 1 के रूप में स्वच्छ आईटीओ लेपित स्लाइड. प्रवाहकीय है जो पक्ष निर्धारित करते हैं, और नमूना नाम के साथ गैर प्रवाहकीय पक्ष लेबल करने मल्टीमीटर का उपयोग करें.
- हल्के तेल एक या कई छेद के साथ सिलिकॉन (खासियत ग्रेड छठी) गैसकेट (एस) के दोनों ओर.
- बेंच पर स्लाइड प्रवाहकीय ऊपर की ओर रखें, और electroformation तंत्र से कनेक्ट करने के लिए एक अंत में उजागर स्लाइड की कम से कम 5 मिमी होती है, यकीन है कि जो लिपिड लागू किया जाएगा करने के लिए प्रत्येक स्लाइड के लिए सिलिकॉन गैसकेट (ओं) लागू होते हैं. एक अच्छा मुहर सुनिश्चित करने के लिए गैसकेट चिकनी.
- ~ 1-2 मिलीग्राम / मिलीलीटर के लिए एक कम नमक isosmotic बफर में पुटिका तैयारी पतला. हम मानते हैं कि उच्च concentr खोजनेations गरीब परिणामों का उत्पादन.
- 1-10 μl बूँदें में स्लाइड को लिपिड लागू करें. छोटे बूंदों आम तौर पर बेहतर परिणाम.
- संतृप्त नमक समाधान ऊपर आंतरिक शेल्फ पर स्लाइड प्लेस और कसकर कंटेनर सील. ओ / एन से 3 घंटे के लिए आरटी पर छोड़ दो कंटेनर डिग्री सेल्सियस 4 में रखा जा सकता है, लेकिन कुछ नमक के लिए, आरएच तापमान, और कि ठंड पर दृढ़ता से निर्भर करता है कि नोट के संतुलन के समय में वृद्धि होगी.
- परिणामस्वरूप फिल्म के लिए यह एक मामूली इंद्रधनुष चमक हो सकता है, लेकिन किसी भी मामले में लगभग सूखा दिखाई देनी चाहिए. अत्यधिक आसमाटिक शुरू समाधान एक लिपिड फिल्म को पूरी तरह से सूखे के लिए असंभव हो सकता है, इस पर प्रतिकूल परिणामों को प्रभावित नहीं करेगा.
4. विशालकाय liposomes की Electroformation
- विशेष रूप से लिपिड फिल्मों, निर्जलित liposomes के गठन से उन लोगों को आसानी से उखाड़ फेंकना कर रहे हैं. ध्यान हाइड्रेट प्रत्येक अच्छी तरह गैसकेट के किनारे पर एक 27 जी सिरिंज सुई रखने और धीरे बफर लगाने से. बफ़र कर सकते हैंपानी में शामिल हैं, ≤ 200 मिमी sucrose, ≤ 1 एम sorbitol और ≤ 5 मिमी HEPES. से अधिक 10 मिमी नमक समाधान वैकल्पिक electroformation वोल्टेज प्रोटोकॉल आवश्यकता हो सकती है. ~ 10% से अच्छी तरह से परिपूर्ण प्रत्येक गैसकेट.
- नोट: एक बार लिपिड हाइड्रेटेड हैं, लिपिड फिल्मों तुरंत delaminate के लिए शुरू के बाद से, बचे हुए चरणों के माध्यम से जल्दी से आगे बढ़ना. Electroformation तुरंत शुरू होता है अगर यील्ड और आकार को बड़ा किया जाता है.
- एक निर्बाध गति में, गैसकेट के शीर्ष पर, में एक दूसरे आईटीओ स्लाइड, प्रवाहकीय चेहरे लागू होते हैं. गैसकेट क्षेत्र के बाहर और पहली अधिकता विपरीत अधिकता की कम से कम 5 मिमी है करने के लिए सुनिश्चित करें. एक अच्छा मुहर सुनिश्चित करने के लिए धीरे दबाएं.
- इथेनॉल का उपयोग दो overhangs साफ और गैसकेट का सामना करना पड़ पक्ष अपने मल्टीमीटर के साथ प्रवाहकीय हैं कि सत्यापित.
- अगर वांछित कक्ष के आगे parafilm या प्रकाश तनाव वसंत क्लिप के साथ सुरक्षित किया जा सकता है.
- , "ईएमआई Gask एल्यूमीनियम या तांबा सलाखों प्राप्त करके एक वोल्टेज स्रोत के लिए electroformation चैम्बर कनेक्टदो स्लाइड्स की प्रवाहकीय सतहों एट फोम ", या प्रवाहकीय चिपकने वाला टेप. हम ईएमआई गैसकेट फोम का उपयोग करें. एक जिग और दबाना के लिए योजनाओं चित्रा 5 में दिखाया जाता है.
- कोई बिजली के संपर्क के बीच कम, और संपर्कों मल्टीमीटर का उपयोग कर, आईटीओ सतहों को ठीक से कनेक्ट है कि वहाँ है कि सत्यापित करें.
- डिग्री सेल्सियस न्यूनतम 10 डिग्री सेल्सियस 42 डिग्री सेल्सियस की श्रृंखला पिघलने तापमान ऊपर 52 के लिए गर्मी, DPPC के लिए उदाहरण के लिए, कक्ष 10 डिग्री सेल्सियस लिपिड से किसी का उच्चतम तापमान के पिघलने से ऊपर वर्तमान गर्मी
- कम नमक बफ़र्स के लिए, 60-90 मिनट के लिए एक 10 हर्ट्ज साइन लहर, दो आईटीओ लेपित सतहों के बीच प्रत्येक मिलीमीटर अंतराल के लिए ~ 0.7 वी आरएमएस, लागू होते हैं. उच्च नमक बफ़र्स के लिए, अन्य वोल्टेज प्रोटोकॉल (संदर्भ देखें) इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
5. इमेजिंग और निवारण
- छवि Rhodamine या टेक्सास लाल रंगों के लिए एक फिल्टर क्यूब से लैस एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग liposome. liposome, गोलाकार होना चाहिएमुख्य रूप से आँख से unilamellar, और इस तरह के liposome फांसी "स्ट्रिंग्स" के रूप में दोषों से मुक्त.
- Liposomes के बहुत छोटे हैं, तो कम लिपिड का उपयोग करें.
- कई दोषों या कुछ liposomes हैं, तो इस जेल चरण लिपिड के कारण हो सकता है. Electroformation तापमान बढ़ाने पर विचार करें.
- कुछ या कोई विशाल liposomes निर्जलित छोटे liposomes से बिल्कुल भी गठन किया है, liposome बफर के आसमाटिक शक्ति को कम करने, या electroformation बफर के आसमाटिक शक्ति में वृद्धि. केंद्रित बीचवाला बफर समाधान में बफर का एक दबाव जमा लिपिड फिल्म की delamination पैदा कर सकता है.
- पुटिका पैदावार, गुणवत्ता, या आकार गरीब है, और आप electroformation या liposome बफ़र्स में लवण या पीएच बफ़र्स शामिल हैं, वैकल्पिक electroformation वोल्टेज प्रोटोकॉल पर विचार करें. उदाहरण के लिए, पोट, एट अल. 11,, 90 मिनट के लिए पकड़े, 50-1,300 Vpp / मी पर 30 मिनट से वोल्टेज की परवरिश, एक 500 हर्ट्ज sinewave का उपयोग कर एक तीन कदम प्रोटोकॉल की सिफारिशएन 30-60 मिनट से अधिक 50 हर्ट्ज आवृत्ति कम. प्लेटिनम या टाइटेनियम इलेक्ट्रोड इस मामले में जरूरत हो सकती है, लेकिन यह काफी हद तक प्रोटोकॉल को बदल नहीं जाएगा.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
हमारे उदाहरण में, हम लगभग 55 मोल% POPC (1 palmitoyl-2-oleoyl-एस.एन. ग्लिसरो-phosphocholine), 15 मोल% चबूतरे (1 palmitoyl-2-oleoyl-एस.एन. ग्लिसरो-phosphoserine का एक मिश्रण से liposomes तैयार , 30 मोल% कोलेस्ट्रॉल, और 0.1 मोल% टेक्सास 1,2-dipalmitoyl-एस.एन. phosphoethanolamine (TXR-DPPE) लाल लेबल. इस रचना 18 पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि लिपिड के लगभग प्रतिनिधि के रूप में चुना गया था. हम 15 मोल% चार्ज ध्यान दें कि लिपिड (यहाँ चबूतरे) (जैसे Walde एट अल. 4) electroformation में इस्तेमाल किया जा सकता है की सीमा के निकट है.
Hydrolysis और peroxidation द्वारा लिपिड टूटने कई लिपिड मिश्रण और कई संवेदनशील प्रयोगों (चर्चा देखने के लिए) के लिए एक विशेष रूप से महत्वपूर्ण मुद्दा है. अकेले स्पष्टता के लिए, हम वीडियो प्रस्तुति में अक्रिय गैस वायुमंडल का उपयोग नहीं करते. नीचे दिए गए आंकड़े से स्पष्ट है, यह काफ़ी या liposomes की गुणवत्ता को प्रभावित है, लेकिन संवेदनशील पढ़ाई के लिए नहीं हैअत्यधिक असंतृप्त वसा पदार्थ का उपयोग करते समय यह लिपिड टूटने को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है.
Electroformation में बड़ी बाधा सूखे महत्वपूर्ण है जब लिपिड फिल्म की तरह दिखना चाहिए, यह जानकर ईण्डीयुम टिन ऑक्साइड (आईटीओ) सब्सट्रेट पर एक अच्छा लिपिड फिल्म बनाने के लिए है के बाद से. हालांकि, electroformation विफल रहता है, यह अक्सर कोई सराहनीय विशाल liposome उत्पादन में जिसके परिणामस्वरूप, तो पूरी तरह से करता है. अक्सर, पर्याप्त कतरे मनाया जाएगा, यह आमतौर पर बहुत ज्यादा लिपिड इस्तेमाल किया गया है कि इंगित करता है. हमारे आंकड़े एक सफलता पर देखने की उम्मीद है क्या दिखा.
चित्रा 2 क्लोरोफॉर्म के बाहर जमा लिपिड से electroformed liposomes की दो अलग पैच से पता चलता है. बाएं पैनल में, निकट तीर 2 और 3 ने संकेत दिया पैच की जांच. तीर 2 खराब अलग पहचाना liposomes साथ एक पैच इंगित करता है, कोई liposomes के तीर 3 से संकेत क्षेत्र में ध्यान में लाया जा सकता है. साथ में, इन निष्कर्षों को एक आम तौर पर गरीब का संकेतबहुत ज्यादा लिपिड वहाँ जा रहा है की वजह से शायद तैयारी, इस क्षेत्र में जमा किया. सही पैनल में, इस तरह के "फजी" क्षेत्रों में एक आम तौर पर बेहतर तैयारी का संकेत है, कम आम हैं. हम इसे पूरी तरह से इस तरह की खामियों को खत्म करने के लिए दुर्लभ है कि लगता है.
चित्रा 3 सफलतापूर्वक लिपिड से electroformed liposomes, दो आवर्धन पर, छोटे liposomes की निर्जलीकरण द्वारा जमा टेक्सास लाल epifluorescence के उपयोग imaged से पता चलता है. Liposomes विरल हैं, लेकिन कई अच्छे नमूने हैं. आकार बदलता है, क्योंकि कई ध्यान से बाहर हैं. तीर 40x बढ़ाई छवि में दिखाई देते हैं, जिनमें से दो ~ 5-20 माइक्रोन से आकार में लेकर तीन अच्छी गुणवत्ता liposomes संकेत मिलता है. किनारे पर स्पष्ट "अंगूठी" नोट: यह एक unilamellar या लगभग unilamellar liposome इंगित करता है. लिपिड के कुछ धब्बे लिपिड ध्वस्त हो या कभी नहीं बनाई है दिखाई देते हैं, यह एक अच्छी गुणवत्ता का परिणाम है.
अंत में, इस प्रोटोकॉल विकसित करने और प्रकाशित करने में हमारा उद्देश्यपारंपरिक पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए उपयुक्त हैं बरकरार, कार्यात्मक स्तनधारी आयन चैनल के साथ GUVs को तैयार है. चित्रा 4 में हम इस प्रोटोकॉल का उपयोग का गठन GUVs से excised लिपिड झिल्ली पैच में दर्ज capsaicin के सक्रिय TRPV1 आयनिक धाराओं प्रदर्शित करता है. वर्तमान दयाता लाल द्वारा अवरुद्ध किया जा सकता है, और capsaicin के वाहन (0.1% इथेनॉल, 138 मिमी NaCl, 3 मिमी HEPES पीएच 7.4) अकेले से सक्रिय नहीं है. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोगों के लिए proteoliposomes की तैयारी में अब तक मौजूद प्रोटोकॉल के दायरे से बाहर है, लेकिन एक प्रस्तुत लेख का विषय है.
| नमक | Molality @ 20 डिग्री सेल्सियस और संतृप्ति | % आरएच @ 10 डिग्री सेल्सियस | % आरएच @ 20 डिग्री सेल्सियस | % आरएच @ 30 डिग्री सेल्सियस |
| मैग्नेशियम क्लोराइड Hexahydrate | 5.8 | 33 | 33 32 | |
| पोटेशियम कार्बोनेट dihydrate | 8.0 | 47 | 44 | 42 |
| सोडियम ब्रोमाइड | 4.6 | 58 | 57 | 57 |
| Cupric क्लोराइड | 5.6 | 68 | 68 | 67 |
| सोडियम क्लोराइड | 6.13 | 75 | 75 | 75 |
| पोटेशियम क्लोराइड | 4.61 | 87 | 86 | 84 |
तालिका 1. कई सामान्य नमक के सापेक्ष आर्द्रता (% आरएच) ग्रीनस्पैन 19 और रॉकलैंड 20 से सापेक्ष आर्द्रता डेटा;. अंतर्राष्ट्रीय क्रिटिकल टेबल्स 21 से संतृप्ति डेटा.
चित्रा 1. छोटे liposomes से विशाल liposome electroformation के योजनाबद्ध. (ऊपर बाएं) लघु liposomes छोटी बूंदों की एक सरणी में जमा कर रहे हैं, <5 μl. (शीर्ष केंद्र) liposomes के एक संतृप्त नमक समाधान ऊपर एक मोहरबंद कंटेनर में उन्हें रखने के द्वारा नियंत्रित सापेक्ष आर्द्रता के तहत निर्जलित हैं. एक आर्द्रतामापी वैकल्पिक है. लिपिड का एक चिपचिपा फिल्म करने के लिए (ऊपर दाएं) एक बार निर्जलित और (संभवतः) ऐसे sorbitol रूप osmoticant, लिपिड (प्रोटोकॉल अनुभाग 5 देखें) एक hyperosmotic बफर में rehydrated कर रहे हैं. (निचले बाएं) electroformation चैम्बर शीर्ष पर एक दूसरे आईटीओ स्लाइड के साथ बंद है. (लोअर सही) अंत में, चैम्बर लिपिड श्रृंखला पिघलने तापमान ऊपर गर्म है, और दो आईटीओ स्लाइड भर में एक oscillating बिजली के क्षेत्र प्रदान करने के लिए एक संकेत स्रोत से जुड़ा है.
चित्रा 3. Electroformed विशाल liposomes निर्जलीकरण जमा लिपिड. (बाएं) 10x बढ़ाई से गठन, कई liposomes दिखाई दे रहे हैं. तीन liposomes चिह्नित कर रहे हैं. उसी के साथ 40x बढ़ाई छोड़ दिया पर के रूप में (दाएं) एक ही दृश्य,,liposomes (2 और 3) लेबल. इन liposomes की संख्या आम तौर पर विलायक जमा लिपिड से electroforming जब की तुलना में काफी छोटा होता है, लेकिन कई उद्देश्यों के लिए पूरी तरह से पर्याप्त है. एक क्रोमा 41004 टेक्सास लाल फिल्टर क्यूब और स्टैनफोर्ड फोटोनिक्स XR/MEGA-10 S30 तेज सीसीडी कैमरा से लैस एक औंधा epifluorescence खुर्दबीन का उपयोग imaged. 
4 चित्रा. एक guv से excised एक झिल्ली पैच में दर्ज मौजूदा capsaicin सक्रिय TRPV1 इस प्रोटोकॉल का उपयोग का गठन. ए रिसाव वर्तमान capsaicin जोड़ा गया है पहले एक 500 MΩ प्रतिरोध सील संकेत दिया. बी saturating capsaicin के (> 20 माइक्रोन, 0.1% इथेनॉल में) सक्रिय हो जाता है एक बड़े TRPV1 वर्तमान;. वर्तमान दयाता लाल द्वारा अवरुद्ध है, और (नहीं दिखाया डेटा) अकेले (बफर में 0.1% इथेनॉल) वाहन से सक्रिय नहीं है सी. मौजूदा रिटर्नcapsaicin के पैच के बाहर धोया जाता है के रूप में आधारभूत पास करने के लिए. 
चित्रा 5. Electroformation चैम्बर के लिए योजनाएं. शामिल पूर्ण विधानसभा दिखा रहा है, एक सिंहावलोकन है, और ऊपर और नीचे प्लास्टिक के टुकड़े के लिए schematics dimensioned. ऐक्रेलिक या एक और आसानी से मशीनीकृत स्पष्ट प्लास्टिक का प्रयोग करें. पतली Kapton फिल्म हीटर तापमान नियंत्रक (विशिष्ट अभिकर्मकों और उपकरणों की तालिका देखें) से जुड़ा होना चाहिए, और ईएमआई गैसकेट फोम साइन लहर संकेत दो आईटीओ लेपित स्लाइड भर में लागू किया जाता है, जिससे कि समारोह जनरेटर से जोड़ा जाना चाहिए. एक छेद एक तापमान जांच के लिए प्रदान की जाती है. Flathead 10-32 शिकंजा नीचे टुकड़ा में Countersunk छेद में रखा, और ऊपरी टुकड़ा के माध्यम से पारित कर रहे हैं. 10-32 पागल विधानसभा सुरक्षित करने के लिए उपयोग किया जाता है. जब पूरी तरह से के रूप मेंsembled, ऊपर और नीचे प्लास्टिक के टुकड़े दो पक्षों (समानांतर ईएमआई गैसकेट को. पक्षों) पर एक दूसरे से भरा होना चाहिए बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
विशाल liposomes की Electroformation विविध लिपिड, तैयारी, और buffers के साथ संगत एक लचीला तकनीक में विकसित किया है. लिपिड बयान प्रक्रिया की सावधानी से नियंत्रण सफलता के लिए सबसे महत्वपूर्ण है. हम छोटे liposome तैयारी एक सरल प्रक्रिया से लिपिड नियंत्रित बयान बनाने के लिए सरल उपकरण प्रस्तुत किया है. सापेक्ष आर्द्रता प्रारंभिक liposomes की उचित निर्जलीकरण के लिए महत्वपूर्ण है, और अधिकतम मूल्य liposome निलंबन में विलेय की प्रारंभिक एकाग्रता के साथ अलग अलग होंगे. कम सापेक्ष आर्द्रता एक पर्याप्त स्तर पर अधिक ध्यान केंद्रित नमूने निर्जलीकरण के लिए आवश्यक है.
electroformation के लिए इस्तेमाल किया सटीक हाइड्रेशन प्रोटोकॉल और बिजली के क्षेत्र में चर्चा 1,4,7,10,11,22 का एक मुद्दा बना हुआ है. सरल प्रोटोकॉल उच्च नमक सांद्रता का आरोप लगाया लिपिड, या उच्च पिघल की उच्च सांद्रता की उपस्थिति में liposome electroformation प्रयास करने से पहले पहले महारत हासिल किया जाना चाहिएतापमान लिपिड आईएनजी. प्रारंभिक सूजन, विकास, और टुकड़ी: उन कौशल में महारत हासिल कर रहे हैं, और अधिक उन्नत प्रोटोकॉल आम तौर पर तीन भागों में electroformation प्रक्रिया विभाजित करते हैं. प्रारंभिक सूजन धीरे लागू बिजली क्षेत्र 11 में वृद्धि से इष्ट किया जा रहा है. निश्चित क्षेत्र शक्ति पर एक दूसरे, वैकल्पिक चरण liposomes की अंतिम आकार को नियंत्रित कर सकते हैं. अंत में, दोलन क्षेत्र की आवृत्ति कम इतो सतह से liposomes अलग करने के लिए मदद मिल सकती है. उच्च आवृत्तियों शारीरिक नमक स्थितियों 11 में liposomes electroform की जरूरत है, लेकिन liposomes के क्षेत्र आवृत्तियों और आयाम 10 की एक अत्यंत व्यापक रेंज पर गठित किया जा सकता है.
विशाल लाइपोसोम एक हाइपो आसमाटिक बफर 7 के साथ निर्जलित liposomes की पुनर्जलीकरण पर अनायास बनेगी अवलोकन है कि सफलता के लिए कई चाबियाँ इंगित करता है. सबसे पहले, liposome सूजन प्रक्रिया इतनी है कि electroformation के लिए, कुछ, तुरंत शुरू होता हैसमूह भी लिपिड फिल्म 10 rehydrating पहले एसी बिजली के क्षेत्र लागू करने के लिए यह उपयोगी पाया है. दूसरा, यह द्रव का प्रवाह लिपोसोमल सूजन प्रक्रिया है कि ड्राइव की संभावना है, और कि electroformation कम से कम क्योंकि विद्युत osmotically संचालित प्रवाह के हिस्से में होता है. यह स्थानों electroformation 10 में इस्तेमाल किया जा सकता है कि उपयोगी आवृत्ति और आयाम सीमा पर सीमा.
पिछले कई वर्षों में चर्चा का एक प्रमुख बिंदु लिपिड hydrolysis और peroxidation 23,24 के लिए संभावित कर दिया गया है. किसी भी प्रकार के लिपिड गिरावट के खिलाफ पहले रक्षा guv तैयारी में इस्तेमाल सामग्री से ऑक्सीजन को दूर करने के लिए है: peroxidation आणविक ऑक्सीजन 23 पर निर्भर करता है, क्योंकि यह काफी प्रक्रिया धीमी गति से होना चाहिए. अक्रिय गैस के साथ निर्वात और sparging का एक संयोजन संभव 15-17 जितना ऑक्सीजन दूर करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. Sonication और प्रकाश निर्वात अप्रभावी कर रहे हैं. हम ध् के लिए एक ऑक्सीजन परीक्षण किट (Chemetrics K7501) का उपयोग करेंहम संभव के रूप में अच्छी तरह के रूप में ऑक्सीजन को हटा दिया है कि erify. हाइड्रोलिसिस सांघातिक अधिक है, लेकिन तटस्थ पीएच 25, बनाए रखने के द्वारा और electroformation 24 में इस्तेमाल किया वोल्टेज को कम से कम है. कुछ लेखकों आईटीओ की जगह में टाइटेनियम इलेक्ट्रोड का उपयोग 23,24,26,27 स्लाइड समर्थन करते हैं. यह अतीत में liposome प्रयोगों 28,29 के साथ हस्तक्षेप करने के लिए जाना जाता रहा है के बाद से हम, टाइटेनियम (या किसी भी धातु) के साथ हमारे नमूने दूषित करने की संभावना से बचने के लिए पसंद करते हैं, लेकिन यह कुछ peroxidation या हाइड्रोलिसिस प्रभाव को रोकने के लिए मदद कर सकता है. यह उच्च तापमान के लिए लंबे समय तक निवेश लिपिड टूटने 30 accelerates कि कहे बिना जाता है. अंत में, पतली परत क्रोमैटोग्राफी 24,31, वर्णमिति assays के 23 और अन्य तरीकों 31 लिपिड गिरावट यों के लिए मौजूद हैं.
ऐसा ही एक मुद्दा विशेष रूप से पार्श्व चरण जुदाई 30,32 की पढ़ाई के लिए, छवि GUVs के लिए इस्तेमाल किया फ्लोरोसेंट लिपिड रंगों से संबंधित है 30,33 से चुना जाना चाहिए, और न्यूनतम एकाग्रता में प्रयोग किया जाता है.
हम इतो इलेक्ट्रोड स्लाइड पुन: उपयोग किया जा सकता है पर कोई आम सहमति की जानकारी नहीं है. कुछ नहीं करते हैं, जबकि कई समूहों, उनके इतो स्लाइड्स का पुन: उपयोग करना. हाल ही में काम स्लाइड समय पर नीचा दिखाना है कि इंगित करता है, लेकिन उच्च प्रदर्शन 34 को हासिल करने के लिए annealed जा सकता है, इस गिरावट zwitterionic या ऋणात्मक लिपिड सहित लिपिड मिश्रण के लिए केवल एक छोटा सा प्रभाव नहीं पड़ा, लेकिन cationic लिपिड युक्त मिश्रण के लिए महत्वपूर्ण था. हम annealing बिना हमारे स्लाइड्स का पुन: उपयोग.
विशाल liposomes, सैद्धांतिक समझ और तकनीक के साथ व्यावहारिक अनुभव electroform के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल में महान परिवर्तनशीलता हालांकि वहाँ लगातार सुधार आ रहा है. पहले से ही liposomes आरोप लगाया लिपिड, या उच्च नमक बफ़र्स में बड़ी मात्रा के साथ गठित किया जा सकता है. कुंजी है जो, इलेक्ट्रोड सतह पर लिपिड के कुशल जमाव रहता हैज हमारे प्रोटोकॉल का मूल है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.
Acknowledgments
हम electroformation तंत्र के निर्माण के लिए ब्रायन Venema और एरिक Martinson धन्यवाद. इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान के जनरल मेडिकल साइंसेज के राष्ट्रीय संस्थान से अनुदान (SEG तक R01GM100718) और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय नेत्र संस्थान (SEG तक R01EY017564) द्वारा वित्त पोषित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digital Multimeter | Agilent Technologies, www.agilent.com | U1232A or similar | Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test. |
| Fluke | 117 or 177 | Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test. | |
| Function Generator | Agilent Technologies, www.agilent.com | 33210A or similar | Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 Ω load |
| ITO coated glass slides | Delta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.com | CB-90IN-S107 or similar | Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm |
| Temperature controller | Omega Engineering Stamford, CT www.omega.com | CNi3233 or similar | |
| Hygrometer | Extech, Nashua, NH, www.extech.com | 445815 | |
| Silicone rubber sheet | McMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com | 87315K64 | Use USP Grade VI silicone for its high purity |
| EMI gasket | Laird Technologies www.lairdtech.com | 4202-PA-51H-01800 or similar | Distributed by Mouser www.mouser.com |
| TxR-DHPE | Life Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.com | T1395MP | Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable. |
| POPC | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL www.avantilipids.com | 850457P or 850457C | Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C) |
| POPS | Avanti Polar Lipids | 840034P/C | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 |
References
- Dimova, R., Aranda, S., Bezlyepkina, N., Nikolov, V., Riske, K. A., Lipowsky, R. A practical guide to giant vesicles. Probing the membrane nanoregime via optical microscopy. Journal of Physics-Condensed Matter. 18 (28), S1151-S1176 (2006).
- Giant Vesicles. Luisi, P. L., Walde, P. , John Wiley & Sons Ltd. (2000).
- Riquelme, G., Lopez, E., Garcia-Segura, L. M., Ferragut, J. A., Gonzalez-Ros, J. M. Giant liposomes: a model system in which to obtain patch-clamp recordings of ionic channels. Biochemistry. 29 (51), 11215-11222 (1990).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: preparations and applications. Chembiochem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Aimon, S., Manzi, J., Schmidt, D., Poveda Larrosa, J. A., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. Functional reconstitution of a voltage-gated potassium channel in giant unilamellar vesicles. PLoS. One. 6 (10), e25529 (2011).
- Girard, P., Pecreaux, J., Lenoir, G., Falson, P., Rigaud, J. L., Bassereau, P. A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles. Biophys. J. 87 (1), 419-429 (2004).
- Manley, S., Gordon, V. D. Making giant unilamellar vesicles via hydration of a lipid film. Curr. Protoc. Cell. Biol. 24, 1-13 (2008).
- Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy. Colloids. Surf. B. Biointerfaces. 42 (2), 125-130 (2005).
- Angelova, M. I., Soleau, S., Meleard, P., Faucon, J. F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Kinetics and applications. Progressin Colloid & Polymer Science. 89, 127-131 (1992).
- Politano, T. J., Froude, V. E., Jing, B., Zhu, Y. AC-electric field dependent electroformation of giant lipid vesicles. Colloids. Surf. B. Biointerfaces. 79 (1), 75-82 (2010).
- Pott, T., Bouvrais, H., Méléard, P. Giant unilamellar vesicle formation under physiologically relevant conditions. Chem. Phys. Lip. 154 (2), 115-119 (2008).
- Sens, P., Isambert, H. Undulation Instability of Lipid Membranes under an Electric Field. Phys. Rev. Lett. 88 (12), (2002).
- Green, N. G., Ramos, A., González, A., Morgan, H., Castellanos, A. Fluid flow induced by nonuniform ac electric fields in electrolytes on microelectrodes. I. Experimental measurements. Phys. Rev. E. 61 (4), 4011-4018 (2000).
- Baykal-Caglar, E., Hassan-Zadeh, E., Saremi, B., Huang, J. Preparation of giant unilamellar vesicles from damp lipid film for better lipid compositional uniformity. Biochim. Biophys. Acta. 1818 (11), 2598-2604 (2012).
- Bakalyar, S. R., Bradley, M. P. T., Honganen, R. The role of dissolved gases in high -performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 158 (0), 277-293 (1978).
- Brown, J. N., Hewins, M., Van Der Linden, J. H. M., Lynch, R. J. Solvent degassing and other factors affecting liquid chromatographic detector stability. J. Chromatogr. A. 204, 115-122 (1981).
- Dolan, J. W. Mobile Phase Degassing-Why, When, and How. LC-GC. 17 (10), 909-912 (1999).
- Cheng, H., Jiang, X., Han, X. Alterations in lipid homeostasis of mouse dorsal root ganglia induced by apolipoprotein E deficiency: a shotgun lipidomics study. J. Neurochem. 101 (1), 57-76 (2007).
- Greenspan, L. Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions. J. Res. Natl. Bur. Stand. 81 (1), 89-96 (1977).
- Rockland, L. B. Saturated Salt Solutions for Static Control of Relative Humidity between 5 ° and 40 °C. Anal. Chem. 32 (10), 1375-1376 (1960).
- Washburn, E. W. International Critical Tables of Numerical Data, Physics, Chemistry and Technology (1st Electronic Edition). , 216-249 (2003).
- Estes, D. J., Mayer, M. Giant liposomes in physiological buffer using electroformation in a flow chamber. Biochim. Biophys. Acta. 1712 (2), 152-160 (2005).
- Ayuyan, A. G., Cohen, F. S. Lipid Peroxides Promote Large Rafts: Effects of Excitation of Probes in Fluorescence Microscopy and Electrochemical Reactions during Vesicle Formation. Biophys. J. 91 (6), 2172-2183 (2006).
- Morales-Penningston, N. F., Wu, J., et al. GUV preparation and imaging: minimizing artifacts. Biochim. Biophys. Acta. 1798 (7), 1324-1332 (2010).
- Grit, M., de Smidt, J. H., Struijke, A., Crommelin, D. J. Hydrolysis of phosphatidylcholine in aqueous liposome dispersions. Int. J. Pharm. 50 (1), 1-6 (1989).
- Zhou, Y., Berry, C. K., Storer, P. A., Raphael, R. M. Peroxidation of polyunsaturated phosphatidyl-choline lipids during electroformation. Biomaterials. 28 (6), 1298-1306 (2007).
- Farkas, E. R., Webb, W. W. Multiphoton polarization imaging of steady-state molecular order in ternary lipid vesicles for the purpose of lipid phase assignment. J. Phys. Chem. B. 114 (47), 15512-15522 (2010).
- Hauser, H. O. The effect of ultrasonic irradiation on the chemical structure of egg lecithin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 45 (4), 1049-1055 (1971).
- Hauser, H. Phospholipid vesicles. Phospholipids Handbook. Cevc, G. , Marcel Dekker, Inc. New York, New York. (1993).
- Veatch, S. L. Electro-formation and fluorescence microscopy of giant vesicles with coexisting liquid phases. Meth. Mol. Biol. 398, 59-72 (2007).
- Kim, R. S., LaBella, F. S. Comparison of analytical methods for monitoring autoxidation profiles of authentic lipids. J. Lipid. Res. 28 (9), 1110-1117 (1987).
- Veatch, S. L., Leung, S. S. W., Hancock, R. E. W., Thewalt, J. L. Fluorescent probes alter miscibility phase boundaries in ternary vesicles. J. Phys. Chem. B. 111 (3), 502-504 (2007).
- Juhasz, J., Davis, J. H., Sharom, F. J. Fluorescent probe partitioning in GUVs of binary phospholipid mixtures: implications for interpreting phase behavior. Biochim. Biophys. Acta. 1818 (1), 19-26 (2012).
- Herold, C., Chwastek, G., Schwille, P., Petrov, E. P. Efficient electroformation of supergiant unilamellar vesicles containing cationic lipids on ITO-coated electrodes. Langmuir. 28 (13), 5518-5521 (2012).
